La Sindrome di Marfan: Variabilità Genetica e Diagnosi Molle, Appunti di Fisiopatologia

Scarica La Sindrome di Marfan: Variabilità Genetica e Diagnosi Molle e più Appunti in PDF di Fisiopatologia solo su Docsity! PATOLOGIA E FISIOPATOLOGIA GENERALE E MOLECOLARE LEZIONE 3 06/10/20 MALATTIE ASSOCIATE A DIFETTI DELLE PROTEINE STRUTTURALI SINDROME DI MARFAN Una patologia che ha a che fare con una proteina strutturale della matrice extracellulare è la SINDROME DI MARFAN che è una patologia genetica che colpisce il tessuto connettivo. Esso è presente in tutti gli organi e gli apparati ma la patologia colpisce alcuni tipi di tessuto connettivo che hanno particolari caratteristiche strutturali e che si trovano localizzati in alcuni organi ed apparati. La patologia si presenta come autosomica dominante quindi significa che i soggetti malati hanno solo uno dei due alleli con l'alterazione e la malattia risulta abbastanza frequente con un'incidenza annua di 1 su 5.000 - 10.000 abitanti misurata in diverse etnie e paesi e siccome molti di questi soggetti presentano una buona sopravvivenza, la sopravvivenza per questo tipo di patologia è abbastanza alta. La maggior parte delle casistiche risultano sottostimate perché esistono delle varianti alleliche che causano varianti della patologia che sono lievi da un punto di vista dell'impatto sul tessuto e quindi spesso o non vengono diagnosticate o non viene verificato da un punto di vista molecolare l'effettiva diagnosi e quindi non rientrano nelle casistiche. Oltre ad avere moltissime varianti alleliche che fanno si che la sindrome sia estremamente variegata come sintomatologia, c'è anche una variabilità dell'espressione dell’allele patologico da soggetto a soggetto ovvero la stessa mutazione da padre in figlio ad esempio o da madre in figlio può avere una sintomatologia più o meno importante e questo probabilmente per l'interazione dei fenomeni prodotti dall’alterazione strutturale della proteina con altre molecole che sono codificate da altri geni che quindi possono essere diversi tra due soggetti che sono portatori della stessa mutazione del gene che da la sindrome di Marfan ma la cui alterazione interagisce diversamente con varianti alleliche di altre molecole che si trovano nella matrice del tessuto connettivo oppure i livelli di espressione dell’allele sano possono essere regolati diversamente tra i vari soggetti e per cui siccome questa è una malattia dominante e il livello di espressione dell’allele patologico determina la patologia, l’attività dell’allele sano in alcuni tipi di alterazioni può determinare una differente sintomatologia. ( Nota: esistono varianti alleliche che producono proteine anomale ed esistono varianti alleliche che non producono proteine. La variante che non produce proteina sarà dominante con un effetto da aploinsufficienza cioè è insufficiente la quantità e sarà tanto più grave quanto più alto o più basso è il livello dell’allele sano. Quando invece l’allele produce una proteina anomala questa può interagire con la variante sana, alterare l’organizzazione e la struttura e quindi può avere un impatto diverso e in tal caso dipenderà dai livelli di espressione dell’allele patologico l'impatto sulla patologia.). La proteina coinvolta nella sindrome di Marfan è la fibrillina che è una proteina componente essenziale della matrice extracellulare e si trova come componente delle fibre elastiche quindi il tessuto connettivo che viene maggiormente coinvolto è quel tessuto connettivo che ha una componente elastica importante. Maggiore sarà la componente elastica di quel tessuto maggiore sarà l'impatto dell’allele mutato su quella funzione. Il gene che codifica per la fibrillina è situato sul cromosoma 15 sul braccio lungo (q) nella banda 21.1. Il gene FBN1 della fibrillina codifica per una glicoproteina molto grande che nel tessuto connettivo aiuta non ad estendere il tessuto elastico ma a riacquisire la forma originaria perché appunto per elasticità intendiamo la capacità di allungarsi e di ritornare poi nella forma originaria. Quando la fibrillina risulta alterata il