Paniere GENETICA FORENSE Baldi Marina 3 in 1 !, Panieri di Genetica

Scarica Paniere GENETICA FORENSE Baldi Marina 3 in 1 ! e più Panieri in PDF di Genetica solo su Docsity! Paniere NUOVO Genetica Forense prof. Baldi QUIZ RISOLTI + DOPPIO SVOLGIMENTO PER OGNI DOMANDA APERTA !!! COMPLETO e CORRETTO dal publisher laureato in servizi giuridici- CRIMINOLOGIA. A quale TRATTATO aderisce l’ITALIA con la LEGGE 30/06/2009 N. 85: trattato di PRUM, concluso il 27.05.2005 tra il regno del Belgio, la Repubblica federale di Germania, il Regno di Spagna, la Repubblica Francese, il Granducato di Lussemburgo, il Regno dei Paesi Bassie la Repubblica D’austria ACCREDIA è: l’organismo riconosciuto in ITALIA che attesta formalmente la competenza di un ORGANISMO o PERSONA a svolgere funzioni specifiche Al fine di stabilire se, TRACCE VEROSIMILMENTE EMATICHE siano riconducibili a sangue umano è possibile usare come strumento d’INDAGINE: diagnosi generica e di specie Alla fase di CARATTERIZZAZIONE della traccia quale fase segue? : estrazione del DNA Attraverso quale TEST posso confermare la PROVENIENZA UMANA di tracce di SPERMA: RSID semen TEST ATTUALMENTE LA BANCA DATI del DNA in ITALIA: prevede la raccolta di profili di DNA Attualmente la BANCA DATI DEL DNA IN ITALIA: prevede la raccolta dei profili del DNA Attualmente possiamo estrarre il DNA da Capelli, ossa, denti, saliva, sperma, sangue: SIIIIIIIIIIIII Che cos’è la D-loop: zona del DNA mitocondriale contenente le regioni ipervariabili HV1, HV2 e HV3 Che cos’è la PCR: una reazione a catena ripetitiva che può produrre milioni di copie del DNA di base Che cos’è la RANDOM MATCH PROBABILITY: la frequenza del profilo genetica nella popolazione di riferimento Che cos’è un GAMETE: una cellula riproduttiva con corredo cromosomico APLOIDE Che cosa è il CODIS ?: il database dell’FBI e dei profili del DNA Che cosa è UN GENE: un frammento di DNA che contente le istruzioni traducbili in una proteina Che cosa è un POLIMORFISMO: una sequenza variabile del DNA con una frequenza maggiore dell’1% nella popolazione Che tipo di POLIMERASI viene utilizzata DURANTE una reazione di PCR ad uso FORENSE: TAQ polimerasi Chi CONTAMINA la scena del Crimine: chi non indossa i Dispositivi di Protezione Individuale Chi è il DOMINUS delle indagini difensive: il PM Chi tenne nel 1902 il primo corso per la POLIZIA SCIENTIFICA: OTTOLENGHI Come è STRUTTURATO un laboratorio di Genetica forense ACCREDITATO: ci sono stanze separate per ogni fase dell analisi del reperto Come si chiama la MATRICE GELATINOSA contenuta nella CELLULA: citoplasma Come si chiama la MEMBRANA ESTERNA della CELLULA: membrana cellulare Come si CONSERVANO i REPERTI: in buste carta previa asciugatura Come si fa l’analisi della natura biologica della TRACCIA?: test presuntivi e test confermativi Con l’accesso ai luoghi, l’AVVOCATO ed i suoi COLLABORATORI, POSSONO: evidenziare le tracce di reato Con l’ELETTROFORESI CAPILLARE in gentica forense: è un metodo di separazione e rilevazione degli STR Con l’ingresso ai luoghi, l’AVVOCATO ed i suoi collaboratori POSSONO: tutte e tre le precedenti sono vere Con L’utilizzo delle ASL o LUCI FORENSI (blu, viola uv ecc) è possibile: determinare la presenza di fluidi corporei Con quali MODELLI STATISTICI si possono interpretare i profili misti: binario, semicontinuo, continuo Cos’è un TEST PRESUNTIVO: un test che serve per determinare la natura della traccia biologica ma che potrebbe presentare falsi positivi Cosa deve fare un operatore sulla scena del crimine dopo AVER ISPEZIONATO o PRELEVATO un REPERTO: cambiare il paio di guanti in precedenza indossato Cosa deve INDOSSARE chi opera sulla scena del Crimine per evitare inquinamenti, contaminazioni e trasferimenti di TRACCE IOLOGICHE: i dispositivi di protezione individuale ( tuta con copricapo, calzari, mascherina, guanti, occhiali, devono essere tutti monouso) Cosa è una TRACCIA LATENTE: una traccia biologica che può essere osservata solo con l’ausilio di lampade forensi o con l’uso di reazioni chimiche Cosa INTERROMPE la CATENA di CUSTODIA: non documentare la cronologia del sequestro ed il trasferimento degli elementi di prova Cosa NON DEVE FARE un operatore sulla scena del crimine dopo aver ispezionato prelevato un reperto: nessuna delle precedenti Cosa regolamente l’articolo 359 CODICE DI PROCEDURA PENALE: consulenti tecnici del pubblico ministero Cosa si intende per Likelihood Ratio (LR): il rapporto tra due probabilità a due eventi contrapposti Cosa si intende per ACCREDITAMENTO: procedimento con cui un organismo riconosciuto attesta formalmente la competenza di un organismo o persona a svolgere funzioni specifiche Cosa si intende per ALLELIC LADDER: miscela di ALLELI a PESO MOLECOLARE noto Cosa si intende per CAMPIONI MISTI: presenza di materiale biologico da due o più soggetti Cosa si intende per CATENA di CUSTODIA: la documentazione cartacea e/o digitale che mostra la cronologia del sequestro, custodia, trasferimento, analisi ed archiviazione dei risultati relativi agli elementi di prova Cosa si intende per CERTIFICAZIONE: procedura con cui una parte terza certifica per iscritto che un prodotto, processo o servizio è conforme ai requisiti specificati da una norma Cosa si intende per DIAGNOSI GENERICA: analisi che permette di identificare la natura della traccia Cosa si intende per DIAGNOSI GENERICA: identificazione della natura della traccia biologica Cosa si intende per DVI nei casi di identificazione di persone: Disaster Victim Identification Cosa si intende per estrazione differenziale: metodica di estrazione che permette di separare le cellule epiteliali e le cellule Cosa si intende per MPI nei casi di IDENTIFICAZIONE DI PERSONE: Missing Person Identification Cosa si intende per NEXT GENERATION SEQUENCING (NGS): più tecnologie che permettono di sequenziare in parallelo più grandi genomi o più tratti dello stesso genoma in un limitato arco di tempo Cosa si intende per ORIGINE TESSUTALE di una TRACCIA: il tessuto da cui è stato prelevato un campione biologico Cosa si intende per RANDOM MAN NOT EXCLUDED (RMNE): probabilità che un uomo preso da una popolazione non può essere escluso come contributore di una misura Cosa si intende per RANDOM MATCH PROBABILITY (RMP): è la probabilità che un uomo preso a caso da una popolazione ha il profilo osservato in una traccia Cosa si intende per SHORT TANDEM REPEATS: STRs o microsatelliti sono sequenze ripetute di DNA non codificate, costituite da unità di ripetizione da due a cinque copie di basi, disposte secondo una ripetizione in tandem, utilizzate come marcatori molecolari per l’identificazione individuale Cosa sono i MARCATORI GENETICI: sequenze polimorfiche di DNA Cosa sono le LUCI FORENSI: sorgenti di luce che permettono l’identificazione di tracce biologiche Cosa stabilisce la LEGGE 30/06/2009 N. 85: la cooperazione transfrontaliera per contrastare il terrorismo, la criminalità e la migrazione illegale. Istituzione della banca dati nazionale del DNA e del laboratorio centrale per la banca dati nazionale del DNA. Delega del governo per l’istituzione dei ruoli tecnici del corpo di polizia penitenziaria Cosa vuol dire l’ACRONIMO “CTP”: consulente tecnico di parte Cosìè la FREQUENZA GENOTIPICA: frequenza con cui il genotipo è presente in una data popolazione Da quali articoli del codice di procedura penale sono regolamentate le INDAGINI DIFENSIVE: dall’art. 391 bis al 391 decies Da un MOZZICONE di cigarette è possibile: ottenere un profilo di DNA Definizione di LOW COPY NUMBER: campioni biologici, utilizzati per l’analisi di STRs, che contengono quantità di DNA inferiore a 200 pg Definizione di TRACCIA BIOLOGICA MISTA: traccia biologica ottenuta dalla commistione di fluidi biologici di più persone. Il profilo genetico ottenuti dalla commistione evidenzia la presenza di più di due alleli in più loci analizzati Definizione di TRACCIA BIOLOGICA: traccia contenente cellule provenienti da più fluidi biologici della stessa persona DIFFERENZA tra CERTIFICAZIONE ed ACCREDITAMENTO: con la certificazione il laboratorio indica e certifica il flusso di lavoro che porta all’ottenimento del risultato analitico. Con l’accreditamento il laboratorio indica il grado di precisione e accuratezza associati al risultato analitico Dove si trovano le SEQUENZE del DNA di interesse forense: nel tessuto da cui sono prelevati i campioni biologici Dove si trovano le SEQUENZE del DNA di INTERESSE FORENSE: nel tessuto da cui sono prelevati i campioni biologici Dove sono LOCALIZZATI gli STRs per USO FORERNSE: sequenze esoniche Due FRATELLI figli dello stesso padre e della stessa madre : hanno lo stesso cromosoma Y Durante l’analisi di ELETTROFEROGRAMMI relativi a CAMPIONI a basso contenuto di DNA ( low copy number, LCN) si possono riscontrare problemi interpretativi, quali: TUTTE E’ possibile EFFETTUARE un PRELIEVO SU CADAVERE: si effettua E’ possibile effettuare un PRELIEVO SU MINORE: si effettua solo con autorizzazione del giudice previa autorizzazione dei genitori o dei tutori legali ENFSI cos’è: European Network of Forensic Science Institutes Esiste un PROTOCOLLO CONDIVISO da utilizzare in casi di MPI?: no, è allo studio Gli STR sono: corte sequenze di DNA in cui l’elemento variabile è il numero di copie in cui è presente l’unità ripetuta Gli Y-STR vengono utilizzati: per identificare la componente maschile in una mistura I dispositivi di PROTEZIONE INDIVIDUALE in un laboratorio di genetica forense sono: tutti i precedenti I dispositivi di SICUREZZA PERSONALE: devono essere presenti ed indossati in tutti gli ambienti I MARCATORI GENETICI utilizzati in genetica forense: forniscono esclusivamente informazione di identificazione personale I MARCATORI più comunemente utilizzati in ambito forense sono: STRS La diagnosi GENERICA COMBUR, cosa mette in evidenza?: sangue La genetica forense nei CASI CRIMINALI serve a: tutte le precedenti La legge 30.06.2009, N.85: concernente l’istituzione della banca dati nazionale del DNA e del laboratorio centrale per la banca dati nazionale del DNA La LIKELIHOOD RATIO o LR: è un rapporto tra due ipotesi alternative La MAGGIORE SENSIBILITA’ di un test (sangue, sperma, saliva, ecc) comporta: minore possibilità di falsi positivi La quantificazione del DNA in GENETICA FORENSE viene utilizzara per: rilevare la quantità totale di DNA presente nel campione La REAL-TIME PCR in ambito forense: è una tecnica che permette la quantificazione degli acidi nucleici La REPLICAZIONE del DNA è: un processo semiconservativo La SCENA DEL CRIMINE deve essere: isolata ed esaminata La STRUTTURA del DNA è: una doppia elica La VIOLENZA ASSISTITA è: un aggravante di alcuni delitti La VIOLENZA SESSUALE è dimostrata sempre dalla presenza di spermatozoi: non sempre Le c.d. TRACCE presenti su una scena del Crimine possono essere utili per: tutte le precedenti Le formazioni PILIFERE sono fonti di DNA?: sempre Le IMPRONTE DIGITALI di OGNI INDIVIDUO: nessuna delle risposte Le TRACCE presenti su una scena del crimine possono essere UTILI per: tutte le precedenti Negli ACCERTAMENTI di PATERNITA’ è sempre necessario il CAMPIONE MATERNO: no Nei casi di DVI le persone possono essere IDENTIFICATE: esclusivamente mediante l’estrapolazione dei profili genetici Nel CORPO UMANO le cellule si AGGREGANO e FORMANO in sequenza: tessuti, organi, apparati Nel VERBALE di SOPRALLUOGO vanno inseriti: tutte le opzioni precedenti Nel vigente codice di PROCEDURA PENALE, l’articolo che si riferisce agli ACCERTAMENTI tecnici ripetibili disposti dal PM è il: 359 Nel vigente codice di PROCEDURA PENALE, l’articolo che si riferisce al SOPRALLUOGO di POLIZIA GIUDIZIARIA è: 354 Nel vigente codice di procedura penale, l’ARTICOLO che si riferisce alla PERIZIA è: 220 Nel VIGENTE codice di procedura penale, l’articolo che si riferisce agli ACCERTAMENTI TECNICI IRRIPETIBILI disposti dal PM è il: 360 Nel vigente codice di PROCEDURA penale, l’articolo che si riferisce agli ACERTAMENTI TECNICI RIPETIBILI disposti dal PM è il: 359 Nelle FOTOGRAFIE MACRO delle tracce presenti sulla SCENA DEL CRIMINE (impronte digitali, scarpe, bossoli, etc): bisogna utilizzare un riferimento metrico forense OME valutiamo le condizioni sperimentali e/o la tecnica nell’esecuzione della PCR: attraverso i controllo positivo ed il controllo negativo Padre, Figlio e Fratelli: condividono lo stesso crosoma Y Per ALLELI si INTENDE: forme alternative dello stesso gene Per cosa sono utilizzate le LUCI FORENSI: per individuare tracce latenti Perché i TEST di conferma per il SANGUE e liquido seminale CONSENTONO di CONFERMARE la provenienza umana: si basano su caratteristiche specifiche ed uniche per quel tessuto UMANO Perché in ambito forense viene effettuata l’analisi del cROMOSOMA Y?: perché permette l’amplificazione esclusiva della componente maschile Perché l’analisi dell’APLOTIPO del cromosoma Y è utile in genetica forense: perché si trasmette tale e quale di padre in figlio e ci consente di individuare l’appartenenza alla famiglia per via maschile PERCHE’ l’analisi dell’aplotipo del CROMOSOMA Y è utile in genetica forense: perché si trasmette tale e quale di padre in figlio e ci consente di individuare l’appartenenza alla famiglia per via maschile Prima della legge n. 66 del 15.02.1996 i delitti di VIOLENZA SESSUALE ricadevano nella più ampia categoria dei delitti CONTRO….: la moralità pubblica ed il buon costume PUBMED è: un database bibliografico contenente informazioni riguardo la letteratura scientifica Qual è il limite minimo al di sotto del quale, in ambito FORENSE, UN ALLELE non può essere preso in considerazione: 50 RFU Qual è il principio con cui si fa l’IDENTIFICAZIONE della NATURA della TRACCIA biologica?: tutte le precedenti Qual è il RAPPORTO tra DNA e CROMOSOMI: i cromosomi sono costituiti da un filamento di DNA spiralizzato Qual è l’OGGETTO della prova nel codice di PROCEDURA PENALE: i fatti Qual è l’UNITA’ FONDAMENTALE degli organismi viventi?: la cellula Qual è la differenza tra cellula EUCARIOTA e PROCARIOTA: tutte le precedenti Qual è la FINALITA’ del processo di ESTRAZIONE: separare il materiale cellulare dalle molecole del DNA per avere una buona resa nella quantità e nella quantità Qual è la METODOLOGIA CORRETTA per la CONSERVAZIONE delle tracce biologiche repertate sulla SCENA DEL CRIMINE al fine di evitare la proliferazione delle MUFFE o dei MICRO-ORGANISMI: tutte le precedenti Qual è la metodologia corretta per la conservazione delle tracce biologiche repertate sulla scena del crimine al fine di evitare la proliferazione delle muffe o dei micro-organismi?: tutte le precedenti sono corrette Qual è la RAPPRESENTAZIONE GRAFICA di un ELETTROFORESI CAPILLARE: elettroferogramma Qual è stato il primo PAESE al MONDO ad utilizzare le impronte digitali sui documenti: CINA Quale articolo regola gli ACCERTAMENTI IRRIPETIBILI: art 360 cpp Quale dei seguenti è un APPAIAMENTO DI BASI presente nel DNA: A-T (adenina-Timina) Quale DISTRETTO BIOLOGICO si deve esaminare per OTTENERE un profilo genetico in casi di MPI: qualunque tessuto che consenta l’estrapolazione di un profilo Quale DNA si usa per l’IDENTIFICAZIONE PERSONALE in genetica forense: DNA nucleare Quale DNA si usa per l’identificazione PERSONALE in genetica forense?: Dna nucleare Quale è la SIGLA dell’ACCREDITAMENTO DEI LABORATORI DI FORENSE: UNI EN ISO/IEC 17025 Quale è stato il PRIMO TESTO DI TOSSICOLOGIA forense pubblicato nel 1813 ?: Traitè del poison Tires Quale fu l’invenzione