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Scarica nucleo, DNA, replicazione, RNA, sintesi proteine, smistamento proteine, traffico vescicolare e più Traduzioni in PDF di Biologia Animale solo su Docsity! 57 NUCLEO Parliamo di cellule eucariotiche in quanto nei procarioti non c’è. È un organello che occupa il 10% del volume della cellula, costituito da una doppia membrana: involucro nucleare. Attività: avvengono processi fondamentali per la vita della cellula. Contiene i cromosomi e li suddivide durante la divisione cellulare; duplica il DNA, trasporta fattori di regolazione e prodotti dei geni tramite i pori nucleari; avvengono sintesi e maturazione degli RNA e assembla le subunità ribosomiali; organizza duplicazione. È in comunicazione con il citoplasma attraverso i pori nucleari attraverso i quali possono uscire le molecole. Durante l’evoluzione della cellula essa ha sentito il bisogno di confinare il nucleo per proteggere il suo patrimonio genetico dalle forze generate dal citoplasma. (già parlato dell’involucro nucleare). L’involucro nucleare ha una struttura complessa che consiste di due membrane: interna ed esterna che è in comunicazione con il reticolo endoplasmatico rugoso. Le due membrane agiscono da barriera e sono unite a livello dei pori nucleari, gli unici canali attraversi i quali piccole molecole polari e macromolecole sono in grado di passare attraverso l’involucro. Piccole molecole e proteine con massa inferiore a 20- 40 kd attraversano il poro con diametro 9nm per diffusione facilitata. Le maggior parte delle proteine e l’RNA passano per trasporto attivo quindi con consumo di energia. Sottostante la membrana interna si trova la Lamina nucleare, un reticolo fibroso che fornisce supporto strutturale al nucleo ed è formata da proteine dette LAMINE. PORO NUCLEARE: Struttura simile ad una ruota costituito da anelli paralleli, ognuno costituito da otto subunità che delimitano il bordo della ruota. Otto raggi connettono i due anelli e si estendono fino al trasportatore centrale nel mezzo della ruota. Il trasportatore può essere considerato come una struttura a diaframma che si apre e chiude per permettere il passaggio di particelle con differenti dimensioni. Mette in comunicazione il citosol con il nucleoplasma. TRASPORTO ATTIVO Le proteine sono sintetizzate solo nel citoplasma. Nel nucleo servono le proteine basti pensare a tutti gli enzimi che servono nella duplicazione o le proteine adibite all’impaccamento del DNA. Le proteine che entrano nel nucleo presentano segnali (sequenze di amminoacidi) di localizzazione nucleare (NLS) per la loro traslocazione (Lys-Arg e Lys-Lys-Lys-Lys). 58 Le proteine che escono dal nucleo presentano segnali di esportazione nucleare (NES) per la loro traslocazione nel citoplasma. - CICLO DI IMPORTAZIONE La sequenza NLS fa in modo che la proteina IMPORTINA si leghi alla proteina che deve entrare “cargo”. L’importina può passare attraverso il trasportatore trascinando con sé la proteina cargo. All’interno del nucleo interviene una proteina RAN-GTP che si lega all’importina inducendo il rilascio della proteina cargo. Il complesso Ran-GTP- importina è ritrasportato nel citosol dove l’idrolisi del GTP a GDP è accompagnata dal rilascio dell’importina. - CICLO DI ESPORTAZIONE Nel caso dell’esportazione il cargo principale è rappresentato dall’RNA che viene prodotto con segnali di esportazione NES. La proteina Ran-GTP si lega all’ESPORTINA all’interno del nucleo, promuovendone il legame con il cargo, rappresentato da un complesso ribonucleoproteico. Il complesso esportina-cargo-Ran-GTP viene esportato attraverso il poro nucleare nel citosol dove l’esportina e il suo cargo sono rilasciate da Ran in un processo accompagnato dall’idrolisi di GTP a GDP. Quindi l’esportina ritorna nel nucleo dove può ricominciare il ciclo di esportazione. Entrambi i cicli: sono guidati da gradiente di concentrazione della proteina Ran-GTP. Il Ran-GDP all’esterno deve rientrare nel nucleo per essere riconvertito a Ran-GTP. Il Ran-GTP deve essere alto nel nucleo perché promuove la dissociazione proteina-importina. E’ mantenuto dalla presenza di un GEF (fattore di scambio dei nucleotidi guanilici) nel nucleo e di un GAP (fattore attivante la GTPasi) nel citosol. NUCLEOLO: regione distesa di rilevanti dimensioni dove avviene la formazione dei ribosomi. Nella regione organizzatrice del nucleolo sono situati i geni che codificano per l’RNA ribosomiale. L’rRNA prodotto dalla trascrizione e le proteine ribosomiali (che provengono dal citoplasma) vengono impiegati per la sintesi delle subunità ribosomiali che in tale fase sono definiti PRERIBOSOMI poi passano nel citoplasma dove avviene la formazione del ribosoma. Negli eucarioti 4 r-RNA, 3 sintetizzati nel nucleolo e 1 il più piccolo da un’altra parte. Ai r-RNA si legano già delle proteine che matureranno nel citosol. 