Regolazione genica dei procarioti ed eucarioti, Dispense di Genetica

Scarica Regolazione genica dei procarioti ed eucarioti e più Dispense in PDF di Genetica solo su Docsity! REGOLAZIONE GENICA NEI PROCARIOTI I batteri hanno evoluto nel tempo un meccanismo che permette loro di “regolare” l’espressione di determinati geni e quindi di “regolare” la sintesi del prodotto genico per il quale codificano. Un esempio è costituito dalla regolazione degli enzimi coinvolti nelle vie metaboliche degli zuccheri. All’interno di una cellula sono presenti due classi di enzimi: • Gli enzimi costitutivi sempre presenti nelle stesse quantità, poiché sempre necessari; • Gli enzimi inducibili che vengono invece sintetizzati all’occorrenza, in base a particolare condizioni; La cellula ha quindi sviluppato delle strategie per reprimere o indurre determinati enzimi, che in condizioni di crescita normale non sono necessari. La regolazione genica, può realizzarsi secondo due livelli ed entrambi si basano su meccanismi di interazione DNA-proteine; le proteine che interagiscono con il DNA si legano ad una determinata sequenza e sono perciò dette “sito-specifiche”. La regione di maggiore interazione con il DNA è rappresentata dal “solco maggiore”; la regione delle proteine che interagisce con la sequenza nucleotidica è chiamata “dominio”. L’interazione specifica si realizza poiché le proteine non riconoscono di per sé una specifica sequenza di basi, ma riconoscono dei punti di contatto associati a specifiche coppie di basi. Le proteine che realizzano queste specifiche interazioni contengono un altro importante sito, chiamato “sito allosterico”; l’allosteria è una caratteristica che permette alla proteina di cambiare la sua configurazione qualora venisse a contatto con determinati effettori. Il “sito allosterico” funge così da sensore e cambiando la sua conformazione, a sua volta, influenza il legame tra il dominio e il DNA in due modi: funzionale o non funzionale. CONTROLLO NEGATIVO – IL SISTEMA lac Si parla di “Controllo Negativo” quando vengono coinvolte proteine dette “repressori”, che contengono un sito allosterico per particolari molecole (“effettori”). Il controllo negativo si attua attraverso due meccanismi: la repressione e l’induzione. Nella “repressione”, una molecola che funge da “co-repressore” interagisce con il “repressore”, che viene attivato bloccando la trascrizione. Ad esempio, quando un microrganismo si trova in un terreno privo di arginina, questo sintetizzerà l’arginina attraverso le vie biosintetiche; qualora venisse però aggiunta dell’arginina al terreno di coltura, questa di comporta da “co-repressore”, legandosi al “repressore” ed inibendo la trascrizione dei geni coinvolti nella sua stessa biosintesi. L’”induzione” è invece il processo opposto, poiché in questo caso è una molecola effettore che stimola la sintesi degli enzimi coinvolti nella sua via metabolica. Un esempio di controllo negativo per induzione è rappresentato dal “Sistema lac”.  Sistema lac Questo sistema è stato uno dei primi ad essere caratterizzato sia dal punto di vista genetico sia dal punto di vista molecolare. Il meccanismo di regolazione dell’operone lac comprende diverse proteine codificate dall’operone stesso e particolari sequenze bersaglio sul DNA. Il componente principale affinché avvenga la trascrizione dei geni lac è la regione “promotore (P)”, che rappresenta il punto di inizio della trascrizione. Il “promotore (P)” possiede due regioni di legame per la RNA polimerasi e non codifica per nessun prodotto genico. Il metabolismo del lattosio necessita di due enzimi fondamentali: uno che consente il trasporto del lattosio dentro la cellula e un altro che invece consente la sua degradazione in glucosio e galattosio. L’enzima che scinde il lattosio è chiamato “β-galattosidasi”, mentre l’enzima che ne assicura l’assorbimento è chiamato “permeasi”; entrambi vengono codificati da due sequenze tra loro vicine. Vi è poi una terza sequenza che codifica invece per un altro enzima, che non è però coinvolto nel metabolismo dello zucchero. I geni strutturali che codificano per le sequenze adiacenti sono indicati con Z e Y, mentre, la terza sequenza è indicata con A. I componenti principali per la regolazione comprendono inoltre un altro gene che codifica per una proteina regolatrice e due siti di legame sul DNA: uno che funge da sito bersaglio per la proteina regolatrice e un altro sito