di KARY MULLIS che nel 1983 rivoluzionò la BIOLOGIA MOLECOLARE: LA PCR Quale funzione svolge il POLIMERO durante la CORSA ELETTROFORETICA CAPILLARE: permette la separazione di frammenti di DNA Quale norma indica ai laboratori i CRITERI DA SEGUIRE per EFFETTUARE prove e tarature: UNI EN ISO/IEC 17025:2017 Quale tecnica per il SEQUENZIAMENTO del DNA è stata sostituita con le tecniche NGS: sequanziamento secondo SANGER Quale TEMPERATURA viene impostata sul TERMOCICLATORE nella prima fase di un ciclo di PCR: 96° C Quale TEST PRESUNTIVO mi permette l’identificazione di presunte TRACCE LATENTI: luminol test Quale tra questi è il FLUSSO CORRETTO che deve seguire un CAMPIONE in un labratorio di GENETICA FORENSE: dalla zna di pre-PCR alla zona di post-PCR Quale tra questi è un POLIMORFISMO di SINGOLO NUCLEOTIDE: SNP Quali fluidi biologici emettono FLUORESCENZA se entrano in contatto col LUMINOL: SANGUE Quali fra questi DISPOSITIVI ausiliari è utilizzato in associazione con le LUCI FORENSI: occhiali Quali PORZIONI OSSEE sono da preferire per un esame del DNA: OSSA LUNGHE Quali sono gli UNICI INDIVIDUI ad avere il DNA ASSOLUTAMENTE IDENTICO?: i gemelli MONOZIGOTI Quali sono gli UNVICI INDIVIDUI ad avere il DNA assolutamente IDENTICO: i gemelli omozigoti Quali sono i LIVELLI di VALUTAZIONE PROBABILISTICA del PESO dell’evidenza biologica?: 3 Quali sono i PASSAGGI delle analisi genetiche nei casi di CONSANGUINEITA’: prelievo, tipizzazione, analisi probabilistica Quali sono i POLIMORFISMI UTILIZZATI nell’analisi GENETICO FORENSE: STR Quali sono le ATTIVITA’ che POSSONO essere espletate dal BIOLOGO FORENSE in ambito GENETICO: tutte le precedenti Quali sono le CARATTERISTICHE del MATERIALE GENETICO: tutte le precedenti Quali sono le FASI dell ANALISI del DNA: estrazione-quantificazione-amplificazione Quali sono le fasi di ANALISI del DNA: estrazione, quantificazione, amplificazione Quali tra questi sono POLIMORFISMI di LUNGHEZZA: STR Quando gli accertamenti sono NON RIPETIBILI bisogna svolgerli secondo il CPP: 360 Quando si parla di DVI: quando un evento indica il simultaneo decesso di più persone Quante copie di DNA sono presenti nelle CELLULE SOMATICHE di un individuo diploide?: 2 Quanti sono i CROMOSOMI umani in una cellula SOMATICA: 46 Quanti sono i GRUPPI SANGUIGNI nell’uomo: 4 Quanti tipi di dna ci sono nelle cellule umane: 2 Quanto tempo si CONSERVA intatto il DNA?: se ben conservato alcuni decenni Quanto tempo si CONSERVA INTATTO il DNA?: se ben conservato diversi decenni Rappresenta la fase più delicata, quali sono le problematiche legate alla fase di ESTRAZIONE: contaminazioni con altri campioni e introduzione di DNA estraneo Secondo le direttive ENFI il compito di un OPERATORE della scena del Crimine è: minimizzare/controllare la contaminazione Si parla di LUCE UV (ultravioletta) generalemtne per lunghezze d’ONDA: nessuna delle precedenti Si può estratte DNA NUCLEARE DAI CAPELLI: sì ma solo se è presente il bulbo Significato di “UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2017”: norma che accredita il grado di precisione ed accuratezza associati ad un risultato analitico Su una SCENA DEL CRIMINE l’EVIDENCECOLLECTOR deve dare priorità: alle tracce più “fragili” azzerare il valore probatorio del reperto o della traccia). Occorre sottolineare che la Catena di Custodia deve essere attivata sin dall’acquisizione dei campioni biologici a garanzia e tutela dei reperti affinchè non vi sia alcuna possibilità di manomissione, contaminazione o scambio.  Interpretazione dei RISULTATI di TIPIZZAZIONE di campioni provenienti da reperti e campioni diversamente CONSERVATI Per l’interpretazione dei risultati della tipizzazione genetica di campioni e reperti biologici si deve procedere in ordine: - Valutando le caratteristiche dell’elettroferogramma, attraverso l’opinione soggettiva di un esperto che valuti le caratteristiche qualitative e quantitative del campione, avvalendosi inoltre degli indicatori valutativi preimpostati nel software di genotipizzazione, - adottando procedure di interpretazione mirate, quali l’inclusione, l’esclusione e l’inclusività, volti a confrontare il profilo genetico in disamina con un campione di riferimento.  Cosa sono i POLIMORFISMI GENETICI E’ una variazione del DNA che può avere effetto fenotipico minimo e la sua frequenza è maggiore dell’1%. Solo una piccola frazione delle molecole DNA risulta essere variabile. E’ proprio questa percentuale di variabilità che rende ogni soggetto unico e che dà ai genetisti forensi la possibilità di determinare l’informazione contenuta nel DNA, quindi, di adoperarla per l’identificazione umana. Si possono avere piccole mutazioni in singoli nucleotidi sino a variazioni di Kb di DNA. Le mutazioni, però, non sono rare e non possono essere utilizzate in genetica forense perché scarsamente informative e dunque non funzionali allo scopo. I polimorfismi sono variazioni nella sequenza del dNA che si presentano nella popolazione con una frequenza >1% estremamente variabili e in grado di essere utilizzati come marcatori per discriminare tra soggetti diversi.  IDENTIFICAZIONE delle TRACCE biologiche descrizione dei test PRESUNTIVI e CONFERMATIVI Normalmente in una scena del criminine vi possono essere tracce più o meno evidenti di varia natura, per comprendere l’origine e la natura biologica di queste tracce è necessario ricorrere a dei test, questi possono essere PRESUNTIVI (molto sensibili ma poco specifici) o CONFERMATIVI (altamente specifici ma non sempre molto sensibili). I test presuntivi stabiliscono la possibile presenza di una sostanza di interesse nella scena del crimine (sangue, saliva, sperma etc) ma non sono in grado di specificare la natura della sostanza, sono in genere molto sensibili ma poco specifici. I Test confermativi servono per confermare la presenza di una particolare sostanza e stabiliscono la specie dalla quale deriva la traccia: ovviamente se di natura umana o meno. I Test confermativi sono altamente specifici ma non sempre molto sensibili.  Quali sono i DISPOSITIVI di PROTEZIONE INDIVIDUALE in un laboratorio di GENETICA FORENSE In un laboratorio di genetica forense al fine di evitare contaminazioni bisogna indossare i diversi dispositivi di protezione: -tuta con copricapo, -calzari, -mascherina, -guanti, occhiali e tutto deve essere rigorosamente monouso. Bisogna, altresì, indossare il camice e questo non va indossato spostandosi in aree diverse del laboratorio, inoltre non va assolutamente mai risposto in armadio insieme agli abiti dell’operatore. Esistono dei KIT ANTICONTAMINAZIONE. Per l’esecuzione dell’attività di repertazione utilizzare DPI e materiale monouso oppure sanificare con clorexidina. Evitare il contatto tra oggetti da repertare; maneggiare i reperti il meno possibile per minimizzare l’alterazione/dispersione della traccia e per limitarne l’esposizione ad agenti contaminanti. Evitare qualunque contatto con superfici che potrebbero causare contaminazione o comunque compromettere l’esito finale dell’esame della traccia.  Utilizzo del PROFILO Y negli accertamenti di CONSANGUINETA’ Il test di consanguineità basato sull’analisi del DNA può essere impiegato per l’identificazione di relazioni familiari. Il test è in grado di stabilire e confermare se due o più persone sono biologicamente correlate, cioè se sono tra loro parenti. In questi casi si analizzano i campioni prelevati da uno o più presunti parenti e da uno o più membri della famiglia. Soffermandoci sull’utilizzo del CROMOSOMA Y (Y-STR): possiamo affermare che è utile per la determinazione della relazione di parentela intercorrente tra persone di sesso maschile attraverso la loro linea paterna, consente, ad es. di accertare se uno o più fratelli siano o meno figli del medesimo padre. I soggetti di sesso maschile dispongono di due cromosomi sessuali: un cromosoma X ed un cromosoma Y (quest’ultimo si eredita esclusivamente dal padre), mentre il Cromosoma X deriva per via materna. E’ evidente che ogni individuo maschio erediti il cromosoma Y dal proprio genitore maschio, ovvero dal padre.  E’ possibile estrarre DNA dalle FORMAZIONI PILIFERE Ad oggi è possibile estrarre DNA dal sangue, dalla saliva, dai tessuti, dall’urina, dai denti e anche dai capelli. Possiamo affermare che è possibile estrarre DNA dalle formazioni pilifere. Innanzitutto va accertato che si tratti di formazioni pilifere e non di fibre inorganiche. Si procede con l’indagine di specie per stabilire l’appartenenza o meno alla specie umana. Il capello va quindi esaminato al microscopio, bisogna verificare la eventuale presenza del bulbo pilifero che fornirà importantissime informazioni relativamente alla fase del ciclo vitale in cui si trovava il capello al momento della caduta. Sulle formazioni pilifere vengono effettuati accertamenti macroscopici, microscopici e egenetiche mediante estrazione del DNA nucleare dal bulbo pilifero. L’analisi di estrazione del DNA è possibile solo se è presente il bulbo alla radice il quale rappresenta l’alloggiamento della papilla che, in definitiva, è l’organo produttore del pelo.  Cos’è il LUMINOL e come si UTILIZZA Il LUMINOL (nome commerciale BLUESTAR) è una sostanza chimica utilizzata per individuare tracce ematiche latenti, siano state esse dilavate o rimosse, usando la proprietà naturale della chemioluminescenza. Il colore del LUMINOL che reagisce alle tracce latenti è blu e la chemioluminescenza dura al più 30’’; per essere rilevata necessità della quasi totale oscurità; le tracce vengono rese visibili sotto forma di aloni con tipica colorazione blu brillante. Tuttavia il luminol reagisce anche con altre sostanze (rame, candeggina, piante ed alcuni tipi di terreno) e ciò da luogo ai c.d. falsi positivi. Si utilizza una soluzione acquosa costituita da una miscela di carbonato di sodio, sodio perborato e luminolo. Essi vengono opportunamente miscelati tra loro immediatamente prima dell’utilizzo della miscela. La miscela viene ora vaporizzata sulla superficie da esaminare. Ulteriore inconveniente del luminol è il fatto che la sostanza è tossica e va utilizzata opportunamente da tecnici specializzati dotati di opportune protezioni.  Cosa è l’ALLELE DROP-OUT Il fenomeno dell’allele drop-out è molto comune nei profili ottenuti dall’amplificazione degli STRs. In genere è causato da mutazioni o polimorfismi nella regione di annealing dei primers a livello di uno dei due cromosomi oppure da scarsa quantità di DNA. In questi casi l’ALLELE esiste nel campione ma non viene amplificato e quindi non può essere rilevato perché i primers non riescono a legarli al filamento complementare con la conseguenza che non verranno allungati dalla DNA-polimerasi. Ne scaturisce che un elemento eterozigote può apparire come elemento monozigote. In sostanza in caso di (ADO) non si riesce a vedere il contibuto genetico di uno dei due genitori.  Cosa è un GENE e cosa è un ALLELE Le differenti caratteristiche che può assumere uno stesso gene si chiamano alleli. Esiste una coppia di alleli per ogni carattere ereditario. Se gli alleli sono identici l’individuo è omozigote mentre quando sono diversi l’individuo è definito eterozigote. Un allele è una delle due o più forse alternative in cui può presentarsi un gene nel patrimonio genetico di una specie. Un gene è una porzione codificante di DNA, codifica per le proteine. Un gene è costituito da nucleotidi, è una porzione di DNA di lunghezza variabile che serve a dettare le informazioni utili per la sintesi proteica (a sua volta responsabile del fenotipo). Al suo interno troviamo ESONI ed INTRONI. Per le proteine la codifica avviene grazie agli esoni mentre si ritiene che gli introni siano responsabili del mantenimento dell’integrità del gene in caso di mutazioni. Gli alleli controllano uno stesso carattere ma possono portare a prodotti qualitativamente e quantitativamente diversi. Ad esempio in un fiore si possono avere colori diversi a seconda della quantità di pigmento prodotto dai rispettivi alleli. In questi casi bisogna tenere in considerazione debita anche i rapporti in cui gli alleli possono trovarsi tra loro, come ad esempio: dominanza completa, dominanza incompleta o anche codominanza.  A cosa serve il LUMINOL Il LUMINOL (nome commerciale BLUESTAR) è una sostanza chimica utilizzata per individuare tracce ematiche latenti, siano state esse dilavate o rimosse, usando la proprietà naturale della chemioluminescenza. Il colore del LUMINOL che reagisce alle tracce latenti è blu e la chemioluminescenza dura al più 30’’; per essere rilevata necessità della quasi totale oscurità; le tracce vengono rese visibili sotto  Che cosa è un TEST PRESUNTIVO ed un TEST CONFERMATIVO I test presuntivi sono molto sensibili ma poco specifici. I test confermativi stabiliscono la specie (solo se è umana) e sono altamente specifici ma non sempre altrettanto sensibili. Una volta individuata la traccia, potenzialmente, ematica, l’indagine forense deve porsi i seguenti questiti: -se è sangue, -se è sangue di che specie è, -se è sangue umano a chi appartiene. Alla prima domanda si può rispondere tramite i test presuntivi che però non forniscono mai una certezza sulla natura ematica del campione. Bisogna procedere con test confermativi che danno risposte alla seconda domanda. Alla terza troveremo risposta tipizzando il DNA in laboratorio. Dunque, i test confermativi vanno adoperati solo dopo il test presuntivo, in quanto i primi confermano che si tratta di tracce ematiche. Riassumendo: TEST PRESUNTIVI (luminol, leucomalachite e combur test) hanno bassi costi e rapidità ed immediatezza del risultato, sono scarsamente specifici, generano falsi positivi in presenza di perossidasi, vegetali ed alcuni disinfettanti altamente ossidanti; TEST CONFERMATIVI (seratec, hexagon OBTI), sono elevatamente specifici, hanno un costo elevato, generano falsi positivi col sangue di furetto, ape e altri primati.  Che cosa sono gli STR (short tandem repeats) L’analisi degli STR viene effettuata attraverso elettroforesi capillare. Il numero di STR è molto variabile da individuo ad individuo e consente di evidenziare un profilo genetico pressocchè unico. Si tratta dei marcatori più conosciuti e studiati nelle scienze forensi, sono anche detti microsatelliti o più noti come STR, per l’appunto. Sono corte sequenze nucletidiche (da 1 a 6 coppie di basi) ripetute in tandem nel DNA. L’elemento polimorfico è dato dal numero di volte con cui l’unità nucleotidica si ripete nel genoma, diverso da inviduo ad individuo. Essi occupano un locus genico che può esistere in eterozigosi quando entrambi gli alleli mostrano un numero diverso di ripetizioni oppure in omozigosi quando entrambi gli alleli presentano lo stesso numero di ripetizioni. Li classificheremo in base alle ripetizioni, così avremo: -ripetuzioni mononucleotidiche, dinucleotidiche, trinucleotidiche, tetranucleotidiche, pentanucleotidiche ed esanucleotidiche. Essi hanno dei vantaggi chiari rispetto ad altri marcatori: sono numerosi ed equamente distribuiti nel genoma, hanno un tasso di mutazione basso, sono altamente polimorfici. Sono anche facili da analizzare tramite PCR a causa delle loro ridotte dimensioni.  Che cosa si intende per PROFILO MISTO Si parla di profilo misto quando più persone contribuiscono con il proprio DNA, depositandolo nella medesima traccia. L’interpretazione di un profilo misto è molto complessa in quanto occorre produrre dei calcoli probabilistici per capire quanto un dato DNA sia presente in quella traccia. Da solo non basta bisogna procedere con una serie di altre analisi mirate.  