61 parte dei cromosomi si dimostra scarsamente visibile in quanto decondensati, formano un unico groviglio. I cromosomi hanno strutture diverse analizzando il cariotipo a seconda della posizione del centromero: metacentrico il centromero è messo a metà, i due bracci sono detti P e Q in quanto non hanno proprio la stessa lunghezza; submetacentrico quando il centromero è più spostato verso un’estremità, acrocentrico quando i due cromatidi si uniscono alle due estremità Y. I bracci P si riducono a satellite e stalk. Il satellite è sempre compatto e non viene mai trascritto. Le parti terminanti sono dette telomeri. CICLO CELLULARE -INTERFASE: G1: fase di accrescimento e sintesi proteica S: replicazione del DNA G2: sintesi di proteine necessarie perché avvenga la mitosi, intervallo necessario perché la cellula controlli che il DNA si è replicato correttamente - MITOSI: divisione cellulare -CITOCINESI La cromatina è una struttura altamente dinamica, con possibili livelli di organizzazione che riflettono la sua attività. Interfase: - GAP 1: tanto DNA trascritto in RNA tradotto in proteina. Il DNA è lasso decondensato. - Fase S: DNA ancora lasso, i cromosomi sono duplicati. -GAP 2: DNA inizia a compattarsi in preparazione della mitosi per formare i cromatidi fratelli. La CROMATINA È DECONDENSATA e distribuita in tutto il nucleo sotto forma di EUCROMATINA, essa è attivamente espressa cioè trascrivibile. In piccola quantità può essere CONDENSATA sotto forma di ETEROCROMATINA in quei segmenti che non vengono tradotti (es zona satellite del cromosoma Y). Se questi segmenti sono contenuti in tutte le cellule si dice ETEROCROMATINA COSTITUTIVA e non sono mai trascritte. Alcune zone di cromatina possono essere condensate in alcune cellule ma in altre no si dice ETEROCROMATINA FACOLTATIVA e varia secondo l’attività trascrizionale del tipo cellulare. Queste zone che rimangono condensate sono trascrizionalmente inattive. Mitosi: la cromatina è tutta compattata: ETEROCROMATINA. -nella profase (prima fase della mitosi) si hanno i CROMOSOMI METAFASICI, massimo livello di compattamento. 62 GATTINA CALICO. Etero cromatina facoltativa. Nelle femmine di mammifero, compreso l’uomo, uno dei due cromosomi X viene inattivato per conversione in eterocromatina (corpo di Barr) all’inizio dello sviluppo. E’ un processo embrionale casuale: l’X di derivazione paterna e quello di derivazione materna hanno uguali possibilità di venire inattivati in qualsiasi cellula. La formazione del corpo di Barr è dovuta all'azione della regione Xic, X inactivation centre. Se è attiva il cromosoma viene inattivato. Una volta che si è stabilita la struttura condensata della cromatina di un cromosoma X, qualche processo sconosciuto fa ereditare fedelmente la struttura durante le replicazioni successive del DNA. L’X condensato viene riattivato durante la formazione delle cellule germinali. Nel gatto calico, un allele per il colore nero del pelo è su un cromosoma X, un allele per il colore arancione è sull’altro cromosoma X. Colore del pelo a macchie nere e arancioni è sicuramente femmina. Questo ha due cromosomi X uno paterno e uno materno con due geni del colore. Uno dei due cromosomi X è sempre altamente condensato in eterocromatina, quindi inattivo detto CORPO DI BARR. Gruppi di cellule hanno attivato il cromosoma X materno altre quello paterno. Il gatto è stato clonato: carbon copy pur avendo lo stesso patrimonio genetico non presenta la colorazione a tartaruga a dimostrazione che la disattivazione di un cromosoma X è casuale. Ipotesi della Compensazione del dosaggio: la X ha già tanti geni il secondo viene disattivato. Nel maschio ho un cromosoma Y acrocentrico con pochi geni e necessita di uno X. Il contenuto di DNA nelle cellule di una specie animale è mantenuto costante. - GENOMA: insieme di tutti i cromosomi che stanno in un individuo, quindi è l’insieme