problema principale che si riscontra è che questi tessuti si distendono ma non ritornano alla forma originaria e questo crea una serie di problemi. Un altro punto importante è considerare il fatto che la patologia è causata da un numero enorme di mutazioni. Il numero di mutazioni individuate supera le 1000 e il database viene continuamente aggiornato, questo significa che diversamente dal caso della patologia analizzata precedentemente (l’acondroplasia), mentre in quest'ultima il codone mutato è uno solo e le sostituzioni nucleotidiche, quindi le mutazioni a livello del Dna, sono solo due che colpiscono la stessa base dello stesso codone è facile fare la diagnosi da un punto di vista tecnico in quanto sappiamo dove è la mutazione e se non la trovo sarà un’altra cosa. Nel caso della sindrome di Marfan io non posso andare a cercare la mutazione in quanto ho a che fare con un numero enorme di mutazioni e si comincia a capire il perché nelle forme meno gravi che non richiedono un intervento clinico importante la conferma diagnostica, che è complicata, spesso non viene effettuata e quindi la casistica che indica la prevalenza e l'incidenza della malattia in realtà è viziata da questo problema. In letteratura si trovano i più strani numeri in base a quali popolazioni sono state analizzate, in che modo è stata fatta la diagnosi e quali gruppi di soggetti sono stati analizzati. Per quanto riguarda le caratteristiche fenotipiche dei soggetti affetti dalla sindrome di Marfan sicuramente questi sono soggetti sono estremamente alti, hanno un rapporto di lunghezza tra le braccia e il tronco del corpo sproporzionato cioè hanno le braccia e le gambe molto più lunghe del tronco. Quando la patologia è lieve questi soggetti possono essere ritrovati impegnati in attività come pallavolo o pallacanestro. Quando invece la patologia è grave nei soggetti non si riscontra unicamente altezza e lunghezza degli arti ma ritroviamo dolicocefalia ad esempio ovvero un cranio stretto e allungato e questo può essere ancora considerato un fenotipo che non ha implicazioni cliniche ma solo funzionali o estetiche a meno che la dolicocefalia non sia estrema e quindi la deformazione comporta problemi funzionali. Inoltre si riscontrano dita delle mani e dei piedi molto affusolate e il torace può presentare una deformazione, e questo è un aspetto della patologia che risulta caratteristico, ovvero il petto scavato. Questi soggetti presentano un'incavatura dello sterno oppure possono avere il petto carenato ovvero che spunta all’esterno con una deformazione del torace dovuta ad un'alterata ossificazione dello sterno perché le fibre elastiche in quel punto non hanno consentito una corretta ossificazione. La lassità dei legamenti è molto pronunciata perché le fibre elastiche si trovano nei legamenti delle articolazioni e questo significa che le articolazioni possono essere molto mobili come per esempio l’iperestensività del polso e delle falangi. Il polso si può portare per esempio verso l'avambraccio e il pollice può toccare l’ulna e il radio. Anche questa condizione entro determinati limiti non è una condizione grave quindi cominciamo a capire che molti di questi soggetti portatori di questi alleli possono non necessariamente chiedere una diagnosi molecolare di questa malattia. Se questa condizione risulta isolata insieme all'altezza e ad altre caratteristiche, i sintomi sono sufficientemente lievi da non creare una morbidità allo stato di malattia. Il problema è che in alcuni pazienti invece l'eccessiva lassità delle articolazioni può dare un piede piatto, può dare un mancato allineamento e mantenimento della colonna vertebrale perché i legamenti longitudinali posteriori e anteriori sono deboli, ci possono essere lussazioni frequenti delle articolazioni con apposizioni dei capi articolari fino al punto che i soggetti non possono portare oggetti pesanti, non possono salire le scale o non posso praticare attività sportive. E quindi si va verso varianti alleliche che possono generare una sintomatologia in tal caso di tipo ortopedico importante. | sintomi non si limitano