Dove si possono trovare tracce di DNA Negli ultimi anni le innovazioni tecnologiche hanno permesso ai laboratori di eseguire l’analisi del DNA da qualsiasi tipo di traccia biologica ( es. piccole macchie di sangue, capelli, cicche di cigaretta, reperti ossei, piccoli frammenti di pelle o unghie, tracce di liquido seminale su indumenti, etc). Questo ha permesso che l’uso dei test del DNA per fini forensi sia diventato uno dei metodi di identificazione più frequentemente usati dai tribunali per risolvere diversi tipi di reati come furti, stupri, rapimenti e per la identificazione di resti umani.  Quali sono i PRESIDI MONOUSO da utilizzare per evitare la CONTAMINAZIONE Essi sono indicati con la sigla DPI che è l’acronimo di Dispositivi di Protezione Individuale (tuta protettiva in Tyvek completa di copricapo, guanti in nitrile, calzari, mascherina ed occhiali). Non basta indossare i DIP per scongiurare il pericolo di inquinamento: occorre anche che questi siano impiegati nel modo più corretto. E’ necessario ribdire che non cambiare i guanti dopo aver toccato un reperto o una traccia inevitabilmente è fonte di contaminazione dei successivi reperti. E’ utile ricordare anche che l’uso del camice non solo è obbligatorio ma non va riposto nello stesso armadio che custodisce gli abiti dell’operatore. Il trasferimento di campioni tra i vari ambienti deve avvenire tramite contenitori infrangibili e devono essere regolarmente decontaminati. Tra due ambienti del laboratorio esiste sempre una porta allarmata che impedisce la comunicazione diretta tra ambienti.  Quale è l’utilizzo delle LUCI FORENSI Le luci forensi sfruttano la fluorescenza dei fluidi biologici, la luce viene dapprima assorbita e poi riflessa dal materiale biologico. Consentono di rilevare residui organici di saliva, sperma e sudore. Le FLS (forensic light source) sono costituite da un generatore di corrente, un sistema ottico e/o di un laser in grado di generare una banda monocromatica. Le lampade devono essere utilizzate sin dalle primissime fasi dell’indagine in quanto potenziano l’osservazione. Nella fase di ispezione, infatti, grazie alla luce bianca -policromatica è possibile osservare sia caratteristiche generali della scena del crimine che quelle più dettagliate di singole tracce. Abbiamo due tipologie di ispezione: -ispezione con luce riflessa ed -ispezione con luce radente. Ispezione con luce riflessa: si usa su superfici fortemente riflettenti (vetro, ceramica, metallo). La traccia si evidenzia in quanto avremo delle porzioni più chiare dovute alla normale superficie riflettente e zone più scure dove la presenza della traccia provoca una riflessione più diffusa. Ispezione con luce radente: consente di evidenziare tracce che presentino un rilievo rispetto alla planarità della superficie; sono utilizzate anche per rilevare irregolarità della superficie dovute all’uso di utensili. Durante la ricerca delle tracce questa tecnica è elettiva in quanto consente di rilevare ,impronte di calzature, spostamenti di polvere, piccoli oggetti dispersi sul pavimento.  Revisioni processuali quando il DNA proviene da risultati non ben identificati nel caso in cui un profilo genetico, o miscela genetica, una parte del profilo misto o l’intero profilo misto non sono qualitativamente idonei per essere utilizzati ai fini di comparazione per l’identificazione e/o esclusione l’esito dell’analisi sarà una impossibilità a raggiungere un risultato utile (analisi conclusiva). L'indagine genetica - proprio in ragione del grado di affidabilità - ha piena valenza di prova, e non di mero elemento indiziario): nei casi in cui l'indagine genetica non dia risultati assolutamente certi, ai suoi esiti può essere attribuita valenza indiziaria. Nell'ipotesi in cui si pongano in termini di identità, gli esiti dell'indagine genetica assumono rilievo probatorio, mentre in caso di mera compatibilità con un determinato profilo genetico, hanno rilievo meramente indizia rio.  Cosa si deve fare quando ci si trova di fronte ad un PROFILO MISTO Occorre riscontrare una perfetta corrispondenza tra tutti gli alleli del soggetto con quelli estrapolati dalla miscela isolabili, a priori, come profilo genetico singolo; l’identificazione di un soggetto nel caso di profili genetici misti richiede la verifica della sussistenza della qualità dei dati e, quindi, l’estrapolazione, a priori (cioè prima dell’attività di comparazione), di uno o più profili genetici costituenti la miscela (utilizzando i soli dati qualitativamente idonei) e , solo allora, la verifica della sovrapponibilità del profilo ,di confronto con quelli desunti dalla miscela. Non è, invece, scientificamente corretto, per verificare se un soggetto di confronto abbia o meno contribuito alla miscela genetica, controllare la presenza dei suoi alleli senza aver prima individuato il profilo da confrontare.  Che cosa è la PCR La PCR è una tecnica di biologia molecolare che consente l’amplificazione di frammenti di acidi nucleici dei quali si conoscono le sequenze nucleotidiche iniziali e terminali. Con questa tecnica si ottengono grandi quantità di materiale genetico in poco tempo (circa 2 ore o poco meno). Il frammento di Dna a doppia elica da amplificare viene sottoposto a cicli di riscaldamento che hanno come conseguenza la separazione (denaturazione) dei due filamenti. Una DNA-polimerasi catalizza la sintesi dei frammenti complemntari ai primi due ggrazie alle sequenze di innesco (i primers) ed alla presenza di nucleotidi trifosfato. Le fasi della PCR sono: -fase di denaturazione (la soluzione di dna da replicare, -contiene nucleotidi, TAQ polimerasi, primer, ioni magnesio- viene portata ad una temperatura di 94-95°C vhe fa denaturare, cioè separare i due filamenti); -fase di appaiamento (annealing) la temperatura viene abbassata attorno a 50-60°C per favorire il legame tra primer e sequenze complementari poste all’estremità 3’ di ciascun filamento. - Fase di allungamento: la temperatura viene innalzata a 72°C per poter massimizzare l’efficienza della TAQ polimerasi che allunga i primers di innesco. Il ciclo viene ripetuto circa 30-40 volte. Al termine dell’ultimo ciclo c’è una ulteriore fase di allungamento intorno ai 70-74°C che dura circa 10’ in modo che ogni singolo filamento di DNA sia amplificato. E’ indispensabile l’uso del Termociclatore.  Che cosa è la certificazione UNI EN ISO/IEC 17025 di sangue intero non sarà trattato come una traccia di sangue, un capello o un frammento d’osso. Le tracce di natura biologica possono essere evidenti e quindi visibili ad occhio nudo oppure latenti ossia non visibili. Per l’individuazione delle tracce biologiche latenti, su di un reperto o sulla scena del crimine, si procede mediante le seguenti tecniche: impiego della lampada MINICRIMESCOPE 400; impiego del reagente LUMINOL; utilizzo di test generici o presuntivi.  Quale è il GENE MAGGIORMENTE STUDIATO in relazione al comportamento aggressivo e violento Analizzando il caso Bayout venne sottoposto all’analisi del DNA per la ricerca dei marcatori di polimorfismi associati in letteratura a comportamenti aggressivi. Tra i geni indagati vi sono: -quello codificante LMAOA, l’enzima MONOAMMINOSSIDASI-A di cui sono note attualmente 4 varianti alleliche associate ad un alto rischio di sviluppare comportamenti antisociali, -il gene che codifica per il trasportatore della SEROTONINA (SCL6A4), -il gene per il recettore D4 della dopamina, le cui varianti polimorfiche sono associate a comportamenti aggressivi ed iperattivi. L’analisi rilevò che l’imputato presentava almeno uno se non entrambi gli alleli nella forma tendente all’aggressività ed al comportamento antisociale, per tutti i polimorfismi indagati (come spiegò il perito Pietro Petrini ordinario di biochimica clinica presso l’università di Pisa).  Analisi di CONSANGUINETA’ e relazione nell’interpretazione dei PROFILI Consente di stabilire se due o più persone sono biologicamente correlate. Permette l’analisi dell’aplotipo del cromosoma Y (Y-STR) ed anche la ricerca del DNA mitocondriale (mDNA). L’analisi delle tracce biologiche si effettua: -nelle investigazioni criminali, quando occorre stabilire l’identità genetica della traccia stessa con un eventuale indagato o con la vittima del delitto (omicidio, lesioni, violenza sessuale); -nelle indagini di consanguineità: indagini di filiazione o indentificazione delle vittime di disastri di massa o comunque di cadaveri non identificati quando non potendo procedere all’identificazione dai resti o dagli effetti personali occorre ottenere il confronto dell’assetto genotipico dei tessuti biologici rinvenuti con quello dei parenti in linea diretta della vittima. Nelle indagini di filiazione permette di comprendere se due persone sono fratelli e sorelle, eventuali relazioni biologiche con i nonni, altresì, consente di valutare la possibilità che un soggetto sia zio o zia.  Come effettuare la QUANTIFICAZIONE del DNA Si tratta della quantificazione spettrofotometrica e della marcatura di fluorescenza UV in presenza di un colorante del DNA. E’ finalizzato alla determinazione del qauntitativo di DNA umano amplificabile e recuperato dal processo di estrazione. In genere si amplifica il DNA autosomico ed il DNA maschile, laddove fosse presente. Si tratta di una fase fondamentale nell’analisi di tracce forensi in quanto consente di comprendere sia la quantità che la qualità del DNA estratto e, quindi, permette di stabilire quale sia la strategia migliore di amplificazione che favorisca la giusta replicazione degli STR del DNA mediante immissione nella PCR di idonei quantitativi di DNA stampo. Nel caso di DNA proveniente da prelievi salivari generalmente il quantitativo di DNA ottenibile è standardizzato per cui la metodica sembra meno elettiva rispetto alla quantificazione di estratti di tracce forensi come quando si trovano in una situazione di complessità analitica (misture genetiche e/o tracce Low Template DNA).  Che cos’è la RANDOM MATCH PROBABILITY La probabilità di corrispondenza casuale (RMP) è un tipo di misura nella genetica della popolazione utile per misurare la probabilità di una persona non imparentata, scelta casualmente nella popolazione generale e corrispondente al genotipo derivato dall’evidenza. Un genotipo ha un numero di alleli ed ogni allele ha frequenza in una determinata popolazione. Questa frequnza è l’RMP di quell’allele. Per calcolare l’RMP di un certo genotipo si moltiplica insieme le frequenze degli alleli nel genotipo. Il risultato sarà l’RMP del genotipo. Nella scienza forense vengono raccolte le prove dalla scena del crimine e viene raccolto il genotipo delle prove del DNA. Questo viene successivamente abbinato al sospetto. L’RMP delle prove è utile per convincere la giuria , perché la probabilità che il genotipo delle prove e quelle del sospetto corrispondano sono molto basse e quindi difficilmente si potrà affermare che il sospettato sia innocente.  Identikit BIOLOGICO, è possibile ottenere informazioni sull’ASPETTO FISICO del proprietario di una TRACCIA di DNA Si chiama DNA-phenotyping. Può essere solo d’ausilio ma da sola non basta a risolvere un caso. La tecnica si chiama impronta digitale genetica e considera gli STR o microsatelliti. Come accadde per il caso Yara Gambirasio. Dal DNA si riesce a conoscere il colore degli occhi, quello dei capelli, l’etnia, grossomodo anche l’età. Il DNA di Bossetti (all’epoca sospettato) era stato portato negli stati uniti dove venne stabilito che la persona a cui apparteneva quel materiale genetico, avesse gli occhi azzurri. L’identikit biologico è ancora uno strumento a livello sperimentale. Un campo in continua evoluzione, ma ancora con dei limiti da superare. Tutti gli esami fatti in condizioni critiche possono essere discutibili. Casi in cui il Dna è molto degradato, dove ne abbiamo troppo poco oppure le salme sono in avanzato stato di decomposizione e qualche volta non si riesce ad ottenere un risultato. Queste sono ancora oggi le maggiori criticità.  Il DNA MITOCONDRIALE nel forense Il DNA mitocondriale (mDNA) rientra direttamente nella produzione di energia grazie ai mitocondri (vedi ciclo di Krebs). L’mDNA è più resistente rispetto a quello nucleare, nei mitocondri avviene la sintesi di ATP. L’mDNA si è evoluto dai batteri per endosimbiosi. Esistono alcuni casi in cui il dna nucleare non può essere estratto ed analizzato soprattuttoin presenza di prove biologiche molto degradate. In questi casi si deve ricorrere all’ausilio del mDNA. Essendo ereditato dalla madre ogni individuo entro una determinata linea materna avrà lo stesso mDNA della propria madre. Questo si rivela molto importante qualora l’unico profilo genetico a disposizione sia di tipo parentale. Nelle indagini forensi il potere discriminatorio del mDNA deriva dalla presenza di due regioni ipervariabili HVR1 ed HVR2. Dapprima bisogna sequenziare queste regioni nei campioni sottoposti ad esame e successivamente si confrontano i risultati con una sequenza standard di riferimento detta SEQUENZA DI ANDERSON. Se le differenze tra i campioni in esame e la sequenza di riferimento sono simili, allora vi è correlazione genetica tra essi.  Quali sono le FASI di ANALISI del DNA in ambito forense Le fasi dell’analisi del DNA sono le seguenti: 1. Rimozione di contaminanti esogeni, inorganici, organici naturali o di sintesi o biologici; 2. Pre- trattamento e diluizione inziale; 3. Rottura della membrana cellulare; 4. Rimozione delle proteine cellulari ed extracellulari tramite idrolisi e/o denaturazione; 5. Separazione del DNA puro. Si tratta di un processo fondamentale in ambito forense infatti Con l'introduzione delle; Legge del 7 dicembre 2000, n° 397, inerente la disposizione in materia di indagini difensive (c.d. giusto processo, anche la difesa può avvalersi; dell'ausilio di Laboratori specializzati privati per condurre attivamente tali accertamenti, alla pari della parte inquirente).  