di tuti i geni di un individuo. I batteri hanno una singola molecola di DNA mentre in una cellula animale vi sono 46 cromosomi. - CARIOTIPO: rappresentazione ordinata del corredo cromosomico di un individuo. Nell’uomo 23 coppie di cromosomi a unico filamento: 22 di autosomi e una coppia di cromosomi a unico filamento sessuali. La dimensione del genoma non è correlata con la scala di evoluzione dell’individuo. Il cariotipo di una cellula è dato dal numero e dalla morfologia dei suoi cromosomi. Come si effettua l’analisi del cariotipo: -Prelievo di sangue -Centrifugazione per ottenere globuli bianchi -Stimolazione alla mitosi delle cellule -Blocco delle cellule in fase mitotica con colchicina -Le cellule vengono fatte scoppiare immergendole in una soluzione per lisi Osmotica. Messe quindi in una soluzione ipotonica. -La piastra metafasica viene isolata. I cromosomi condensati possono essere separati -I cromosomi vengono colorati col metodo del ‘banding’ nel quale assumono una colorazione a bande o fasce colorate. 63 . Bandeggio cromosomico: Dei coloranti specifici riconoscono delle sequenze di nucleotidi nei vari cromosomi e consentono di individuare i bracci p e q, bande e sottobande in base al grado di condensazione dei cromosomi mitotici. La colorazione più conosciuta è la GIESMA che riconosce regione ricche di AT. Dopo la colorazione si osservano al microscopio un’alternanza tra bande G- positive scure, G-negative chiare. Esiste anche il cariotipo a fluorescenza. I cromosomi trattati con nucleotidi che riconoscono i loro complementari e sono legati a una o più molecole fluorescenti. Le coppie di cromosomi omologhi sono identificate ricercando cromosomi della stessa dimensione e colore. -La piastra metafasica viene fotografata. OGNI COPPIA DI CROMOSOMI (cromosomi omologhi) CONTIENE UN CROMOSOMA DI ORIGINE PATERNA E UN CROMOSOMA DI ORIGINE MATERNA. Ciò avviene in tutti gli organismi a riproduzione sessuata. I cromosomi sono presenti in (23) coppie di singoli filamenti nelle cellule somatiche (tutte le cellule di un organismo tranne i gameti che hanno metà del corredo cromosomico quindi hanno 23 cromosomi a singolo filamento/cromatidi) e i membri di una coppia sono i cromosomi omologhi. Se una cellula contiene 2 cromosomi di ogni tipo, (cioè 23 coppie di cromosomi) si dice che possiede un corredo cromosomico DIPLOIDE; se invece è presente un cromosoma di ogni coppia di omologhi, si dice che il corredo è APLOIDE (caso dei gameti). Nell’uomo il numero diploide è 46 cromosomi, 23 coppie di omologhi. il numero aploide è 23 cromosomi. Nell’uomo, le cellule somatiche contengono 46 (23x2) cromosomi: 44 AUTOSOMI e 2 CROMOSOMI SESSUALI GENE: in termini molecolari parte di cromosoma. È una sequenza di DNA che viene trascritta in RNA. Se questo RNA è messaggero ovvero che verrà usato come stampo per una proteina allora posso dire che il gene è una sequenza di DNA che codifica per una proteina. Ma la generalmente parlando di gene intendo non solo la sequenza di DNA che codifica una proteina ma anche regioni di controllo che vengono trascritte ma che non codificano (promotore del gene). A livello non molecolare è un’unità ereditaria che determina la qualità di un carattere. GENOMA: informazione genetica totale conservata nei cromosomi di un organismo. I genomi degli eucarioti non sono soltanto molto più complessi di quelli dei procarioti, ma il DNA delle cellule eucariotiche è anche organizzato in modo diverso da quello delle cellule procariotiche. I genomi dei procarioti sono contenuti in singoli cromosomi, molecole di DNA circolare. I genomi degli eucarioti sono composti da cromosomi multipli, ciascuno contenente una molecola lineare di DNA. [23 coppie di cromosomi a unico filamento omologhi, 23 madre e 23 padre. Cromosoma è una molecola di DNA. Quindi noi abbiamo 46 molecole di DNA!! E 1 genoma definito come insieme del patrimonio genetico di un individuo. Nella divisione i cromosomi a unico filamento si duplicano a formare due cromatidi fratelli e quindi un cromosoma metafasico] 66 1° problema della DNA polimerasi: La DNA polimerasi può allungare la catena di DNA ma non la può iniziare. E’ quindi necessario un primer (innesco) o breve oligonucleotide. Necessita che ci sia già un pezzo di nucleotidi legati per trovare l’ultimo nucleotide che ha libero l’OH per legarci quelli che copia lei. La Primasi