solo alle capsule o ai legamenti articolari ma ci sono problemi in altri organi e tessuti. La fibrillina infatti si trova nei tessuti elastici dell’apparto cardiovascolare e infatti se consideriamo l'anatomia dei vasi sappiamo che la tonaca media di alcuni vasi come l’aorta o i vasi arteriosi del collo hanno una ridotta componente muscolare e un'importante componente elastica soprattutto l’aorta. Essa infatti funge da autoclave per mantenere la pressione del sangue perché quando il cuore spinge, l’aorta si dilata e questa dilatazione accumula energia potenziale sottoforma di deformazione elastica. Quando il cuore si trova in sistole, cioè non pompa, l’aorta si contrae cioè ritorna alla sua dimensione per l'elasticità e spinge il sangue in circolo, quindi la pressione massima è dovuta dal miocardio che butta fuori il sangue ma la pressione minima è dovuta all’elasticità dei vasi che continuano a mantenere il sangue in circolo anche quando il cuore non sta pompando. Se questo meccanismo viene meno o funziona male perché l’aorta si distende ma non ritorna alla sua forma originaria e man mano al passare del tempo questa dilatazione risulta sempre più accentuata si avrà un’aneurisma dell'aorta. L'aneurisma dell'aorta può portare a rottura dell'aorta stessa, può dare una grave emorragia addominale o toracica e portare a morte del paziente che semmai non presentava sintomi importanti se non qualche sintomo di occupazione toracica come per esempio tosse ma spesso se il paziente non si sottopone a controllo negli anni questo fenomeno può diventare evidente solo quando la dilatazione è molto difficile da curare chirurgicamente. La patologia quindi può restare asintomatica per molti anni. La rottura dell'aorta si avverte con improvviso dolore violento al torace che si irradia alla schiena e all'addome, simile all’infarto e il risultato è che anche l'intervento terapeutico può essere all’inizio non compreso e Test Method Mutation scanning / sequence analysis Complementary DNA sequence analysis Deletion / duplication Exonic and Uni analysis 3 whole-gene deletions Multi-gene Marfan syndrome/Loeys-Dietz syndromef/familial thoracic aortic aneurysms and dissections panel s Sequence variants 2 known Questa diapositiva ci dice che il metodo preferenziale per la diagnosi è quello di cercare le mutazioni o sequenziare il cDNA. Questo tipo di attività che è al momento ancora preferibile porta ad una chiusura di diagnosi tra il 70-90 % . Il mutation scanning è fondamentalmente una tecnica che cerca alterazioni strutturali dell'acido nucleico che differisca strutturalmente dal wild-type e dove è strutturalmente differente dal wild-type, si sequenzia quella regione. Il sequenziamento del cDNA è semplice in quanto il trascritto è piccolo mentre il gene può essere molto grande. Un altro metodo è quello dell'analisi di duplicazione e delezione infatti alcune patologie di questo tipo sono causate da delezioni che coinvolgono alcuni esoni o l'intero gene ma l'incidenza sulla casistica è bassa e quindi è difficile calcolare nei laboratori, che fanno questa diagnostica di routine, quale sia l'impatto di questo tipo di ricerca di mutazione sulla diagnostica generale però esistono delle varianti mutate di questo tipo. Gene FBNI 5 > 3°. encoded on minus strand of chromosome 15 from 48,938,045 to 48,700,503 VAN TVWWWANNWWWWWNNWNWWWNWNNNYYTNY N NVVWWhib (bu ‘Tie in-u liu tk-u \g-u th-u Il problema di questo gene è che è di 240 mila basi quindi sequenziare tutto il genoma significa sequenziare 240mila nucleotidi mentre sequenziare invece il CDNA è più semplice. Se invece vogliamo sequenziare 65 esoni dal genoma più 2 esoni che contengono il 5’ UTR e 1 esone che contiene il 3’ UTR significa amplificare 68 pezzi, sequenziare 68 pezzi e ottenere dell formazioni che non comprendono, come abbiamo visto nell’introduzione generale, tutte le alterazioni introniche. La scelta dipende dalla patologia infatti nel caso precedentemente analizzato dell'acondroplasia la scelta è facile in quanto la mutazione è una, è causata da due sostituzioni quindi tutte le tecniche che mi