Le CIRCOSTANZE AGGRAVANTI ed ATTENUANTI: il peso della PROVA del DNA Le circostanze nel diritto penale possono essere identificate come elementi accidentali, che non sono indispensabili per la configurazione del reato, ma la cui presenza comporta una modificazione della pena. Esse si distinguono in attenuanti quandola loro presenza determina una pena minore ed aggravanti quando, invece, determinano una maggiore gravità del reato. Per quanto riguarda l’analisi del DNA oggi questo ha assunto nell’attività investigativa un ruolo determinante. Nei vari reati si possono confrontare le prove rinvenute nel luogo in cui è stato commesso, vale a dire che è possibile confrontare le varie impronte genetiche del sospettato con l’impronta genetica ottenuta dalle tracce del materiale biologico (saliva, capelli, sperma etc.). L’analisi del DNA per fini forensi è diventato uno dei metodi di identificazione più frequentemente usati dai tribunali per risolvere diversi tipi di reati. Ad oggi, la valutazione del profilo genetico viene svolta con kit che hanno un minimo di 17 marcatori. Con questi, se il profilo genetico che deriva dall’analisi tecnica è privo di anomalie o fattori critici, è possibile identificare il profilo genetico ed anche calcolare il “grado di unicità del profilo genetico all’interno della popolazione. Con i kit analitici oggi comunemente utilizzati – quelli a 17 marcatori – si è in grado di stimare l’unicità del profilo e, i calcoli biostatistici, consentono di arrivare a numeri ben oltre il miliardo. In termini agevoli, ciò significa che il profilo genetico riscontrato dall’analisi è “unico”, ovvero la probabilità casuale di trovare un soggetto con questo stesso profilo genetico (che non sia il donatore della traccia) è di 1 su svariati miliardi. del DNA nucleare; -i risultati dell’analisi con la loro relativa lettura ed interpretazione; -considerazioni sugli esiti ottenuti; -eventuale fascicolo fotografico; -i riferimenti bibliografici. Occorre sottolineare che il biologo forense non viene chiamato ad effettuare le ricerche in prima persona ma deve valutare il lavoro svolto da altri commentando ed esprimendo il proprio parere. Egli fornirà un elaborato contenente: -descrizione incarico; -considerazioni e discussioni sul lavoro svolto; -eventuali analisi biostatistiche dei risultati; - considerazioni conclusive; -riferimenti bibliografici. La lettura effettuata dal biologo forense servirà a minimizzare un approccio soggettivo alla interpretazione dei dati. La relazione tecnica prodotta dal biologo forense rappresenta una fonte di prova che acquisisce valenza probatoria sia nel procedimento penale che civile solo ed unicamente durante l’escussione testimoniale del testimone esperto 8cross- examination), inoltre, è interessante ricordare che l’indagine genetica deve essere inserita in un contesto investigativo e non possono sostituirsi ad esso. E’ fondamentale la contestualizzazione delle tracce esaminate. Ed ancora, il repertamento, ma soprattutto la conservazione e la catena di custodia devono essere osservati strettamente altrtimenti i reperti potrebbero essere esclusi dalle fonti di prova.  CONSERVAZIONE del REPERTO BIOLOGICO Massima accuratezza deve essere posta nel repertamento nel I sopralluogo in quanto si tratta della Scena del crimine meno contaminata. E’ fondamentale che gli incaricati della repertazione sulla SC siano dotati di tutti i presidi necessari per una corretta raccolta e conservazione delle tracce. Dovrebbero disporre di un KIT ALLESTITO pronto per le situazioni di emergenza utile a repertare senza contaminare i campioni biologici. Un kit-base dovrebbe comprendere: camice monouso, guanti in lattice (meglio nitrile), mascherina protettiva, cuffia copricapo, occhiali in plastica protettiva, provette e contenitori monouso, pinzette sterili incartate singolarmente, fogli di carta bibula sterile, bustine in carta e plastica sterili con possibilità di chiusura ermetica, etichette autoadesive, pennarello indelebile, targhette in cartone contrassegnate con le lettere dalla A alla Z e con numeri da 1 a 10, scocth adevivo in plastica e in carta. Ogni item dovrebbe contenere due unità di ogni dispositivo. E’ fondamentale fotografare il reperto prima della raccolta e dopo averlo sigillato. Il reperto può deperire facilmente ad opera di muffe e batteri e quindi è buona norma inserire in sacchetti di plastica solo reperti già essicati come i capelli, altrimenti è meglio utilizzare buste di carta che grazie alla porosità permette di evitare il proliferare di batteri anaerobi. Sottolineamo che la contaminazione può avvenire direttamente (ad es. semplicemente parlando nei pressi del reperto con deposito su di esso di saliva dell’operatore), indirettamente (materiale biologico presente su plichi che lo trasferiscono per contatto ad altri plichi).  Quali sono le ATTUALI TECNICHE DI ANALISI in uso in Genetica Forense In primo luogo una volta repertata la prova sulla SC, si procede alla definizione della natura della prova, se di tipo biologico o meno. Questa fase di screening viene definita come analisi di genere si avvale dell’utilizzo di lampade a luce polarizzata o allo xeno, con lunghezze d’onda differente, a seconda del tipo di traccia che si vuole identificare. Dopo aver stabilito che si tratta di tracce umane inizia l’analisi forense vera e propria con la Fase dell’estrazione del DNA e prosegue con l’amplificazione del materiale genetico tramite PCR, termina con la corsa elettroforetica. E’ proprio la combinazione di queste due ultime tecniche a determinare il profilo biologico di un individuo.  Cosa fare se il DNA è a BASSA CONCENTRAZIONE Bisogna effettuare la PCR. Questa è una tecnica che consente l’amplificazione e la moltiplicazione di frammenti di DNA nei quali si conoscono le sequenze nucleotidiche iniziali e finali. In meno di 2 h si ottengono grandi quantità di materiale genetico. La PCR ricostruisce in vitro il meccanismo di replicazione del DNA. Tramiti specifici cicli di riscaldamento si procede alla denaturazione (separazione) delle eliche di dNA. Ora interviene una DNA-polimersi che catalizza la sintesi di frammenti complementari ai primi due, grazie alla presenza dei primers (che sono sequenze di innesco) ed alla presenza anche dei nucleotidi trifosfato. Fase 1, DENATURAZIONE: la soluzione di DNA da replicare, contente nucleotidi, la TAQ polimerasi, i primers e gli ioni magnesio, viene portata ad una temperatura di 94-95° C, a questa temperatura la doppia elica di DNA si denatura e si ottengono i due filamenti che la compongono; Fase 2, APPAIAMENTO (annealing): la temperatura viene abbassata a 50-60° C, per favorire il legame tra primer e le sequenze complementari poste all’aestremità 3’ di ciascun filamento. Essi costituiscono il punto di innesco della TAQ-polimerasi; Fase 3, ALLUNGAMENTO (elongation): la temperatura viene nuovamente innalzata a 72° C per poter massimizzare l’efficienza della TAQ polimerasi, che allunga i primer di innesco, appaiando i nucleotidi complementari ai filamenti denaturati in partenza. Serve un apparecchio detto: TERMOCICLATORE. Il ciclo viene ripetuto circa 30-40 volte. Al termine dell’ultimo ciclo si aggiunge una ulteriore fase di allungamento attorno ai 70-74° C per circa 10-15 minuti per fare in modo che ogni singolo filamento di DNA sia stato amplificato.  Indagine genetica su DEFUNTO: come agire In Spagna nel 2018 è stato scoperto che il tempo trascorso dalla morte di un individuo influenza il profilo di attività dei geni nei tessuti considerati e ciò varia da tessuto a tessuto. Oggi il test del DNA è l’unico modo scientificamente valido per stabilire una relazione biologica tra due individui. Vi può essere anche il caso in cui il presunto padre è deceduto e la situazione si complica necessariamente. Intanto bisognerà capire da quanto è deceduto. Se il decesso è avvenuto di recente è possibile raccogliere alcuni campioni di tessuto o di capelli direttamente dal corpo per confrontare il DNA con quello del presunto figlio. Nell’arco di una settimana dal decesso il DNA non è ancora particolarmente deteriorato. Il problema viene a galla se, invece, sono trascorsi anni dal decesso. In questo caso è necessario chiedere la riesumazione del cadavere. Potremo raccoglier eun frammento di ossa lunghe di almeno 2 grammi o in alternativa almeno due denti. La riesumazione può essere chiesta dai parenti o dal tribunale in casi particolarmente delicati.  L’uso del DNA in INDAGINI FORENSI per i DISASTRI DI MASSA Nei disastri di massa la necessità di ottenere profili genetici è di rilevanza fondamentale per l’identificazione delle salme. Accade che l’identificazione tradizionale basata su caratteristiche antropologiche e fisiche delle vittime è inconclusiva perché spesso i resti sono decomposti, frammentati e mischiati. Per identificare dei resti viene effettuata l’analisi di comparazione, un procedimento che richiede dei campioni di riferimento della persona stessa oppure dei campioni dei suoi familiari. Quindi si procede al confronto dell’assetto genotipico tra vittima e parenti. Le finalità dell’analisi del DNA in questi casi sono: -identificazione delle vittime (comparazione del DNA con campioni di riferimento); -associazione delle varie parti del corpo (che a volte sono estremamente frammentati); identificazione dei colpevoli (potrebbero individuarsi tracce da contatto). Le difficoltà che si incontrano più frequentemente nei processi di DVI sono: -scarsità o degradazione del materiale genetico disponibile, -non omogeneità delle caraterristiche del materiale genetico, scarsa significatività dei campioni di riferimento.  Cosa si intende per “IDENTIFICAZIONE PERSONALE” in ambito forense Un mezzo potentissimo è l’esame dei polimorfismi tramite PCR che consiste nella amplificazione di DNA. L’analisi consiste in un prelievo di sangue periferico/tampone buccale, estrazione del DNA, determinazione del profilo genetico. Il sistema di identificazione genetico è comparabile a quello delle impronte digitali. Poiché il DNA profiling è in grado di fornire l’identificazione univoca di una persona può essere usato come base per l’identificazione delle sue relazioni con altri soggetti. Una volta prodotto il profilo genetico questo verrà custodito in una banca dati per un possibile uso futuro, spesso per dispute di eredità. Le applicazioni del DNA profiling includono: -identificazione degli eredi legittimi attraverso l’esame dei rapporti di parentela confrontando il profilo genetico custodito con quello ottenuto dai presunti eredi; -l’identificazione post-mortem in casi di decesso accidentale, rapimento, etc.  Quale è la STORIA della Genetica Forense Nei reati penali i genetisti forensi sono in grado di confrontare il DNA ottenuto dai campioni di origine biologica (urina, saliva, sperma, peli, capelli) con quello di uno o più sospettati. La comparazione del DNA ha lo scopo di funzionare come un ulteriore elemento di prova ai fini della colpevolezza o meno degli indagati. I presupposti per l’identificazione personale risalgono sin ai primi del ‘900 quando vengono scoperti i polimorfismi dei sistemi ABO, RH, HLA (antigene leucocitario umano) grazie a tecniche elettroforetiche ed immunologiche. Questa tecnica aveva lo svantaggio della rapida degradazione del sangue e richiedevano grandi quantità di DNA, peraltro erano molto dispendiose. Anche se la scoperta della struttura del DNA nel 1953 rappresenta un pilastro fondamentale della biologia, si deve al genetista JEFFREYS la scoperta negli anni ’80 del DNA fingerprinting (impronta digitale del DNA). Egli scoprì che alcune regioni del DNA contenevano sequenze altamente ripetute, e che la loro distribuzione non era uguale per tutti ma differiva da individuo ad individuo. Tali ripetizioni vennero identificate con l’acronimo VNTR (variable number tandem repeats), sequenze di DNA ripetute in tandem e presenti in numero variabile nel genoma. JEFFREYS utilizzava enzimi di restrizione che tagliavano il DNA in siti specifici creando frammenti di materiale genetico di lunghezza differente. La svolta decisiva si ebbe con l’invenzione della PCR nel 1983 effettuata da KARY B. MULLIS. Il principio su cui si basa la PCR era semplice: conoscendo le estremità iniziali e finali di una sequenza di DNA era possibile amplificare la quantità di materiale genetico a disposizione. Dagli anni ’90 la PCR viene utilizzata di routine e viene in soccorso anche nella risoluzione dei casi più complessi.  Quale è la MODALITA’ di PRELIEVO di un campione biologico da un VIVENTE Per sottoporre una persona al prelievo di materiale biologico bisogna avere il consenso della stessa. Per essere valido deve essere preceduto da una adeguata informazione; deve essere per iscritto ed espresso da persona maggiorenne e capace di intendere e di volere. Successivamente si comunica ai soggetti le modalità di gestione dei prelievi e degli estratti dopo le analisi. Si identifica il soggetto tramite documento di identità. Si possono utilizzare tutti i campioni biologici pur che siano rappresentativi dei sistemi da investigare. Si utilizzeranno sempre contenitori sterili, guanti, pipette monouso, rispettando anche il range delle temperature per la conservazione adeguata. E’ necessario, quindi, che il laboratorio disponga del campione siglato e raccolto in maniera idonea ed il modulo di richiesta interamente compilato. Tutto ciò assicura che: -venga eseguito l’esame necessario; -che siano puntualizzati i valori di riferimento in base al sesso ed all’età; -che siano valutate eventuali interferenze sul risultato; -che il risultato analitico sia prodotto nel minor tempo possibile.  Come si deve REPERTARE una TRACCIA BIOLOGICA Durante le fasi del repertamento gli operatori devono rispettare tutte le procedure anti-contaminazione. Le diverse tracce biologiche (saliva, sperma, sangue etc.) possono essere reperite sugli indumenti ma anche sul luogo del reato. Nel primo caso occorre conservare tutti gli indumenti singolarmente e ben asciutti in buste di carta o scatole di cartone a temperatura ambiente con sigillo identificativo del reperto. Nel secondo caso occorre effettuare dei tamponi con prelievo oro faringeo e successivamente riporli nella custodia o nelle provette sterili anch’esse con sigillo identificativo del reperto. Nel caso di violenza sessuale o di maltrattamenti occorre compilare una scheda analitica di negativi o falsi positivi. Controllo negativo : è composto da una miscela di reazione senza l’aggiunta di DNA stampo, al posto del quale viene aggiunto un bianco di estrazione, acqua o buffer, e serve per evidenziare eventuali contaminazioni che potrebbero riferirsi sia alla fase di estrazione del materiale genomico sia al momento di preparazione della PCR. Controllo Positivo : è un campione nel quale è sicuramente presente la sequenza bersaglio. Tale sequenza non deve contenere un numero di copie di sequenza target troppo alto (10^5 – 10^6) al fine di evitare di contaminare altri campioni (tramite la creazione di pericolosi aerosol) o sottostimare eventuali cali di sensibilità della reazione con conseguente produzione di falsi negativi. Il controllo positivo è un indicatore di fallimento o della mancata immissione di uno dei reagenti durante la fase di allestimento della PCR.  Norme e DISCIPLINA per il DISCONOSCIMENTO e ACCERTAMENTO della PATERNITA’ L’art. 235 cc (disconoscimento di paternità) richiama esplicitamente la possibilità di eseguire test genetici nel caso in cui sia stato commesso adulterio nel periodo compreso tra il trecentesimo ed il centottantesimo giorno prima della nascita, periodo utile per aversi un concepimento extraconiugale. L’art. 231 disciplina la paternità del marito, l’art. 232 cc disciplina la presunzione di concepimento durante il matrimonio, l’art. 233 cc disciplina la nascita del figlio prima dei centoottanta giorni dalla celebrazione del matrimonio. Il test di paternità viene solitamente effettuato sul trio padre presunto, madre e figlio per verificare la compatibilità tra i sistemi genetici del figlio e del presunto padre, acquisendo come certa la maternità e con essa la metà del patrimonio genetico del figlio. Esistono due casi possibili: Esclusione (il caso in cui vi è incompatibilità genetica tra presunto padre e figlio. Incompatibilità: assenza nel figlio di uno o dell’altro allele presente nel presunto padre eterozigote, presenza nel figlio di un carattere ereditario assente nel padre e nella madre e/o assenza nel figlio dell’unico allele presente nel presunto padre omozigote; Attribuzione: il caso in cui vi è corrispondenza genetica e quindi compatibilità tra presunto padre e figlio. L’analisi dei polimorfismi del DNA rappresenta l’unico mezzo di prova diretto e non presuntivo della paternità. Nel caso in cui venga accertata una incompatibilità tra padre e figlio si procede a calcolare la probabilità statistica della paternità. Chiaramente prima di questa fase si separa la componente materna del Dna da quella paterna (del possibile padre).  