catalizza la formazione di un breve frammento di RNA che funge da innesco per la reazione di allungamento. L’enzima primasi è un RNA POLIMERASI in quanto sintetizza il primer che è una piccola sequenza di ribonucleotidi complementare(da 5 a 10) (attenzione che userà l’uracile e contiene zucchero ribosio) che alla fine dovrà essere eliminato. La primasi sintetizza frammenti di RNA lunghi circa 10 basi, usando come stampo il DNA, a differenza della DNA polimerasi che può aggiungere i nucleotidi solo all’estremità di un filamento preesistente, la primasi può iniziare la sintesi dell’RNA dal nulla semplicemente legando tra loro due nucleotidi. Alla fine ho un nuovo filamento con un primer di RNA che va in 5’->3’. L’innesco sarà eliminato da una delle DNA polimerasi (che funge da esonucleasi) che lavora in 5’->3’ tagliando tutti i ribonucleotidi che saranno sostituiti da desossiribonucleotidi. La sintesi inizia da un corto innesco di RNA. Formato l’innesco la sintesi del DNA può procedere e la DNA polimerasi può aggiungere uno dopo l’altro i desossonucleotidi dall’estremità 3’ dell’innesco. Dopo l’inizio della replicazione a livello di un’origine, il DNA è sintetizzato a livello di DUE FORCELLE DI REPLICAZIONE Y, aperta dalla DNA ELICASI (usa energia ricavata dall’idrolisi di ATP e rompe i legami a idrogeno tra le basi in particolare inizia nelle zone ricche di AT che formano solo due legami tra loro.) che si allontanano dall’origine in due direzioni opposte, generando una bolla di replicazione la cui dimensione cresce al crescere della replicazione che è bidirezionale perché le molecole di DNA polimerasi si muovono lungo lo stampo dell’estremità 3’ ->5’ e i due filamenti di DNA sono antiparalleli. La sintesi di DNA quindi è continua nella direzione del movimento di una forcella su un filamento, ma è discontinua nella direzione opposta sull’altro filamento. I due filamenti che si distinguono in base al tipo di crescita si chiamato: FILAMENTO ANTICIPATO quello sintetizzato in modo continuo in quanto cresce in direzione 5’->3’; FILAMENTO RITARDATO quello che deve crescere in direzione 3’->5’ ma dato che in questa direzione la DNA polimerasi non può lavorare, esso viene formato da una serie di FRAMMENTI DI OKAZAKI corti e discontinui sintetizzati in direzione 5’->3’. Questi frammenti saranno poi uniti tra loro dalla DNA LIGASI per formare un unico filamento di DNA. Se capisco come avviene la duplicazione di dna in una forcella so esattamente come avviene la duplicazione nell’altra forcella (esame: rappresenta 1 forcella di replicazione dicendo che questa è metà di una bolla di replicazione quindi sulla forcella opposta a questa lo sappiamo fare anche dall’altra parte e mettere gli estremi della forcella). Di conseguenza su un filamento avremo bisogno di un solo primer mentre sull’altro più primer. 67 Il filamento anticipato, continuo e che ha bisogno di un solo primer è detto anche FILAMENTO PRINCIPALE/GUIDA (LEADING), l’altro filamento ritardato costituito dai frammenti di Okazaki e che ha bisogno di più primer che si attaccano man mano che la forcella si apre è detto anche FILAMENTO RITARDATO (LAGGING). Per ogni apertura della forcella si formano frammenti di OKAZAKI con a monte un primer di RNA e poi un frammento di DNA. Nei procarioti che presentano solo una molecola di DNA circolare, la replicazione inizia da una singola origine e prosegue in modo bidirezionale lungo il DNA circolare, mentre le due forcelle si muovono in direzioni opposte. I primer devono essere tolti tutti: interviene una DNA polimerasi (alfa-primasi) che riconosce gli RNA in un’elica di DNA ed è capace di idrolizzare, rompere legami tra i ribonucleotidi (attività esonucleasica). Quando il primer viene tolto, la DNA polimerasi (epsilon)continua a duplicare il DNA (dove prima c’era il primer che una volta tolto lascia un ‘gap’ ) fino ad arrivare al fosfato in 5’ del nucleotide successivo. La DNA polimerasi non è capace di legare i due frammenti, interviene la DNA LIGASI a formare il legame fosfodiestere tra OH e P. (nei procarioti: polimerasi III sintetizza, polimerasi I taglia il primer. Negli eucarioti la DNA polimerasi che agisce dopo la RNA polimerasi è la alfa-primasi segue epsilon, quella del filamento ritardato è la delta). In realtà l’attività di polimerasi epsilon e delta è più complicata. Le due funzionano come un dimero e sono