che interagisce con l’RNA polimerasi. Oltre i geni strutturali è presente un quarto gene che codifica per la proteina repressore Lac, che è così in grado di bloccare la sintesi di tutti i gei strutturali. Oltre il sito promotore (P) è inoltre presente un sito “operatore (O)”, che funge da sito sul DNA per la proteina repressore; questa regione è posta tra i geni strutturali e il promotore (P). Nel complesso le sequenze promotore (P), operatore (O) e i geni strutturali costituiscono l’operone: un segmento di DNA che codifica per un RNA multigenico o policistronico. Il gene che codifica per la proteina repressore non fa parte dell’operone lac stesso, anche se la sua interazione con il sito operatore è cruciale per la regolazione dell’operone stesso. Il repressore agisce in maniera sito-specifica verso la sequenza di DNA dell’operatore e possiede anche un sito allosterico il cui effettore è il lattosio. Legandosi alla regione operatore, il repressore inibisce la trascrizione e quindi l’operone lac è “spento”. Nel momento in cui però viene aggiunto lattosio al mezzo, e questo si lega al sito allosterico del repressore, lo stesso repressore cambia conformazione, alterando di conseguenza il suo legame con il DNA; in questo caso, l’operone “lac” è acceso. La presenza di lattosio induce quindi la sintesi degli enzimi coinvolti nella sua degradazione; oltre il lattosio, vi sono anche altri suoi analoghi che fungono da “induttori”. Se però il lattosio viene rimosso dal mezzo si osserva una brusca e repentina interruzione nella sintesi della β-galattosidasi. I geni strutturali (Z,Y e A) sono stati mappati mediante ricombinazione e dai mutanti studiati si riuscì a comprendere che i tre sono strettamente correlati e concatenati sul cromosoma. Le diverse analisi sui meccanismi di regolazione del sistema lac, furono studiati inducendo delle mutazioni nei geni strutturali e negli elementi regolatori dell’operone lac. Per gli esperimenti, furono usati degli “induttori sintetici”, perché a differenza del lattosio, questi non vengono degradati e quindi non decresce la loro concentrazione cellulare; utilizzarono anche “Fattori F’” che trasportavano la regione contenente l’operone lac. In questo modo, crearono batteri parzialmente diploidi ed eterozigoti per i mutanti lac. La diploidia parziale fu sfruttata per distinguere le mutazioni localizzate nelle regioni regolatori dalle mutazioni che intaccavano il gene del repressore. Vennero identificate inizialmente due classi di mutazioni del sistema di regolazione, indicate come “OC” e “I-“ e che presero il nome di “mutazioni costitutive”, perché causavano l’espressione dei geni strutturali indipendentemente dalla presenza o meno dell’induttore. Queste mutazioni provocano un’incapacità nel repressore, che non è più in grado di legare l’operatore. Anche l’allosteria fu dimostrata esaminando un’altra classe di mutazioni che intaccava sempre il repressore; quest’altra classe fu indicata con “IS” e prese il nome di “super repressore”. La mutazione “IS”, si dimostra dominante sull’allele selvatico e produce un repressore che non è in grado di legarsi a nessun induttore; ciò significa che, anche in presenza di lattosio e quindi di induttore, la trascrizione viene comunque bloccata. Dal punto di vista molecolare, il funzionamento del sistema lac fu esaminato monitorando il legame di un induttore. In questi esperimenti è stato usato un analogo sintetico del lattosio che prende il nome di “Isopropil-β-D-tiogalattoside – IPTG”, che venne marcato radioattivamente. In vitro, si osservò che la proteina repressore si lega al DNA e si stacca da esso in presenza di IPTG. Il repressore può inoltre svolgere un ruolo di “protezione” nei confronti delle basi nucleotidiche che potrebbero essere danneggiate da diversi reagenti chimici. Questa caratteristica permise di isolare il segmento di DNA corrispondente alla regione operatore e di determinarne la sequenza; l’operone con annesso il repressore, venne trattato con l’enzima DNasi e dalla digestione si ottennero corti filamenti di DNA protetti dall’attività enzimatica. Questi piccoli frammenti corrispondevano alla regione operatore; venne poi effettuata una trascrizione dell’mRNA lac e quando ne venne identificata la sequenza, si notò che le prime 21 basi in posizione 5’ erano complementari alla sequenza operatore. Ciò portava alla conclusione che anche la regione operatore veniva trascritta.