Quali sono le PRINCIPALI fonti di CONTAMINAZIONE dei CAMPIONI BIOLOGICI Premettendo che nessun processo è, a priori, esente da contaminazione da sorgenti di DNA esogeno rispetto alla traccia originaria si ha che il fenomeno della contaminazione diventa estremamente problematico quando interessa tracce “al limite” in quanto essa determina una irreversibile compromissione dello stato originario della traccia e ne rende il profilo genetico di difficile interpretazione e, spesso, assolutamente inutilizzabile per fini identificativi e comparativi. La contaminazione in genere è dovuta a piccole quantità di DNA e di scarsa qualità e questo implica che più bassa è la soglia di accettabilità (valore al di sotto del quale i segnali ottenuti non possono essere utilizzati per fini comparativi) del segnale elettroforetico stabilita, più alta è la probabilità di osservare segnali dovuti alla contaminazione. In definitiva: più basso è il livello di accettabilità di un profilo genetico, più è probabile che dall’analisi venga ottenuto un risultato dovuto ad una contaminazione, che comunque sarà difficilmente distinguibile dal DNA realmente derivante dalla traccia legata all’azione criminosa. Alzando la soglia di accettabilità di un segnale si può escludere la maggioranza dei segnali elettroforetici dovuti a contaminazione. Potenziali fonti di contaminazione sono: -operatori addetti all’attività investigativa (personale sanitario, personale di laboratorio che si occupa delle analisi); -contaminazione tra campioni (cross contaminazione), -contaminazione da DNA di precedenti analisi (contaminazione da Carry of products). Questi fattori possono essere ridotti notevolmente tenendo traccia di tutto il personale addetto sin dalla repertazione ed utilizzando tutti i dispositivi di protezione indicati nelle linee guida. Per ovviare a tali inconvenienti è buona norma ripetere la medesima analisi almeno due volte così che da garantire la riproducibilità dei risultati in serie analitiche differenti. Sono fattori di disturbo degli esiti: il tempo, il gran numero di soggetti coinvolti nei vari processi, la tipologia ed il numero di analisi eseguite che rendono il reperto esposto a numerose vie di contaminazioni.  Le fasi di REPERTAZIONE e CONSERVAZIONE di REPERTI di varia NATURA Con il termine “repertamento” si fa riferimento ad un insieme di attività tecnico scientifiche che ha l’obiettivo della raccolta e conservazione delle tracce per assicurarne l’integrità nelle diverse fasi del processo. Le fasi sono: -osservazione e descrizione della scena del crimine; - fissazione tramite fotografie e videoriproduzione, -esecuzione di schizzi e misurazioni degli ambienti, registrazione e documentazione delle prove fisiche, -verbale del sopralluogo e rappresentazione dei luoghi, -ricerca e repertazione delle tracce minime o latenti. L a raccolta della traccia ed il suo successivo confezionamento rapresentano i due momenti più delicati (flow chart). Inserire i reperti in busta di plastica solo se sono già secchi come ad es. nel caso dei capelli. Diversamente è consigliabile utilizzare buste di carta che essendo porose evitano la proliferazione di batteri anaerobi. I campioni biologici devono essere conservati a +4°C (al di sotto molte cellule come gli eritrociti scoppiano), per tempi brevi oppure a -20° C se ci si attende tempi più lunghi. Infatti, durante il repertamento,l’operatore incorre in: contaminazione (diretta o indiretta), proliferazione di muffe e/o batteri. Per porre rimedio a questi inconvenienti è necessario l’uso di DPI e materiale monouso e l’impiego di tecniche per asciugare o della catena del freddo. Le varie tipologie di raccolta sono le seguenti: raccolta a mano (consente di identificare la posizione di una particella), rimozione dell’oggetto (quando si ritiene di poterlo analizzare in laboratorio) , raccolta con pipetta (tracce liquide), raccolta con nastro adesivo, raccolta a mezzo di spazzola, raccolta a mezzo di tampone (lo swab attira le particelle e le sequestra) , raccolta mediante taglio (nel caso delle vernici), raccolta mediante l’esecuzione di un calco (ad esempio impronte di scarpe).  Indicare le CORRETTE MODALITA’ di prelievo ed identificazione di UNA TRACCIA BIOLOGICA A SCELTA La saliva, come liquido biologico, è presente su diversi oggetti, sigarette, sigaro, francobolli, buste, fazzoletti, bicchieri, chewing gum, passamontagne sciarpe, e pure in eventuali morsi sulla vittima. Essa è costituita da una parte cellulare contenente principalmente cellule epiteliali, immersa in un liquido di Sali, vitamine, ormoni, enzimi, proteine e anticorpi. Si può identificare tramite uso di FLS alla lunghezza d’onda tra 360-420 nm, considerando che è poco fluorescente. Per poterla riconoscere si ricerca un particolare enzima digestivo presente in essa: alfa-amilasi. Per identificarla esiste il test commerciale PHADEBAS che è poco specifico e genera falsi positivi con altre specie non umane. Esiste anche il test RSID-saliva (ontologicamente simile all’RSID-SEMEN) basato sull’immunocromatografia. La saliva và prelevata tramite tamponi imbevuti di acqua distillata, messi in delle provette sterili e trasportati in laboratorio avendo cura di rispettare la catena di custodia. Nel caso di un reperto piccolo come un mozzicone di cigaretta o un chewing gum è consigliabile prelevarlo rispettando l’iter del plico e della catena di custodia. Nel caso di una traccia ematica bisogna effettuare campionamento con carta assorbente. Se la traccia è secca va diluita. La traccia non deve essere molto estesa per evitare una eccessiva diluizione della stessa.  VALUTAZIONE PROBABILISTICA del peso dell’evidenza genetica La valutazione biostatistica del peso dell’evidenza nel caso di marcatori genetici uniparentali che non presentano ricombinazione genetica e che vengono trasmessi alla progenie in modo invariato (salvo eventi mutazionali) ed in blocco, cioè gli aplotipi Y-STRs e X-STRs nei maschi (nei maschi sia i loci X-STRs che Y-STRs, non ricombinando, si comportano come un unico gruppo linkage e vengono ereditati come aplotipi) e l’mtDNA è relativamente più semplice rispetto ai profili genetici autosomici STRs. In questi casi, ai fini della ponderazione dei risultati, gli aplotipi devono essere considerati come singoli marcatori polimorfici utili per giungere a tre tipi di conclusioni: Esclusione, Inconclusivo, Impossibilità. ESCLUSIONE: se si osservano almeno due differenze tra gli aplotipi del soggetto sospettato e della traccia biologica si può escludere che il soggetto sia il donatore della traccia biologica. INCONCLUSIVO: quando si osserva una sola differenza tra aplotipi del soggetto sospettato e della traccia biologica non si può arrivare ad alcuna conclusione con idoneo grado di confidenza (c.f.r. indice ed intervallo di confidenza in statistica). IMPOSSIBILITA’ AD ESCLUDERE: nel caso in cui si riscontri una completa corrispondenza tra aplotipi del soggetto sospettato e della traccia biologica non si può escludere che il soggetto sia il donatore della traccia biologica. Il metodo più diffusamente utilizzato per valutare il peso dell’evidenza è quello di calcolare la frequenza con cui un certo aplotipo compare in database popolazionistici di riferimento. Se con “n” si indica il numero di volte in cui un aplotipo viene contato in un database ed “N” la dimensione del database la frequenza dell’aplotipo sarà: p=n/N (numero di casi rilevati fratto il numero di casi rilevabili cfr: statistica probabilistica).  Cosa dicono gli studi RIGUARDANTI la PREDISPOSIZIONE genetica alla VIOLENZA La propensione a comportamenti impulsivo-aggressivi presenta una significativa base di natura genetica, motivo per cui varianti genetiche riguardanti neuro-modulatori chiave coinvolti nel controllo dell’aggresività (nel particolare: serotonina, dopamina, steroidi sessuali, glucocorticoidi e arginina vasopressina) rappresentano possibili marcatori biologici della predisposizione verso condotte criminali violente. Da questo scenario è originata l’ipotesio che fosse possibile realizzare test genetici applicabili in psichiatria forense, in grado di definire un profilo genetico di rischio che potesse rappresentare una prova oggetiva ed influire sull’imputabilità. Al termine delle ricerche: solo alcuni studi sono stati associati a condotte impulsivo-aggressive in modo univoco (SLC6A4 e MAOA) ma la varianza è stata stimata non superiore al 5% per la variante genetica con la maggior evidenza si associazione (5-HTTLPR). Si è cercato quindi di associare le varianti genetiche a comportamenti specifici di aggressività ed impulsività ma si è anche dovuto ammettere che questi atteggiamenti risentono in larga misura dell’influenza dell’ambiente (in particolare durante l’infanzia). I fattori biologici non hanno alcun ruolo deterministico verso lo sviluppo di condotte criminali violente. Un approccio integrato tra: variabili biologiche, psicologiche e sociali sembra essere il più adeguato per indagare un comportamento motivato umano.  Cosa SONO GLI studi RIGUARDANTI la PREDISPOSIZIONE genetica alla VIOLENZA La propensione a comportamenti impulsivo-aggressivi presenta una significativa base di natura genetica, motivo per cui varianti genetiche riguardanti neuro-modulatori chiave coinvolti nel controllo dell’aggressività (nel particolare: serotonina, dopamina, steroidi sessuali, glucocorticoidi e arginina vasopressina) rappresentano possibili marcatori biologici della predisposizione verso condotte criminali violente. caratteristiche della traccia e delle manipolazioni che subisce. L’esigenza è quella di garantire che non vi sia uno scambio; - Processuale: scaturisce dalla necessità di garantire in qualsiasi fase dell’accertamento l’acquisizione e la perfetta gestione della fonte di prova scevra da qualsiasi pericolo di manipolazione o ipotesi di manipolazione che potrebbe andare a diminuire o azzerare il valore probatorio. CTU e CTP (figure e ruolo, differenze e analogie) Sono due professioni ugualmente importanti, ma che vedono un ruolo differente sia a livello generale, sia nell’ambito della giustizia. Il CTU detto Consulente Tecnico d’Ufficio, e fa riferimento a quel professionista che si occuperà di lavorare a fianco del Giudice nei processi e nelle valutazioni. Collabora con il giudice e svolge figura di consulente prevista dal Codice di Procedura Civile, all’articolo 61, quale Pubblico Ufficiale. A livello generale, il giudice, dopo aver determinato i quesiti che saranno necessari al fine di chiarire le posizioni delle parti, si occuperà anche di sottoporre al CTU le sue domande. Il CTP, il Consulente Tecnico di Parte, la consulenza che renderà questo professionista non sarà dedicata al Giudice, ma ad una delle parti in causa, essendo anche privato cittadino. La nomina del CTP avviene allo scopo di ottenere un altro parere rispetto a quello del consulente tecnico d’ufficio. Il CTP potrà anche prendere in considerazione la documentazione prodotta dal consulente d’ufficio e fare critiche ed osservazioni specifiche a riguardo. Entrambi debbono mantenere il riserbo delle indagini. Le fasi di repertazione e conservazione di reperti di varia natura 1) Osservazione e descrizione della scena (scena primaria e scene secondarie!!!) 2) Fissazione tramite fotografie e video-riproduzioni. Tecnica complessa per la quale ci vuole una preparazione specifica 3) Esecuzione di schizzi e misurazioni degli ambienti 4) Registrazione e documentazione della posizione delle prove fisiche 5) Verbale di sopralluogo rappresentazione più fedele possibile dei luoghi, dell’ambiente e dei suoi contenuti 6) Ricerca e repertazione di tracce minime o latenti: -La ricerca non va eseguita in modo confuso o solo nelle vicinanze della vittima, ma deve essere effettuata in modo sistematico -Non esistono singoli metodi da applicare a specifici tipi di scene del crimine -La scelta del metodo di ricerca delle tracce spesso si basa sull’esperienza e sulla capacità tecnica e organizzativa della squadra operante. In sintesi: Ricercare – Identificare – Campionare/Repertare e Conservare, in ultimo minimizzare la contaminazione. Il DNA mitocondriale nel forense Le tecniche di genetica forense per l’identificazione personale utilizzano in genere il DNA nucleare, nel quale, per la ricombinazione genetica de DNA nei gameti maschili e femminili, le variazioni di frequenza sono più evidenti. Vi sono alcuni casi però, in cui il DNA nucleare non può essere estratto e analizzato, soprattutto in presenza di prove biologiche molto degradate. In questi casi si ricorre all’analisi forense sul DNA mitocondriale. Il DNA mitocondriale è più resistente di quello nucleare, consentendo di effettuare analisi anche a partire da reperti ossei molto antichi. In aggiunta, il DNA mitocondriale è presente in un numero di copie per cellula superiore rispetto a quello nucleare. Essendo, inoltre, il mtDNA ereditato unicamente dalla madre, ogni individuo entro una determinata linea materna avrà lo stesso DNA mitocondriale. Questo è importante qualora l’unico profilo genetico a disposizione per la comparazione sia di tipo parentale. Nelle indagini forensi, il potere discriminatorio del DNA mitocondriale deriva dalla presenza di due regioni ipervariabili, definite nell’uomo HVR1 e HVR2. Il procedimento prevede in primo luogo il sequenziamento di queste regioni nei campioni sottoposti ad esame e, in secondo tempo, il confronto dei risultati con una sequenza standard di riferimento, detta sequenza di Anderson. Se le differenze tra i campioni in esame e la sequenza di riferimento sono simili, allora vi è correlazione genetica tra essi. Come si imposta una relazione tecnica in ambito genetico La relazione è un elaborato mediante il quale il biologo forense rende noto del lavoro svolto. Generalmente è caratterizzato da: 1) Descrizione dell’incarico assegnato 2) elenco dei reperti oggetti dell’analisi tecnico-biologica con indicazione della catena di custodia 3) descrizione dell’ispezione dei reperti con descrizione delle caratteristiche morfologiche delle tracce e della loro struttura 4) le analisi effettuate e successiva tipizzazione dei polimorfismi di tipo STRs del DNA 5) i risultati delle analisi, la loro lettura e l’interpretazione di carattere biologico 6) le considerazioni e discussioni sugli esiti 7) fascicolo fotografico (eventuale) 8) riferimenti bibliografici. Diverso è il caso in cui viene chiamato a valutare l’elaborato di altri: 1) Descrizione dell’incarico 2) considerazioni sugli esiti ottenuti dal tecnico che ha svolto gli accertamenti 3) Eventuali analisi biostatistiche dei risultati 4) considerazioni conclusive e 5) riferimenti bibliografici. Dove si possono trovare tracce di DNA? Negli ultimi anni le innovazioni tecnologiche hanno permesso ai laboratori di eseguire l'analisi del DNA da qualsiasi tipo di traccia biologica (es. piccole macchie di sangue, capelli, cicche di sigaretta, reperti ossei, piccoli frammenti di pelle o unghie, tracce di liquido seminale su indumenti, tracce biologiche su oggetti di diversa natura, etc.). Questo ha permesso che L'uso dei test del DNA per fini Forensi sia diventati uno dei metodi di identificazione più frequentemente usati dai tribunali per risolvere diversi tipi di reati come furti, stupri, rapimenti, e