legate alla elicasi mediante le SLIDING CLAMP (proteine della pinza scorrevole) e CLAMP LOADING (proteine di ostegno) e sono obbligate a seguirne il movimento ma ciò sarebbe impossibile per la DNA polimerasi delta che dovrebbe muoversi in direzione 5’- >3’ ma non può. Per questo motivo il filamento ritardato deve ripiegarsi, forma un loop tra la polimerasi e la forcella di duplicazione, così da consentire il movimento con l’elicasi. Una volta che la polimerasi delta ha raggiunto il primer precedente l’ansa si srotola, la polimerasi si stacca raggiungendo il primer più a monte. Viene reso disponibile altro DNA da sintetizzare attraverso la alfa primasi che toglie il primer e la delta che si leva vicino alla divaricazione della forcella e continua il suo lavoro sovrascrivendo anche il primer precedente che è stato rimosso riempiendo il gap. Interviene la DNA Ligasi ad attaccare i frammenti che utilizza ATP come fonte di energia. Il meccanismo consente ai dimeri di DNA polimerasi di sintetizzare contemporaneamente i due filamenti a una velocità di 1'000 paia di basi nucleotidiche al secondo. Principale delta o epsilon?. DNA polimerasi: procarioti: I riparazione/replicazione, II riparazione, III replicazione. Eucarioti: alfa associato alla primasi, gamma dna mitocondriale, delta: replicazione principale fattore replicativo, epsilon come delta. Quando vengono tolti tutti i primer la DNA polimerasi epsilon riempie il gap sintetizzando nuovo DNA eccetto per i primer posizionati alle estremità. Essi vengono tolti ma il DNA non è duplicato, il nuovo filamento è più corto del suo stampo. Si ha l’accorciamento dei telomeri. 68 I telomeri si accorciano fino a loro completo esaurimento. Quando la duplicazione va avanti vengono man mano persi frammenti di DNA codificanti e si perdono informazioni. Questo fatto è incompatibile con la vita della cellula che andrebbe in contro a senescenza (stato in cui la cellula non è più in grado di proliferare, ed è caratterizzata da una perdita della funzione fisiologica, da una resistenza all'apoptosi). I telomeri sono associati a orologi che limitano le replicazioni cellulari. Tuttavia nelle cellule germinali e staminali esiste la TELOMERASI che è in grado di ricostruire telomeri allungando la parte terminale di DNA. Questo enzima si attacca all’estremità 3’ dove ci sono unità ripetute che vengono riconosciute. La telomerasi presenta uno stampo di RNA complementare ai telomeri (del master) e allunga il filamento master. Una volta che il filamento è allungato sono richiamate una RNA-polimerasi alfa che sintetizza il primer e una DNA polimerasi per finire il lavoro. Verrà rimosso l’RNA ma il nuovo filamento è comunque di lungo di quello che si formerebbe senza telomerasi. Agisce come TRASCRIPTASI inversa: utilizza RNA per sintetizzare un pezzo di DNA. TELOMERO: sequenza ripetuta di nucleotidi attaccati all’estremità 3’ del filamento di DNA non codificante che formano un “cappuccio” all’estremità dei cromosomi in modo che non venga accorciata la parte di DNA codificante. Vengono rigenerati dall’enzima telomerasi che funzione come una trascrizione inversa. La lunghezza dei telomeri è correlata con l’invecchiamento precoce. Le cellule somatiche affette da progeria hanno telomeri più corti e mostrano una diminuzione della capacità proliferativa in coltura. PROBLEMA DEL SUPERAVVOLGIMENTO DEL DNA A MONTE DELLA FORCELLA Lo srotolamento del DNA a livello della forcella induce un superavvolgimento a monte della forcella stessa. Dovrebbe esserci una rapida rotazione dell’elica di DNA necessaria a contrastare il fenomeno, ma non riesce. Interviene un enzima TOPOISOMERASI (tipo I e II in relazione a quanti filamenti tagliano) come la DNA GIRASI (per i procarioti) che taglia i superavvolgimenti positivi (avvolgimenti destrosi, nella stessa direzione in cui la doppia elica è già avvolta) creando punti di rotazione per poi ricucirli. La topoisomerasi I non richiede ATP a differenza della II. La topoisomerasi nella sua catena amminoacidica presenta con gruppo OH con il quale rompe il legame fosfodiestere a livello del super avvolgimento. Il legame con il suo OH e il fosfato del nucleoide rompe uno dei due filamenti. Senza le topoisomerasi il DNA non può replicarsi, per questo sono stati usati inibitori delle topoisomerasi come droghe anti-cancro per fermare la proliferazione delle cellule