permettono di vedere solo e soltanto quelle alterazioni possono essere adoperate. Nella sindrome di Marfan ci sono 1000 mutazioni descritte e tante ancora altre non ancora descritte che capitano dappertutto e quindi ovviamente la tecnica migliore sarebbe quella di sequenziare tutti e 240mila nucleotidi e trovare le differenze. Ovviamente tra due soggetti su 240mila nucleotidi si possono trovare decine di differenze e bisogna stabilire quali sono le differenze patogenetiche, quindi che generano la malattia, e quali sono le varianti alleliche comuni della popolazione. Fino a che non avrò un database ricco di queste informazioni tutte le varianti alleliche disturberanno l’analisi perché ogni variante allelica di per se può essere patologica fino a prova contraria, quindi occorrono per ogni variante allelica degli studi di laboratorio che dimostrano che quella variante allelica con quella determinata sequenza specifica è o non è collegabile al fenotipo. Quindi bisogna far riferimento ad una banca dati dove si può trovare che quella delezione ad esempio o quella sostituzione è stata positivamente dimostrata come causa della malattia e posso trascurare o sottovalutare gli altri tipi di sostituzione ad esempio e se il soggetto presenta quel tipo di mutazione già dimostrata causa della malattia giungere alla diagnosi. Quindi ci sono dei database nei quali tutte le mutazioni note se vengono individuate nell’allele o in uno dei due alleli del soggetto che si sta analizzando possono essere positivamente associati alla malattia. Tutte le sostituzioni che non sono presenti nel database si può dire se sono buone o cattive soprattutto se il soggetto presenta solo quelle che non sono presenti nel database allora in tal caso ha i sintomi, ha delle alterazioni, l'alterazione non è presente nel database, sarà quella la causa della malattia o un altro tipo di alterazione? E quindi in questo caso non si può fare una diagnosi se non si ha alle spalle la ricerca. L'analisi del cDNA è abbastanza utilizzato e permette di analizzare le regioni codogeniche della fibrillina però bisogna tener presente che tutte le alterazioni che possono interferire con la maturazione o sulla stabilità dell'RNA non possono essere individuate. Esempio: ho un'alterazione in un introne che fa si che la maturazione del messaggero avvenga solo per il 10% quindi quel soggetto produrrà poco messaggero, poca proteina quindi quell'allele codifica per un messaggero di bassa quantità ma non di bassa qualità e non posso vederlo attraverso l’analisi del CONA. O peggio potremmo trovarci nella condizione in cui non viene generato il messaggero da quell’allele ma se vado ad estrarre |l’RNA e vado a retrotrascriverlo e sequenzio e trovo tutto normale potrà essere l’allele quello sano ma la malattia è dominante quindi nel sequenziamento del cDNA oltre a richiedere l'isolamento del tessuto o del fibroblasto che produce la fibrillina, c'è il limite che se si vede qualcosa presente nel database si chiude la diagnosi se non si vede nulla non si chiude la diagnosi perché non si sa se quello che non si vede in realtà c'è ma si trova in una zona del gene che non si sta sequenziando. La sequenza del DNA genomico ha due approcci, quello più abbordabile per i laboratori di analisi che è quello di utilizzare dei kit che amplificano gli esoni, si utilizzano primers a monte e a valle dell’esone, si amplifica e si sequenzia. Addirittura se ho delle informazioni che dicono che di 65 esoni 10 contengono l'80% delle mutazioni si possono sequenziare prima quei 10 esoni e questo è un fenomeno che avviene per alcune malattie ovvero per alcune malattie ci sono pochi esoni che contengono la maggior parte delle alterazioni quindi questo è un approccio valido ma non nel caso della fibrillina perché sono state trovate alterazioni in tutti e 65 gli esoni e bisognerebbe analizzarli tutti. Se sequenzio gli esoni posso perdere alcune alterazioni cioè posso perdere delle varianti alleliche in cui le alterazioni della sequenza ,quindi l'informazione alterata, non si trova nell’esone e non si trova nemmeno per esempio 