per la identificazione di resti umani. Quali sono le fasi dell'analisi del DNA in ambito forense? Le fasi di analisi del DNA sono: Rimozione di contaminanti esogeni, inorganici, organici naturali o di sintesi o biologici; pretrattamento di eluizione iniziale – Rottura della membrana cellulare –rimozione delle proteine cellulari ed extracellulari tramite idrolisi e/o denaturazione e infine Separazione del DNA puro. Identificazione delle tracce biologiche descrizione dei test presuntivi e confermativi Sono definiti test “presuntivi” in quanto il riscontro, o meno, della presenza di un determinato marcatore biologico, nella traccia esaminata, sarà da considerarsi meramente indicativo e mai certo. I secondi, invece, sono caratterizzati da un elevato livello di specificità tale da rilevare, in modo certo, la presenza o meno del marcatore biologico ricercato. I test confermativi, attualmente impiegati sulla scena del crimine e in laboratorio per la diagnosi della natura ematica delle tracce, consistono in “saggi immunocromatografici”, il cui funzionamento è basato su una reazione immunologica tra l’antigene (emoglobina) e degli anticorpi monoclonali e policlonali anti-emoglobina umana. Quale è l’utilizzo delle luci forensi? La luce è il primo dei parametri da considerare nella conduzione delle indagini. Le FLS (forensic light source) sono costituite da un generatore di corrente e da un sistema ottico che può essere rappresentato da una lampada ad arco combinato con sistemi di reticoli e monocromatori per la selezione della banda e/o di un laser in grado di generare luce monocromatica. Le lampade devono essere impiegate sin dalle fasi iniziali di indagine in quanto potenziano l’osservazione. Nella fase di ispezione, infatti, grazie all’impiego di luce bianca-policromatica è possibile osservare sia caratteristiche generali della scena che quelle più dettagliate relative a singole tracce, specie laddove le condizioni di illuminazione solare non sono soddisfacenti. - Ispezione con luce riflessa: trova ampio utilizzo in caso di superfici fortemente riflettenti (vetro, ceramica, metallo). La traccia si evidenzia per il contrasto che si viene a creare tra le porzioni della superficie ove la riflessione è speculare (zone più chiare) e la porzione ove è presente il materiale della traccia che provoca invece una riflessione diffusa (zone più scure); - Ispezione con luce radente: consente di evidenziare le tracce che presentano un rilievo rispetto alla planarità della superficie sulla quale sono collocate o per evidenziare le irregolarità della stessa prodotte dall’azione di un utensile. La tecnica è elettiva durante le fasi di ricerca delle tracce in quanto consente di osservare impronte di calzatura, spostamenti di polvere, piccoli oggetti dispersi sul pavimento. Come effettuare la quantificazione del DNA La quantificazione del DNA è un processo finalizzato alla determinazione assoluta del quantitativo di DNA umano amplificabile recuperato dal precedente processo di estrazione. Solitamente vengono quantificati contemporaneamente il DNA umano autosomico ed il DNA maschile (qualora presente). Nel caso dell’analisi di tracce forensi da reperti biologici questa informazione risulta fondamentale per comprendere quale sia la quantità e la qualità del DNA nelle tracce estratte e, quindi, capire quale sia la strategia di amplificazione migliore per estrapolare un profilo genetico utile ai fini identificativi e comparativi e per favorire una corretta amplificazione dei polimorfismi STRs del DNA mediante l’immissione nella reazione di PCR di idonei quantitativi di DNA stampo. Nel caso dell’analisi di campioni biologici da prelievo salivare il quantitativo di DNA ottenibile è solitamente standardizzato per cui la metodica appare meno essenziale che nella quantificazione di estratti da tracce forensi, soprattutto quando queste di trovano condizioni di complessità analitica (misture genetiche e/o tracce Low Template DNA). Analisi di consanguineità e relazione nell’interpretazione dei profili L’analisi delle tracce biologiche si effettua: - nelle investigazioni criminali, quando occorre stabilire l’identità genetica della traccia stessa con un eventuale indagato o con la vittima del delitto (omicidio, lesioni, violenza sessuale); - nelle indagini di consanguineità, ovvero: o nelle indagini di filiazione, quando è necessario attribuire una madre o un padre a un figlio e, più in generale nelle indagini di parentela; o nell’identificazione delle vittime di disastri di massa (dovuti all’azione dell’uomo o provocati da calamità naturali), o comunque di cadaveri non identificati, quando il riconoscimento dei corpi è praticamente impossibile dal solo esame degli effetti personali o da altre caratteristiche somatiche e diviene indispensabile possedere un metodo investigativo basato sul DNA per l’identificazione di resti umani mediante il confronto dell’assetto genotipico dei tessuti biologici rinvenuti con quello dei parenti in linea diretta della vittima. Cosa è la Random Match Probability La Random Match Probability (RMP) stima la frequenza di un profilo genetico nella popolazione ossia la rarità di un set di alleli, esprimendo quanto quel profilo sia unico ed identificativo Quali sono i requisiti che un laboratorio forense deve possedere e rispettare Il laboratorio è stato progettato in modo tale da avere aree di lavoro separate per ogni tipo di analisi e per permettere un flusso unidirezionale del materiale dalle aree di laboratorio pre-PCR a quelle di post-PCR con lo scopo evitare possibili contaminazioni tra le diverse fasi analitiche. Tutte le stanze sono sterili e ad accesso controllato con un dispositivo di sicurezza allarmato che ne impedisce un’apertura impropria preservando l’ambiente interno sterile da quello esterno. Sono state realizzate due stanze adiacenti e comunicanti: una prima stanza, un’anticamera, dedicata all’accettazione dei reperti e in cui sono forniti tutti i dispositivi di sicurezza per gli operatori; il secondo ambiente assolutamente sterile, in cui viene svolta la prima fase dell’analisi con il campionamento dei reperti. Le due stanze sono separate da una porta allarmata che impedisce l’apertura simultanea delle due porte d’accesso, e quindi, la comunicazione della stanza con l’esterno, garantendone l’assoluta sterilità Le circostanze aggravanti e attenuanti: il peso della prova del DNA Le circostanze nel diritto penale possono essere identificate come elementi accidentali, che non sono indispensabili per la configurazione del reato, ma la cui presenza comporta una modificazione della pena. Esse si distinguono in attenuanti quando la loro presenza determina una minore gravità del reato comportando una diminuzione della pena e aggravanti quando determinano una maggiore gravità del reato e, conseguentemente, un aumento della pena. Per quanto riguarda l’analisi del DNA, oggi ha assunto nell’attività investigativa un ruolo spesso determinante. Nei vari reati in cui ci si trova davanti si possono confrontare le prove rinvenute nel luogo del reato vale a dire che è possibile confrontare le impronte genetiche del sospettato con le impronte genetica ottenuta da tracce di materiale biologico quali saliva, sperma, capelli ecc. L’analisi del Dna per fini Forensi è diventata uno dei metodi di identificazione più frequentemente usati dai tribunali per risolvere diversi tipi di reati. L’uso del DNA in indagini forensi per i disastri di massa Nei disastri di massa la necessità di ottenere profili genetici è di rilevanza fondamentale per l’identificazione delle salme. Infatti, molto spesso in questi casi, l’identificazione tradizionale basata su caratteristiche antropologiche e fisiche delle vittime è totalmente inconclusiva perché spesso i resti sono decomposti, frammentati e mischiati. Le finalità dell’analisi del DNA in questi casi sono: - Identificazione delle vittime (comparazione del DNA con campioni di riferimento) - associazione delle varie parti del corpo (che talvolta sono estremamente frammentati) - identificazione dei colpevoli (talvolta si possono individuare tracce da contatto). Le difficoltà che si incontrano più frequentemente nei processi di DVI sono: - Scarsità e/o degradazione del materiale genetico analizzabile - Non omogeneità nelle caratteristiche del materiale - Scarsa significatività dei campioni di riferimento Revisioni processuali quando il DNA proviene da risultati non ben identificati Nel caso in cui un profilo genetico, o miscela genetica, una parte del profilo misto o l’intero profilo misto non sono qualitativamente idonei per essere utilizzati ai fini di comparazione per l’identificazione e/o esclusione l’esito dell’analisi sarà una impossibilità a raggiungere un risultato utile (analisi inconclusiva). Banche dati Europee in ambito ENFSI Formalizzate dall' European Network of Forensic Science Institute (ENFSI), nel documento Norme e disciplina per disconoscimento e accertamento della paternità Le due azioni previste dall’Ordinamento in tema di accertamento della genitorialità biologica, anche in contrasto con quella legittima, sono rappresentate dal disconoscimento della paternità e dalla dichiarazione giudiziale di paternità. La cosiddetta analisi dei polimorfismi del DNA, ha, di fatto, sostituito, le precedenti analisi probabilistiche basate sull’utilizzo dei marcatori genetici, proprio in ragione dell’elevato grado di certezza in ordine al raggiungimento della verità biologica. Essa costituisce, come già osservato, l’unico mezzo di prova diretto e non presuntivo della paternità, divenuto sempre più frequente nella prassi giudiziaria e viene effettuata procedendo al confronto tra il profilo genetico del figlio con quello di entrambi i genitori; una volta individuate nel figlio le caratteristiche genetiche di provenienza materna, viene valutato se vi sia o meno corrispondenza con quelle di provenienza paterna e, in caso negativo, l’indagine si conclude con l’esclusione certa della paternità. Nel caso, invece, in cui venga accertata una compatibilità fra padre e figlio, viene determinata la percentuale di probabilità statistica che il soggetto in esame sia effettivamente il padre biologico. Il DNA, cosa è, dove si trova e come si utilizza in ambito forense L'acido desossiribonucleico è un acido nucleico che contiene le informazioni genetiche necessarie alla biosintesi di RNA e proteine, molecole indispensabili per lo sviluppo ed il corretto funzionamento della maggior parte degli organismi viventi. Il DNA è composto da due filamenti a forma di elica, uniti l’uno all’altro dalle cosiddette basi azotate, i cui nomi sono adenina (A), citosina (C), guanina (G) e timina (T). Queste 4 basi costituiscono l’alfabeto con cui è scritto il libro del DNA. I filamenti di DNA, lunghi fino a milioni di nucleotidi, sono contenuti nei cromosomi, a loro volta collocati nel nucleo di tutte le cellule. Il DNA costituisce, quindi, la base della trasmissione ereditaria dei caratteri. Inoltre, poiché rappresenta l'impronta genetica di ciascuno di noi, lo studio del DNA (per esempio nella medicina forense) estratto dal sangue, dalla saliva, dai capelli o da altri tessuti è ormai utilizzato per l’identificazione certa di ciascun individuo. La medicina forense si serve del DNA, generalmente isolato dal sangue, dalla pelle, dalla saliva, dai capelli e da altri tessuti e fluidi biologici, per identificare i responsabili di atti criminosi, come delitti o violenze. Il processo utilizzato è il fingerprinting genetico: tale tecnica consiste nel comparare la lunghezza delle sezioni variabili del DNA ripetitivo, come le short tandem repeats ed i minisatelliti, che possono risultare molto diverse tra un individuo e l'altro. La comparazione tra due campioni di DNA in esame, non si basa perciò sull'analisi di tutta la sequenza desossiribonucleotidica, ma solo su tali sezioni. Indagine genetica su defunto: come agire? Indagine genetica su defunto: come agire: oggi il test del Dna è l’unico modo scientificamente valido per stabilire una relazione biologica tra due individui. Vi può essere il caso in cui il presunto padre è deceduto allora la situazione diventa un po’ più complicata. Intanto, bisogna capire da quanto è morto. Se il decesso è avvenuto di recente, è possibile raccogliere alcuni campioni di tessuto o di capelli direttamente dal corpo per confrontare il Dna con quello del presunto figlio. Nell’arco di una settimana dal decesso, il Dna non è ancora così deteriorato. Il problema sussiste quando il decesso è avvenuto in tempi non recenti, vale a dire quando sono passati anni. In questo caso, per il test del Dna è necessario chiedere la riesumazione del cadavere. In questo caso è possibile raccogliere un frammento di osso, possibilmente dal femore o dall’omero del peso di circa 2 grammi, oppure almeno due denti. La riesumazione del cadavere può essere chiesta da un parente o anche in alcuni casi dal tribunale per delle indagini in corso riguardo a fatti di cronaca nera Conservazione del reperto biologico Al fine di evitare possibili contaminazioni crociate al momento dell’imballaggio dei reperti raccolti sulla scena del crimine, in linea generale, ogni reperto dovrebbe essere confezionato singolarmente e in contenitori/involucri adeguati per materiale (ad es. materiale traspirante per tracce non completamente essiccate) e dimensioni, avendo cura di portare il contenitore/involucro verso il reperto e non viceversa. Dipendentemente dalla natura del reperto e dal suo stato (reperto in condizioni di essiccazione, reperto bagnato, reperto deperibile a temperatura ambiente, etc.) occorre inoltre prontamente individuare le adeguate condizioni ambientali di conservazione (temperatura ambiente, 4°C, -20°C, etc.) Al fine di garantire la catena di custodia è infine fondamentale che ciascun reperto confezionato sia classificato in maniera univoca ed inequivocabile. La contaminazione può avvenire: 1) direttamente (ad esempio parlando liberamente sopra un reperto e depositando saliva) 2) indirettamente (ad esempio, materiale biologico presente sulla parte esterna di un plico contenente un reperto può essere trasferito sui guanti di un operatore, che aprendo il plico senza cambiarsi i guanti prima di maneggiare il contenuto trasferisce il materiale contaminante). Come si deve repertare una traccia biologica? Gli operatori, durante le operazioni di repertamento, devono adottare tutte le procedure volte ad evitare fenomeni di contaminazione. Le tracce di materiale biologico quali tracce di sangue, di sudore, sperma, saliva le possiamo trovare sugli indumenti, sul corpo della vittima e sul luogo dove è avvenuto il reato. In questi casi per procedere alla repertazione occorre nel primo caso, conservare tutti gli indumenti singolarmente ben asciutti e in buste di carta o scatole di cartone a temperatura ambiente con sigillo e relativo indentificativo del reperto. Nel secondo caso, riguardo al corpo della vittima, occorre fare dei tamponi da prelievo oro faringeo e successivamente riporli nella propria custodia o in provette sterili con relativo identificativo del reperto. Se ci troviamo davanti a violenze sessuali o maltrattamenti occorre compilare una scheda che contenga tutte le operazioni relative alla repertazione/custodia delle eventuali tracce biologiche; indicare le zone dove sono stati effettuati i tamponi e i prelievi, nonché l’elenco dei reperti raccolti, opportunamente classificati, e