maligne; purtroppo questi inibitori possono fermare anche la divisione di cellule normali; possono essere colpite alcune cellule (cellule dei capelli, midollo osseo) che necessitano di dividersi continuamente, ciò spiega effetti collaterali quali la perdita dei capelli o anemia. FEDELTA’ DI REPLICAZIONE: L’accuratezza della replicazione del DNA è fondamentale per la corretta trasmissione dell’informazione genetica. Valutando la frequenza di basi male 71 In seguito alla trascrizione genica attuata da parte dell’RNA polimerasi II si genera un trascritto primario pre-mRNA che prima della traslocazione dal nucleo al citoplasma è sottoposto a MATURAZIONE: trasformazioni chimiche che lo portano a essere m-RNA maturo: Processi che aumentano la stabilità dell’mRNA: - Aggiunta di un cappuccio all’estremità 5’-> viene legata una molecola di 7-metilguanosina (guanosina metilata in posizione 7 dell’anello purinico e che è orientato opposto rispetto agli altri nucleotidi per il legame che forma) tramite un legame 5’->5’ (e non3’->5’ come ci si potrebbe aspettare). Tale cappuccio è importante perché esso verrà riconosciuto dalla subunità minore dei ribosomi per dare via alla sintesi proteica. Inoltre aumenta la stabilità del messaggero perché le esonucleasi citoplasmatiche non riconoscono il legame 5’-5’ e quindi non c’è rischio che possano degradare la molecola di RNA. -Aggiunta di una coda di poliA all’estremità 3’->taglio di 10-35 nucleotidi a valle della sequenza AAUAAA e aggiunta di 50-250 nucleotidi con base Adenina da parte della poliA-polimerasi che catalizza l’aggiunta di sequenze poli-A all’RNA senza richiedere un DNA stampo. La coda protegge l’mRNA dall’attacco delle nucleasi. Processi di rimozione di sequenze non codificanti: -splicing degli introni: il DNA è costituito da esoni (sequenze che codificano) e introni (sequenze che non codificano); questi ultimi vengono tagliati dal pre-mRNA. Ciò avviene perché a livello degli introni si forma un cappio che in prossimità della fine ha un nucleotide con base Adenina che con il proprio OH rompe il legame fra l’ultimo nucleotide dell’esone e il primo dell’introne e si lega a quest’ultimo. A sua volta l’OH dell’ultimo nucleotide dell’esone rompe il legame fra l’ultimo nucleotide dell’introne e il primo dell’esone successivo: si slega il cappio costituito dall’introne che avrà all’estremità un OH in 3’. Si uniscono quindi l’ultimo e il primo nucleotide del primo e del secondo esone grazie all’aiuto di una ligasi. Lo splicing è attivato dallo SPLICINGSOMA, un insieme di piccole particelle nucleari formate da piccole molecole di RNA e proteine snRNA (small nuclear ribonucleopritein particles) nel quale l’attività enzimatica è supportata non 72 dalle proteine ma dalle molecole di RNA (ribozimi= RNA ad attività catalitica). Nei procarioti non vi è la distinzione in esoni ed introni e l’m-RNA viene trascritto già maturo -> non va incontro ad aggiunta di cappuccio e code e soprattutto allo splicing. L’m-RNA dei procarioti è invece chiamato POLICISTRONICO perché ogni gene codifica per più proteine, generalmente enzimi coinvolti nella medesima via metabolica, intermediate da UTR. L’m-RNA degli eucarioti è chiamato MONOCISTRONICO perché ogni gene codifica per una sola proteina. Durante la sintesi proteica, non tutto l’m-RNA viene tradotto in proteina ma solamente la parte intermedia perché le sequenze all’estremità 5’ e all’estremità 3’ non sono codificanti (sequenze UTR: untraslated regions). -Splicing alternativo: in due cellule differenti, con differenti specificità nello stesso gene le sequenze considerate introni ed esoni non coincidono-> si avranno quindi proteine differenti derivanti dalla medesima sequenza di DNA e quindi dallo stesso trascritto primario che danno origine alle isoforme proteiche diverse. TRASCRIZIONE GENICA DA PARTE DELLA RNA POLIMERASI I La RNA polimerasi I sintetizza gli R-RNA (ribosomiali). I geni ribosomiali sono presenti sul DNA localizzati a livello del NUCLEOLO, dopo essere stati trascritti gli r-RNA si complessano con proteine a formare le subunità del ribosoma che raggiungono il citoplasma. Ribosoma è composto da 2 subunità di r-RNA associati a proteine: negli eucarioti 60s la maggiore e 40s la minore (nei mammiferi); nei procarioti 50S la maggiore e 30S la minore. La più piccola delle subunità contiene una singola molecola di RNA 