10 o 20 basi prima o 10 o 20 basi dopo i siti di accettazione o donazione dello splicing. Quindi si iniziano a vedere delle mutazioni che non vedo attraverso l’analisi del (DNA perché possono cominciare a vedere per esempio quelle famose +14,-12,+15 ma per esempio non vedrò una +576 cioè un'alterazione che si trova 576 basi dopo il codone X all'interno di un introne perché non ho messo il primer davanti. Ci sono poi tecniche per duplicazione e delezione. Se l’allele patologico non ha sul genoma la sequenza di alcuni esoni se per esempio nell’allele patologico manca l’esone 8, la sequenza non mi dirà che manca l’esone 8 perché sequenzierò l'allele sano perciò il sequenziamento non mi permette di individuare le delezioni o le duplicazioni se per esempio l’esone 8 un allele lo presenta una volta e l’altro due volte ripetuto, con il sequenziamento io sequenzio solo l’'esone 8 normale, devo avere la fortuna di finire con il sequenziamento nella giunzione della regione deleta ma questo non è un fenomeno frequente. Quindi o si utilizzano per specifiche mutazioni degli oligonucleotidi che mi amplificano la regione deleta che ha delle caratteristiche specifiche e vado quindi ad individuarla oppure bisogna utilizzare un altro tipo di approccio ovvero ad esempio se io amplifico l'esone 8 e l'esone 9 e l'esone 8 si amplifica da uno dei due alleli e l’esone 9 si amplifica da tutti e due gli alleli se si va a fare una reazione quantitativa avrò un rapporto X tra esone 8 ed esone 9 che dipenderà dalla specificità dei primers, dall’efficienza dei primers ecc. Nei soggetti normali il rapporto sarà ad esempio X, nel soggetto con la delezione dell’esone 8 il rapporto sarà diverso perché la quantità di esone 8 in rapporto a quella dell'esone 9 sarà minore. Quindi dovrò avere sempre un amplificato dove avrò il deleto di conferma, il wild type di conferma e il probando, se il probando ha il rapporto tra le bande uguale al deleto o simile al deleto avrà la delezione, se il rapporto tra le bande è invece uguale o simile al wild type non avrà la delezione. La fibrillina è l’unico gene che causa la sindrome di Marfan classica, sindrome di Marfan di tipo 2 o varianti della sindrome di Marfan possono essere causate e determina il passo dell'elica che non è il passo dell’alfa elica) MT Markers of collagen synthesis 777] N-terminal C-terminal pro-peptide Mature collagen pro-peptide cleavage site L'assemblaggio delle tre catene avviene nella cellula e non può avvenire senza le regioni ammino e carbossi terminali della proteina. Dopo che è avvenuto l'assemblaggio le regioni carbossi e ammino terminali vanno eliminate. Quindi non solo la struttura del tropocollageno è determina dalla struttura della sequenza primaria, alterazioni nel gene che codifica la catena, non solo dalla densità delle idrossiproline e delle idrossilisine quindi alterazioni dei geni che codificano per gli enzimi che devono fare modifiche sulla lisina e sulla prolina ma il tropocollageno potrà essere esportato al di fuori della cellula soltanto se funzionano le carbossi e le ammino peptidasi. Quindi alterazioni genetiche dei geni che codificano per le carbossi e le ammino peptidasi possono dare problemi al collageno. Avrò quindi patologie del collageno che risiedono nei geni che codificano per le catene del collageno, patologie che risiedono nei geni che codificano per gli enzimi modificatori e patologie che risiedono nei geni che codificano per enzimi che tagliano le estremità del collageno. Gli enzimi che modificano il collageno utilizzano dei coenzimi quindi posso avere alterazione del collagene per motivi nutrizionali, alimentari perché i coenzimi sono deficitari per difetti alimentari, posso avere patologie degli enzimi perché i coenzimi possono essere deficitari perché la loro stessa sintesi è deficitaria per difetto dei geni che codificano per gli enzimi biosintetici dei coenzimi oppure ancora posso avere patologie del collagene perché siccome questi enzimi utilizzano dei metalli tipo ferro e rame, il metabolismo di questi metalli può essere alterato e posso avere alterazioni