documentare, ove possibile, con rilievi fotografici tutte le operazioni di prelievo. È possibile estrarre DNA da formazioni pilifere Ad oggi è possibile estrarre dna dal sangue, dalla saliva, dai tessuti, dall’urina, dai denti e anche dai capelli; quindi, si può affermare che è assolutamente possibile estrarre dna da formazioni pilifere. Nell’ambito delle formazioni pilifere occorre accertare in primo luogo se si tratti effettivamente di formazioni pilifere o di fibre inorganiche. Si procede, quindi, effettuando l’indagine di specie al fine di stabilire l’appartenenza o meno alla specie umana. In seguito, i capelli devono essere esaminati al microscopio: dalle caratteristiche morfologico - strutturali e dall’eventuale presenza del bulbo pilifero è possibile stabilire la fase del ciclo vitale in cui il capello si trovava al momento della caduta. Sulle formazioni pilifere possono essere svolti analisi macroscopica (curvatura, lunghezza); analisi microscopica (colore, struttura, etc.); analisi genetica mediante estrazione del DNA nucleare dal bulbo. L’analisi di estrazione del dna è possibile solo è presente il bulbo posto alla radice, che costituisce l’alloggiamento della papilla, organo produttore del pelo. Quali sono le sostanze che si ricercano per identificare il liquido seminale Il liquido seminale rappresenta una traccia biologica estremamente importante perché spesso è associata a reati a sfondo sessuale. Il liquido seminale è costituito da cellule immerse in un mezzo liquido chiamato plasma seminale. La parte cellulare, rappresentata dagli spermatozoi, è prodotta all’interno dei tubuli seminiferi dei testicoli, mentre il plasma è prodotto dalla prostata. Infine, nell’eiaculato si riscontrano anche cellule immature provenienti dalla spermogenesi e cellule epiteliali di sfaldamento. Laddove la traccia non è visibile, le tecniche spettroscopiche rappresentano uno strumento estremamente utile. Difatti lo sperma ha la caratteristica di essere fluorescente. Lo sperma ha la sua massima emissione a 430 nm. La diagnosi ottimale per le tracce di sperma è verificata al microscopio, attraverso la quale si ricercano gli spermatozoi grazie alla loro forma tipica. Si può fare ricorso a test immunocromatografici in grado di confermare la presenza di liquido seminale anche in caso di soggetti azoospermici. Cosa è il trattato di Prum E' un trattato tra stati europei di cooperazione tra le Forze di Polizia internazionali. Con la Legge 30 giugno 2009, n. 85: "Adesione della Repubblica italiana al Trattato concluso il 27 maggio 2005 tra il Regno del Belgio, la Repubblica federale di Germania, il Regno di Spagna, la Repubblica francese, il Granducato di Lussemburgo, il Regno dei Paesi Bassi e la Repubblica d'Austria, relativo all'approfondimento della cooperazione transfrontaliera, in particolare allo scopo di contrastare il terrorismo, la criminalità transfrontaliera e la migrazione illegale (Trattato di Prum). Istituzione della banca dati nazionale del DNA e del laboratorio centrale per la banca dati nazionale del DNA Quali sono le sostanze che si ricercano per identificare il sangue umano Il sangue è un tessuto connettivo allo stato fluido. Nel corpo umano svolge due funzioni: trasporta le sostanze e difende dalle malattie. Le cellule principali sono gli eritrociti (globuli rossi), il loro compito principale è quello di trasportare ossigeno. Sono presenti anche i leucociti, in proporzione minore rispetto agli eritrociti, ma sono cellule contenenti nucleo e quindi DNA. Naturalmente si può fare ricorso a test chimici che, sfruttando le proprietà catalitiche ossidoriduttive dell’emoglobina, restituiscono una reazione chemioluminescente, è il caso del luminol o fluoresceina. Si può anche ricorrere a tecniche colorimetriche impiegando reattivi a base di Nero Amido. Cosa è il CODIS Il software che supporta l’impianto del database e permette l’organizzazione dei dati relativi al DNA nel sistema informatico si chiama CODIS (Combined DNA Index System) ed è stato fornito direttamente dall’FBI alla direzione centrale della polizia criminale italiana. Ciò si è reso necessario proprio a fronte della alta specificità e del particolare funzionamento che richiede un software per il corretto management di questo tipo di dati. Il CODIS operante in Europa, similmente al modello americano, ha tre livelli di organizzazione funzionale: - 1° livello, entro il quale i profili genetici sono materialmente elaborati e vengono immessi nel sistema; - 2° livello, entro il quale i profili genetici acquisiti in uno stesso Stato vengono immessi in un maxi-file che li raggruppa; - 3° livello in cui tutti i profili genetici provenienti dai file dei diversi stati sono riuniti. Qui sono possibili i riscontri comparativi, i quali sono funzionali anche se il campione registrato nel database e quello di riferimento che produce il match provengono da Stati diversi. Quali sono le sostanze che si ricercano per identificare la saliva La saliva è un fluido biologico composto da una parte cellulare contenente principalmente cellule epiteliali, ed è immersa in un liquido in cui sono presenti sali, vitamine, ormoni, enzimi, proteine e anticorpi. Come per gli altri fluidi biologici, l’utilizzo di FLS rappresenta il primo approccio teso alla ricerca ed individuazione della saliva, tra 360-420 nm, anche se la fluorescenza è estremamente bassa. I metodi diagnostici per l’individuazione della natura del fluido vanno a ricercare la presenza di à-amilasi, un enzima presente nella saliva. Esistono test commerciali come Phadebas, molto pratico e di buona affidabilità sebbene non specifico in quanto reagisce anche con altri fluidi biologici umani e con altre specie (topo, maiale). Contro la stessa proteina è stato allestito un kit commerciale RSID-saliva basato sull’immunocromatografia: presenta però falsi positivi al cospetto di latte, fluido vaginale, materiale fecale e saliva di alcune specie animali. Falsi negativi si ravvisano in presenza di alte dosi. Cosa è la banca dati del DNA La banca dati del DNA è uno strumento tecnologico che rende possibile un più efficace contrasto di taluni reati, o per affrontare i casi delle cosiddette “persone scomparse”. Prevede la raccolta di profili di DNA. Legge n. 85/2009, ha comportato l’elaborazione di un programma tecnico ad hoc proprio per rendere operativa la banca dati. Il software che supporta l’impianto del database e permette l’organizzazione dei dati relativi al DNA nel sistema informatico si chiama CODIS (Combined DNA Index System) ed è stato fornito direttamente dall’FBI alla direzione centrale della polizia criminale italiana. Quali sono le attuali tecniche di analisi in uso in Genetica Forense In genetica forense sono diverse le tecniche utilizzate nel processo di identificazione personale. In primo luogo, una volta repertata la prova sulla scena del crimine, si procede alla definizione della natura della prova, se di tipo biologico oppure no. Queste fasi di screening vengono definite come analisi di genere e si avvale dell’utilizzo di lampade a luca polarizzata o allo xeno, con lunghezze d’onda differente, a seconda del tipo di traccia che si vuole identificare. La fase successiva prevede, invece, l’analisi di specie, ossia lo screening per evidenziare la natura umana o meno della traccia biologica. L’analisi forense vera e propria inizia con la fase successiva, ovvero con l’estrazione del DNA, e prosegue con l’amplificazione del materiale genetico (PCR) e con la corsa elettroforetica. È proprio la combinazione di queste due ultime tecniche a determinare il profilo biologico di un individuo. Che cosa si intende per profilo misto Si parla di profilo misto quando più persone contribuiscono con il proprio DNA, depositandolo nella medesima traccia. L’interpretazione di un profilo misto è molto complicata in quanto occorre fare dei calcoli probalistici per capire quanto un dato dna è presente in quella traccia. Cosa si deve fare quando ci si trova di fronte ad un profilo misto Occorre riscontrare una perfetta corrispondenza tra tutti gli alleli del soggetto con quelli estrapolati dalla miscela isolabili, a priori, come profilo genetico singolo; l’identificazione di un soggetto nel caso di profili genetici misti richiede la verifica della sussistenza della qualità dei dati e, quindi, l’estrapolazione, a priori (cioè prima dell’attività di comparazione), di uno o più profili genetici costituenti la miscela (utilizzando i soli dati qualitativamente idonei) e, contemporaneamente in almeno l'1% degli individui nella stessa popolazione. Per essere classificati come tali, i polimorfismi devono occupare allo stesso tempo lo stesso habitat e appartenere ad una popolazione panmittica. Cosa è il luminol e come si utilizza Il luminol è un composto chimico utilizzato dalla Polizia Scientifica per rilevare il sangue, dai biologi e biochimici per la ricerca di rame, ferro e cianuro, e per permettere l'identificazione di specifiche proteine separate mediante elettroforesi. È una sostanza molto versatile che, mischiata con un appropriato agente ossidante, esibisce una chemiluminescenza bluastra. È un solido cristallino bianco o leggermente giallino solubile nella maggior parte dei solventi organici anche di uso comune, ma è insolubile nell'acqua. Che cosa è un test presuntivo ed un test confermativo Presuntivo: È un test che serve per determinare la natura della traccia biologica ma che potrebbe presentare falsi positivi, in quanto fornisce un'indicazione generica sulla natura della traccia in esame. Confervativo: E’ un test utile a determinare tracce biologiche in maniera certa. Che cosa sono gli STR (Short Tandem Repeats)? I marcatori genetici più conosciuti e studiati nelle scienze forensi sono i microsatelliti o STRs. Gli STRs sono corte sequenze nucleotidiche (da 1 a 6 coppie di basi) ripetute in tandem nel DNA. L’elemento polimorfico è dato dal numero di volte con cui l’unità nucleotidica si ripete nel genoma, diverso da individuo a individuo. Essi occupano uno specifico locus genetico sui cromosomi, formato da due alleli. Il locus genetico può esistere in eterozigosi, quando entrambi gli alleli mostrano un numero diverso di ripetizioni, o in omozigosi, se tutti e due gli alleli hanno lo stesso numero di ripetizioni. I microsatelliti vengono classificati secondo il numero di basi che formano l’unità che si ripete in tandem: si parla di ripetizioni mononucleotidiche, dinucleotidiche, trinucleotidiche, tetranucleotidiche, pentanucleotidiche ed esanucleotidiche. A differenza di altri marcatori, gli STRs presentano diversi vantaggi: sono numerosi ed equamente distribuiti nel genoma, hanno un tasso di mutazione basso e sono altamente polimorfici. In aggiunta, sono facili da analizzare tramite PCR a causa delle piccole dimensioni. Cosa sono i controlli positivi e negativi nella analisi del DNA L'allestimento di opportuni controlli di qualità permette di valutare la sensibilità e specificità della metodica, nonché di evidenziare la presenza di falsi positivi o falsi negativi. I controlli da utilizzare sono il controllo positivo e il controllo negativo. Il controllo positivo consiste in un campione in cui la sequenza bersaglio è contenuta. Tale controllo non dovrebbe contenere un numero di copie di sequenza bersaglio troppo alto. Ciò al fine di evitare di creare pericolosi aerosol che possano contaminare altri campioni o di sottostimare eventuali cali di sensibilità della reazione con produzione di falsi negativi. Il controllo negativo consiste in un campione in cui la sequenza bersaglio manca. Esso serve per evidenziare eventuali contaminazioni che potrebbero riferirsi sia all'estrazione del materiale genomico, sia al momento di preparazione della PCR. Quale è il gene maggiormente studiato in relazione al comportamento aggressivo e violento? Analizzando il caso di Bayout venne sottoposto all’analisi del DNA per la ricerca dei marcatori di polimorfismi associati in letteratura a comportamenti aggressivi. Tra i geni indagati: - quello codificante L-MAOA, l’enzima monoamminossidasi-A di cui sono note attualmente 4 varianti alleliche associate ad un alto rischio di sviluppare comportamenti antisociali; - il gene che codifica per il trasportatore della serotonina (SCL6A4) - il gene per il recettore D4 della dopamina, le cui varianti polimorfiche sono associate a comportamenti aggressivi ed iperattivi. L’analisi rilevò che l’imputato presentava almeno uno se non entrambi gli alleli nella forma tendente all’aggressività e al comportamento antisociale, per tutti i polimorfismi indagati come spiegò il perito Pietro Pietrini, ordinario di biochimica clinica presso l’Università di Pisa. Esistono due individui con DNA identico? La possibilità che due persone abbiano lo stesso DNA esiste nella teoria, tuttavia in realtà è praticamente impossibile che si verifichi questo evento, vediamo perché. Il DNA (acido deossiribonucleico) è formato da tre elementi basilari: acido fosforico, deossiribosio e basi azotate (adenina, guanina, timina e citosina), proprio queste ultime, legate tra loro, compongono due filamenti antiparalleli che vanno a formare una catena costituita da circa tre miliardi di coppie di basi, uguali a due a due. Considerando il numero totale delle coppie di elementi, la probabilità di avere due DNA identici è di 1 su 46.000.000.000. Questa possibilità aumenta leggermente tenendo presente che solo lo 0,1% di tutte le regioni del DNA è diverso da un individuo all'altro, dunque la statistica sarà infine di 1 probabilità su 46.000.000, un numero praticamente pari a zero. DNA molto simili sono quelli dei gemelli monozigoti (o monovulari), i quali presentano la stessa sequenza genetica. Nonostante ciò, essa funziona diversamente e varia a seconda dei fattori epigenetici, ovvero geni che vengono attivati o disattivati nel corso della vita, in base all'ambiente, alle abitudini e alle emozioni provate da ciascuno dei due individui. Ne consegue che, anche nel caso dei gemelli, il DNA non è mai praticamente identico. Quali sono i dispositivi di protezione individuale in un laboratorio di genetica forense I presidi monouso sono costituiti dai DPI ovvero dai dispositivi di protezione individuale (tuta protettiva in Tyvek completa di copricapo, guanti in nitrile, calzari, mascherina ed occhiali). Non basta indossare i dispositivi di protezione individuale per scongiurare il pericolo di inquinamento: occorre che questi siano impiegati nel modo più corretto (ad esempio, il mancato ricambio dei guanti prima di toccare una nuova superficie è una fonte di contaminazione: il DNA toccato una prima volta si trasferisce in tutte le varie superfici successivamente toccate con gli stessi guanti). Cosa dicono gli studi riguardanti la predisposizione genetica alla violenza Si tratta di una branca branca della psichiatria: le neuroscienze forensi. E' ragionevole ipotizzare che un coinvolgimento genetico influenzi e predisponga un soggetto verso certi atteggiamenti ma, in ambito di determinazione della pena, le neuroscienze sono state utilizzate per ridurre la responsabilità del reo e non per aumentare la pena in base ad una predisposizione genetica di un ipotetico gene killer. Inoltre nessuna variante genetica è peculiare di un certo tipo di popolazione, quindi non possiamo escludere che alcune di queste caratteristiche genetiche siano presenti anche nel DNA di altri soggetti che non si macchiano di crimini efferati. Chi