18S (coefficienti di sedimentazione); la maggiore contiene tre molecole di RNA una di circa 25/28S e le altre da 5,8S e 5S. Di questi quattro tipi di r-RNA i tre più grossi sono sintetizzati nel nucleolo da RNA polimerasi I e sono codificati da una singola unità trascrizionale. Le sequenze di DNA che codificano per questi tre r-RNA sono separate all’interno da segmenti di DNA detti SPAZIATORI TRASCRITTI. La presenza di tre diversi geni per gli r-RNA all’interno di una singola unità di trascrizione assicura che la cellula produca questi tre r-RNA in uguale quantità. Vi sono poi SPAZIATORI NON TRASCRITTI che separano tra loro le unità di trascrizione. -> 28S 5,8S 5S associati a 50 proteine. Nella inferiore 18s associato a 35 proteine. 73 TRASCRIZIONE DEI GENI DA PARTE DELLA RNA POLIMERASI III La 5S il cui gene costituisce una unità di trascrizione separata, trascritta dalla RNA polimerasi III. La polimerasi III inoltre trascrive i geni per i t-RNA [da disegnare] e alcuni per gli snRNA. Qui il promotore è interno all’unità di trascrizione. Ci sono promotori: i due box che fungono da promotore non stanno a monte della sessione di duplicazione ma stanno all’interno. Box C , A , TF MATURAZIONE DEL T-RNA -Viene rimosso la sequenza leader di 16 nucleotidi all’estremità 5’; catalizzata da un ribozima. - sostituzione di 2 nucleotidi al 3’ con una sequenza di tre nucleotidi CCA con OH libero. -modificazione chimica di alcune basi come la metilazione di A G C o la formazione di basi insolite come la diidrouracile D. -eliminazione di un introne (sezione viola dell’ansa). Il tRNA maturo ha struttura secondaria a trifoglio ha estremità 5’ e 3’ (OH) dove si legherà l’amminoacido. (ma ha struttura terziaria a L). L’ansa dell’anticodone ha i 3 nucleotidi fondamentali durante la sintesi proteica. 76 codoni devo aver 61 anticodoni, quindi 61 transfer. In realtà POSSONO ESSERE MENO per via di un meccanismo che si può verificare detto WOBBING O OSCILLAZIONE. In alcuni casi, il nucleotide all’estremità 5’ dell’anticodone del tRNA è in grado di appaiarsi con più di un nucleotide all’estremità 3’ (terza posizione) del codone dell’mRNA. Di conseguenza più codoni possono usare lo stesso tRNA. esempio GAU del anticodone si lega sia con CUA che con CUG. GAG si lega sia con CUU che con CUC. G forma dei legami a idrogeno non obbligati con le basi corrispondenti del codone. POLIRIBOSOMA Per aumentare l’efficienza della traduzione un mRNA può essere tradotto contemporaneamente da più ribosomi. Da un mRNA si possono formare più proteine. CARATTERISTICHE PROCARIOTI 1. Le cellule batteriche non contengono un nucleo organizzato; il DNA genomico è sparso nel citoplasma 2. I geni non contengono introni 3. Un unico sito promotore spesso controlla una serie di geni raggruppati insieme a formare un OPERONE (esempio quello LAC composto da 3 geni o TRIPTOFANO composto da 5 geni). 4. L’operone viene trascritto in un singolo mRNA 5. L’mRNA viene tradotto in proteine diverse (RNA policistronico): ogni segmento di mRNA ha il proprio sito di legame per il ribosoma, il proprio codone di inizio e di terminazione 6. Un’unica RNA polimerasi che, con l’intervento di proteine accessorie (fattori s), si lega al promotore del DNA 7. I geni che fanno parte di un dato operone spesso codificano enzimi diversi di un’unica via metabolica e sono controllati in modo coordinato 8. Ribosomi di dimensioni inferiori e fattori proteici per la sintesi di proteine differenti da quelli degli eucarioti SMISTAMETNO DELLE PROTEINE In una cellula eucariotica vengono sintetizzate oltre 20.000 proteine diverse tra loro e ciascuna deve raggiungere la propria posizione. Un dislocamento sbagliato può portare a patologie. Le proteine iniziano ad essere sintetizzate nei ribosomi liberi nel citosol. Nel mezzo della sintesi i ribosomi possono essere seguire due strade: 1) Rimanere liberi nel citosol 2) Associarsi con la membrana del RE. Caso 1: i ribosomi rimangono liberi nel citosol: la sintesi del polipeptide viene completata nel citosol e queste proteine possono: - rimanere nel citosol o essere importate in diversi organelli ricordando che l’importazione negli organelli è POST-TRADUZIONALE. Quando una proteina deve essere importata in un organello sa esattamente in quale entrare perché nella sua sequenza 77 amminoacidica c’è un SEGNALE posto all’inizio della catena. Il peptide