in geni che codificano per trasportatori plasmatici, trasportatori di membrana o altre molecole che sovraintendono al metabolismo di questi metalli. La patologia quindi della molecola collagene è un punto su cui convergono moltissime alterazioni di molti tipi. Una volta che il tropocollageno è stato tagliato all'estremità, viene secreto e nella matrice extracellulare polimerizza. Questa polimerizzazione per essere stabilizzata richiede la formazione di legami inter e intra molecolari per condensazione di base di Schiff tra i residui di idrossiprolina e di idrossilisina che legano con l’allolisina. & Questo fa si che si forma la struttura descritta al microscopio presentata in figura con un periodo di 64 nanometri che da è dato dalla disposizione sfalsata delle molecole di tropocollageno. La fibra è costituita dall’associazione di più fibrille e ogni fibrilla è costituita dall’associazione di molecole di più molecole di tropocollagene collegate tra di loro da legami covalenti. Se i legami covalenti tra le catene o tra le molecole di tropocollageno o tra le fibrille o ancora tra le fibre non si stabiliscono o se ne stabiliscono di meno del dovuto e quindi tutte queste molecole quando si distende il tessuto scivolano tra di loro e scivolando tra di loro il tessuto si sovradistende. Se invece i legami sono alla giusta densità, il tessuto si distende, la macromolecola (il collagene) resiste all'estensione e fa si che il tessuto resista. Nella diapositiva seguente vengono presentati 5 tipi di collageno ma in realtà ne esistono molti di più ma questi sono quelli più frequentemente coinvolti nelle patologie umane. Il collageno di tipo 1 si trova nella pelle, nei tendini, nell’osso e nel tessuto cicatriziale ed è costituito da tre catene due di tipo alfa 1 codificate dal gene Col 1 A1 e una di tipo alfa 2 codificata dal gene Col1 A2. Se quindi avrò un'alterazione del collageno di tipo 1 questa non solo può essere dovuta a tutti i meccanismi precedentemente descritti ma anche al fatto che si possono avere due geni differenti che partecipano differentemente alla struttura della proteina e quindi anche |’ alterazione della catena polipeptidica del collageno può avere la sua origine in geni differenti. Questo è un esempio di come malattie simili da un punto di vista sintomatologico possono essere causate dal convergere di diverse informazioni su vari cromosomi, su vari geni su un'unica molecola che è quella che disfunziona e che crea il sintomo. Il collageno di tipo 2 si trova nella cartilagine articolare e nel corpo vitreo dell'occhio ed è costituito da tre catene uguali codificate dal gene Col2 A1. Il tessuto di granulazione, la pelle e il muscolo contengono insieme al tipo 1 il collagene di tipo 3 che come il tipo 2 è costituito da tre catene uguali codificate dal gene Col3 A1. Il tessuto di granulazione si forma quando si sta formando una cicatrice, nella fase di guarigione in seguito ad un danno tissutale quindi patologie che coinvolgono il collagene di tipo 3 sono particolarmente interessanti nell’alterare la guarigione dei tessuti in seguito a traumi o a interventi chirurgici. Il collageno di tipo 4 che è un tipo di collageno non fibrillare come quello di tipo 5 è costituito da due catene differenti come il tipo 5, 2 alfa1 e 1 alfa2 codificate rispettivamente da Col4A1 e Col5A1 e Col4A2 e Col5A2. Il tipo 4 si ritrova nelle membrane basali e nel cristallino mentre il tipo 5 si trova insieme al tipo 1 e al tipo 3 in alcuni tessuti per esempio nel tessuto interstiziale insieme al tipo 1 e nel muscolo insieme al tipo 1 e il tipo 3. Questo significa che patologie di diversi tipi di collagene possono colpire tessuti diversi o lo stesso tessuto può essere interessato da patologie di collagene diversi perché coesistono nello stesso tessuto ma in alcuni casi il sintomo può essere diverso perché la funzione del collageno di tipo 1 e la funzione del collageno di tipo 5 nel tessuto interstiziale ad esempio è certamente diversa e quindi si può sfruttare in alcuni casi queste piccole differenze funzionali per ricordare le differenze dei sintomi.