era Edmond Locard Edmond Locard era un direttore del laboratorio di scienze forensi costituito a Lione nei primi anni del Novecento notò per primo questa particolare condizione delle tracce e formulò il c.d. “principio di interscambio”, che costituisce ancora oggi un dogma centrale della criminalistica: “Every contact leaves a trace” (1931), a voler dire che ad ogni contatto si lascia qualcosa di sé e/o si trattiene qualcosa dell’ambiente. Questo principio è sempre valido in quanto esprime una filosofia, un modo di approcciare alla scena del crimine che deve essere positivo, mentalmente aperto, culturalmente ricco e pronto a formulare e verificare ogni possibile ipotesi su ciò che si osserva e su quanto si ritrova. lOMoAR cPSD|9679654 3 E’ un test che consente di determinare se due persone sono legate tra loro da parentela, se sono fratelli o nipoti o hanno un altro grado di parentela. Questo test si basa sull’analisi del profilo genetico con l’aggiunta del cromosoma Y per la linea paterna ed altri test per individuare la linea familiare. Il test è in grado di verificare con esattezza se 2 persone sono biologicamente correlate. A COSA SERVE IL LUMINOL Il luminol, è una sostanza chimica che emette una luce quando reagisce con il perossido di idrogeno (acqua ossigenata) in presenza di un catalizzatore che di solito è un metallo, ferro o rame. Nel suo utilizzo, bisogna prestare attenzione in quanto una quantità troppo elevata, potrebbe degradare o distruggere la traccia biologica. L’operatore, con attenzione, spruzzerà la sostanza con un vaporizzatore sulla traccia, spegnerà le luci e osservano se appare una luminosità, una chemioluminescenza che dura circa 30 secondi Il luminol, serve per evidenziare tracce ematiche latenti, cioè non visibili ad occhio nudo. COS’E’ LA CONTAMINAZIONE Se una piccola traccia, che abbia cioè quantità/qualità scarse di materiale genetico fosse esposta a contaminazione, cioè trasferimento di DNA esogeno sulla stessa in un tempo successivo a quello dell’azione criminosa, questo potrebbe compromettere la traccia e potrebbe non essere più utilizzabile. Probabili fonti di contaminazione, potrebbero essere i tecnici e gli operatori di laboratorio. Proprio per questo, gli stessi devo utilizzare i DPI e materiale sterile, ovviamente monouso. Contaminazioni potrebbero esserci con residui di analisi precedenti, o contaminazioni tra campioni diverse. Per ovviare a questi rischi, è necessario che il laboratorio abbia stanze separate per poter effettuare analisi separate delle diverse tracce. Secondo le direttive ENFSI, un operatore della SC dovrebbe minimizzare/controllare la contaminazione. COS’E’ IL CODIS Combined DNA Index System. E’ il software che permette l’organizzazione dei profili del DNA che finiscono in un database, ed è stato fornito dall’ FBI alla polizia italiana, e serve per l’organizzazione e la raccolta di profili di DNA a livello informativo. Già negli anni ’90, l’FBI propone di creare un database che permettesse lo scambio informativo tra laboratori a livello nazionale, statale e regionale. Già nel 2003, conteneva un milione e mezzo di profili genotipici. Attualmente in Italia, è prevista la Banca Dati del DNA, prevede la raccolta di profili di DNA. CHI ERA EDMOND LOCARD Locard (1877-1966), era un criminologo francese. Fondatore del primo laboratorio di medicina legale a Lione nel 1910. Studiò anche le impronte digitali, in collaborazione con il metodo Bertillon (antropometria) e risolse il primo caso con le impronte digitali. Famoso per il suo principio, che prende il suo nome : “ogni criminale lascia qualcosa di sé sulla SC e porta via su di sé una traccia”. C’è quindi uno scambio. Il criminale lascia qualcosa di sé sulla SC e qualcosa della SC resta sul criminale. Facciamo come esempio, le tracce di scarpe sulla sabbia. Sulla stessa rimane l’impronta della scarpa e la scarpa porta su di sé della sabbia. Scrisse “Il trattato di polizia scientifica”, diviso in 7 volumi, che contiene degli scritti anche sull’indagine penale, sulle impronte digitali, sulla prova dell’identità, ed ancora oggi rappresenta le basi per le indagini scientifiche. COS’E’ UN POLIMORFISMO IN AMBITO FORENSE I polimorfismi di DNA di interesse forense, sono delle variazioni delle sequenze di DNA che sono diverse negli individui di una data popolazione. I Polimorfismi STR, sono polimorfismi di lunghezza, legati al numero variabile di unità ripetitive presenti nei diversi alleli. ANALISI DI CONSENGUINEITA’ E RELAZIONE NELL’INTERPRETAZIONE DEI PROFILI lOMoAR cPSD|9679654 4 Per quanto riguarda la fase della repertazione, innanzitutto va detto che gli operatori devono indossare in tutti gli ambienti, i DPI per evitare contaminazioni. Si può estrarre DNA da sangue, sperma, urina, capelli, saliva, denti. La repertazione deve essere fatta seguendo apposite metodologie e con accuratezza. Vanno anche fatte delle foto, va repertato il substrato, ecc. La deperibilità, è il limite principale dell’utilizzo del DNA per scopi forensi. Quindi per impedire la proliferazione di microrganismi decompositori (batteri, funghi, muffe), i reperti possono essere sia essiccati che congelati. Nel primo caso, l’acqua evapora e quindi cessa la vita dei microrganismi; nel secondo caso, la vita degli stessi viene rallentata fino a diventare assente. Il repertamento prevede la raccolta del materiale presente sulla SC e per la loro conservazione, vanno utilizzate buste di carta, previa asciugatura del reperto e nel caso di formazioni pilifero, possono essere utilizzate anche buste di plastica. Nel caso di saliva, va fatto un tampone faringeo e poi inserito in provette sterili. Nel caso di indumenti, vanno conservati separatamente, previa asciugatura, in buste di carta o scatole di cartone. COSA SI INTENDE PER IDENTIFICAZIONE PERSONALE IN AMBITO FORENSE L’identificazione personale, è quell’operazione che viene effettuata sui vivi, sui cadaveri o su resti di cadavere, per poter attribuire l’identità ad una persona o ad un cadavere o ai suoi resti. L’identificazione personale su viventi, viene fatta nel caso di latitanti, criminali, in caso di sospetta sostituzione di neonati, in caso di scambio di persona come nelle assicurazioni, ecc. L’identificazione della persona oggetto di indagine, è disciplinata dall’Art. 349 CP, anche se la L. 155/2005, ha apportato delle modifiche, come la possibilità per la Polizia giudiziaria di poter effettuare prelievi su capelli o saliva (per esami del DNA), con il consenso dell’interessato o coattivamente previa autorizzazione del PM. Per poter identificare un vivente, un cadavere, dei resti, è necessario avere un raffronto come foto, radiografie, schemi dentari, materiale biologico per tipizzazioni genetiche, ecc, appartenuti alla persona oggetto di identificazione. COS’E’ L’ALLELE DRO-OUT Il drop-out allelico, è la mancata amplificazione di un allele per effetti stocastici. Significa ritirarsi. Il fenomeno, consiste nella perdita rilevazione di uno dei 2 alleli, per cui un soggetto eterozigote, appare in realtà omozigote. VALUTAZIONE PROBABILISTICA DEL PESO DELL’EVIDENZA GENETICA E’ una condotta che serve per definire l’inclusione o l’esclusione, e richiede di accertare dei valori per fare un calcolo statistico. Uno riguarda le frequenze alleliche della popolazione di riferimento, che è quella in cui è avvenuto il fatto di interesse giudiziario; uno riguarda il parametro FST, che causa un aumento della frequenza di soggetti omozigoti; uno riguarda la probabilità del DROP-OUT e del DROP-IN. In campioni di DNA degradato, si può verificare la mancata amplificazione di un allele anche se presente (DROP-OUT) o l’amplificazione di un allele non presente (DROP-IN). COSA SONO I CONTROLLI POSITIVI E NEGATIVI NELL’ANALISI DEL DNA Senza il controllo positivo e negativo, non si può essere sicuri del risultato ottenuto con una PCR. Nel controllo positivo, vi è un campione che contiene la sequenza bersaglio (DNA noto) e ci si aspetta che dia un risultato positivo, cioè un amplificato. Se il controllo positivo non da un amplificato in seguito alla reazione di polimerizzazione, vuol dire ad esempio che la sostanza utilizzata non funziona come dovrebbe. Nel controllo negativo, nel campione non vi è la sequenza bersaglio, e quindi dovrebbe dare un risultato negativo. Se invece si ottiene un amplificato, vuol dire che c’è stata contaminazione, e quindi bisogna ricominciare da capo. LE FASI DI REPERTAZIONE E CONSERVAZIONE DEI REPERTI DI VARIA NATURA lOMoAR cPSD|9679654 5 Si parla di polimorfismo genetico, se la variazione genetica ha una prevalenza maggiore dell’1% della popolazione. Sono variazioni delle sequenze di DNA e possono essere utilizzati come marcatori per la discriminazione tra soggetti completamente diversi. CHE COS’E’ UN TEST PRESUNTIVO ED UN TEST CONFERMATIVO Su una SC si possono trovare tracce diverse e per capire la natura biologica della traccia, bisogna fare sia test presuntivi che test confermativi. I Test Presuntivi, rilevano la sostanza di interesse sulla SC ma non dicono quale è la natura della traccia, sono quindi più sensibili ma meno specifici. I Test Confermativi, confermano appunto la presenza di una certa sostanze e specificano la natura della traccia, ma solo se è di origine umana, sono quindi più specifici ma non sempre molto sensibili. RANDOM MATCH PROBABILITY Questa valutazione ci permette di distinguere, su base statistica, gli individui in una popolazione di riferimento. Si fa con la conversione del profilo genetico in sequenze alleliche. Diciamo che è una stima della frequenza x cui un profilo è presente in quella popolazione, e che un individuo preso a caso, possieda lo stesso profilo genetico della popolazione di riferimento. INDICARE LE CORRETTE MODALITA’ DI PRELIEVO ED IDENTIFICAZIONE DI UNA TRACCIA BIOLOGICA A SCELTA Le tracce di natura biologica, possono essere tracce EVIDENTI, visibili e tracce LATENTI, non visibili ad occhio nudo, e per le quali è necessario utilizzare delle tecniche per la loro individuazione, come ad esempio l’uso della lampada mini crimescope, il luminol, uso di test generici o presuntivi. Una volta che abbiamo identificato la traccia, nel caso il sangue, si esegue il campionamento con carta assorbente. La traccia repertata va poi fatta sciugare ed inserita in una busta di carta. Questa modalità, va bene per ogni traccia biologica fluida (sangue, saliva, sperma, ecc.). Nel caso di traccia biologica su un indumento, si reperterà previa asciugatura e poi inserita in una busta di carta o in una scatola di cartone, si potrà repertare anche l’intero oggetto, previo essiccamento. Per le formazioni pilifere, possono essere utilizzate buste di plastica. UTILIZZO DEL PROFILO Y NEGLI ACCERTAMENTI DI CONSANGUINEITA’ Questa analisi è utilizzata x accertare relazioni parentali per via maschili, se ad esempio 2 o più fratelli sono figli dello stesso padre, per determinare la relazione di parentela dal lato maschile, separare la frazione maschile da quella femminile nel caso di aggressione sessuale, che si effettua con l’estrazione differenziale, ricostruire le relazioni parentali collegate al padre, ecc. QUAL’E’ LA STORIA DELLA GENETICA FORENSE La storia della genetica forense, può dirsi iniziata intorno all’inizio del XX secolo con Karl Landsteiner che identificò i 4 gruppi sanguigni dell’uomo (A, B, AB e 0), dichiarando che le trasfusioni al loro interno erano sicure. Notò poi che alcune caratteristiche del sangue erano ereditarie, così nel 1912 furono usate x accertare alcuni casi di paternità. Questa tecnica però aveva dei limiti quando si trattava di campioni piccoli o degradati, o peli o macchie di sperma. Tutto cambiò nel 1984 quando il genetista britannico Jeffreys scoprì le tecniche di fingerprinting e profiling del DNA, che rivoluzionò la medicina legale. Altre tappe importanti, furono : 1932, venne creato il primo laboratorio dell’FBI; 1953, fu ipotizzata la struttura del DNA con Watson e Crick; 1959/1975 furono identificati polimorfismi enzimatici del siero umano; 1983, Kary Mullis inventò la PCR (reazione a catena della polimerasi che produce milioni di copie del DNA di base, per l’analisi del DNA), lavoro che pubblicò nel 1985; nel 1986, ci fu il primo uso del DNA x la risoluzione di un crimine; nel 1987, il DNA profiling fu introdotto nelle Corti americane; arriviamo al 2013, dove le tecniche di NGS (next generation sequencing) furono introdotte per la prima volta in genetica forense x casi di identificazione personale. COSA SONO I POLIMORFISMI GENETICI lOMoAR cPSD|9679654 COME SI PROCEDE QUANDO SI HANNO I PROFILI DI PADRE E FIGLIO IN UNA DETERMINAZIONE DI PATERNITA’ 8 Si analizzano entrambi i profili. Il cromosoma Y, serve x identificare la parentela maschile per via paterna. I soggetti maschi hanno sia il cromosoma Y che il cromosoma X. Il cromosoma Y si eredita solo dal padre, il cromosoma X dalla madre. Si usa l’aplotipo Y-Str nel test di discendenza paterna. LE CIRCOSTANZE AGGRAVANTI ED ATTENUANTI : IL PESO DELLA PROVA DEL DNA Le circostanze nel DP, sono elementi accidentali, che non sono indipsensabili per la configurazione del reato, ma che potrebbero portare ad una diminuzione della pena, nel caso di circostanze attenuanti, o ad un aumento della pena, a seconda della gravità del fatto, con le circostanze aggravanti. In questi casi, entra in gioco la prova del DNA, che ha assunto sempre maggior importanza e rilievo nell’attività investigativa. ESISTONO DUE INDIVIDUI CON DNA IDENTICO? Nella teoria sì, ma nella realtà è difficile che si verifichi tale evento. Questo perché il DNA è composto da 3 miliardi di coppie di elementi (basi) uguali 2 a 2. Perciò la probabilità di trovare 2 DNA identici è 1:46.000.000.000, cioè praticamente zero. I gemelli monozigoti hanno DNA simile, in quanto presentano la stessa sequenza genetica. Ma non troveremo neanche qui DNA identico. QUAL’E’ LA MODALITA’ DI PRELIEVO DI UN CAMPIONE BIOLOGICO DA UN VIVENTE Per prelevare un campione biologico da un vivente, occorre innanzitutto il suo consenso. Deve essere previamente informato e deve essere capace di intendere e di volere. Dovrenno essere usate per esempio pipette monouso, contenitori sterili, guanti, ecc. Comunque tutte le accortezze necessarie per evitare qualsiasi tipo di contaminazione. COSA SI INTENDO PER PROFILO MISTO Si ha quando più persone contribuiscono con il proprio DNA a depositarlo nella traccia. L’identificazione nel caso di profilo misto, è complessa, in quanto bisogna fare un calcolo probabilistico per capire quanto DNA di un soggetto è presente nella traccia. Quindi, è una miscela di fluidi di più persone. TERMINOLOGIA GENE : frammento di DNA che contiene le istruzioni traducibili in una proteina ALLELE : 2 o più forme alternative dello stesso gene. LOCUS : posizione di un gene o di un’altra sequenza significativa all’interno di un cromosoma. POLIMORFISMO : sequenza variabile di DNA con una frequenza maggiore dell’1% della popolazione. GENOTIPO : insieme di tutti i geni che compongono il DNA di un organismo o di una popolazione. FENOTIPO : insieme dei caratteri osservabili. APLOTIPO : detto del profilo del cromosoma Y. Gruppo di loci che si eredita tutto insieme. APLOIDE : che ha una sola serie di cromosomi. DIPLOIDE : numero di cromosomi presenti nel nucleo della cellula in doppia serie. 23+23. 2 copie per ogni cromosoma. DIPLOIDEMUTAZIONE : disfunzione dei geni (fenotipi patologici) lOMoAR cPSD|9679654