segnale ha un recettore sulle diverse membrane degli organelli. Si parla di TRASPORTO ATTRAVERSO I PORI NUCLEARI se le proteine entreranno nel nucleo, TRASPORTO ATTRAVERSO LE MEMBRANE se le proteine entreranno nel mitocondrio, cloroplasto o perossisoma. Caso 2: i ribosomi iniziano la sintesi della proteina nel citosol ma poi l’arrestano e il complesso ribosomico va ad attaccarsi alla membrana del RE detto rugoso. Il riconoscimento del RE avviene sempre tramite un peptide segnale. Qui viene ripresa la sintesi della proteina e terminata. La proteina viene man mano sintetizzata all’interno del RE grazie a un’interazione con un canale della membrana. Si parla di IMPORTAZIONE CO-TRADUZIONALE e sarà seguita dal trasporto alla destinazione finale che possono essere le cisterne del Golgi per TRAFFICO VESCICOALRE per finire poi in una vescicola di secrezione, nel lisosoma o nella membrana plasmatica (in quest’ultimo caso la proteina sarà già inserita nella membrana della vescicola). Post- TRASPORTO/SMISTAMENTO ATTRAVERSO I PORI NUCLEARI: già visto. traduzionale TRASPORTO/SMISTAMENTO DELLE PROTEINE MITOCONDRIALI: Le proteine mitocondriali possono essere importate sia nello spazio intermembrana quindi oltrepassando solo la membrana esterna oppure nella matrice mitocondriale oltrepassando entrambe le membrane. Le proteine sanno di doverci entrare tramite un segnale di indirizzamento posto nella porzione amino-terminale. Il peptide segnale ha recettore sulla membrana esterna dei mitocondri a cui si lega. Il ricettore si localizza vicino a un poro detto TRASLOCATORE, i due diffondono nella membrana fino ad incontrare i traslocatore della membrana interna. Si così crea un sito di contatto tra le due membrane e la proteina entra nella matrice. Per fare ciò le proteine devo essere distese perché le dimensioni del peptide ripiegato superano il diametro del poro della membrana attraverso cui deve passare. Intervengono le CHAPERONINE con l’hsp70 ovvero proteine che hanno il compito di regolare lo stato di ripiegamento delle proteine. L’idrolisi dell’ATP viene usata per staccare la chaperonina e fornire energia motrice per importare la proteina attraverso il traslocatore. Una volta entrata una PEPTIDASI DEL SEGNALE taglia il peptide segnale e otteniamo la proteina matura. Per proteine sia nucleari che mitocondriali hanno un peptide segnale. Quelle del nucleo ce l’hanno all’interno della sequenza che viene riconosciuta dall’importina che fungendo da recettore 78 trascina la proteina dentro i pori nucleari del nucleo. La sequenza segnale specifica dei mitocondri è posta all’estremità N-terminale della catena. Ricorda che ogni proteina quando viene sintetizzata ha come primo aminoacido la metionina ma non è detto che tutte le proteine funzionanti hanno come primo amminoacido la stessa. Ne è un esempio questo dei mitocondri. Cotraduzionale SMISTAMENTO DELLE PROTEINE AL RE Una proteina endoplasmatica detta PARTICELLA DI RICONOSCIMENTO DEL SEGNALE SRP (che non è un recettore sulla membrana del reticolo) riconosce il segnale della proteina e si lega alla proteina bloccando la traduzione. La particella SRP ha il recettore sulla membrana del reticolo endoplasmatico e vi trascina il complesso a cui è legata. I CANALI DI TRASLOCAZIONE sulla membrana si trovano vicini al recettore. La GTP si lega al recettore e alla SRP aprendo il poro per l’entrata della proteina. L’idrolisi della GTP fa rilasciare la SRP. La sequenza segnale viene tagliata dalla peptidasi del segnale mentre il polipeptide si allunga perché riprende la sintesi e trasla nel lume del RE. Quando il polipeptide è completo è rilasciato nel lume, il ribosoma si dissocia e il poro del traslocatore si chiude. Caso delle proteine trasportate dentro una vescicola per entrare nel lume di lisosomi o essere secreta. Può essere che le proteine siano destinate a rimanere nelle membrane presentano un peptide segnale e un PEPTIDE DI ARRESTO DEL TRASFERIMENTO. Se la proteina è proteina di membrana, il RE fa in modo di inglobarla già nella membrana di una vescicola che andrà a fondersi con le altre membrane. Quando la sintesi della proteina arriva a livello del peptide segnale di arresto del traslocamento la proteina continua ad essere sintetizzata ma nel versante citosolico del RE e non più nel suo lume. La peptidasi del sagnale anche in questo caso taglierà il peptide segnale.