Regolazione genica procarioti, Appunti di Biologia

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I  geni  possono  essere  regola-  a  diversi  livelli   •  trascrizione           •  post  trascrizione     (RNA  stability)             •  post  trascrizione  (controllo  della  traduzione)       •  post  traduzione  (non  considerata  regolazione   genica)       Il  “transcriptoma”   Quando  si  parla  di  regolazione  genica  ci  si  riferisce  alla  regolazione  trascrizionale     Nella  regolazione  genica  le  cellule  ba=eriche   devono  soddisfare  due  condizioni:       1.   Devono  poter  aEvare  o  inaEvare  in  modo  reversibile  la   trascrizione  di  ogni  specifico  gene  o  gruppo  di  geni.   2.      Devono  essere  capaci  di  riconoscere  le  condizioni  ambientali   che  richiedono  l’aEvazione  o  la  repressione  di  determinaH  geni     Controllo  delle  proteine  regolatrici  da  parte  degli  effe9ori   L’effe=ore  inibisce   il  legame  al  DNA   del  repressore   Se  l’effe9ore  a;va  l’espressione  genica  è  chiamato  indu9ore  e   l’operone  inducibile   Effe=ore  assente   Effe=ore  presente   AEvatore   Repressore   Sito  allosterico   L’effe=ore  promuove   il  legame  al  DNA   dell’aEvatore   •   Geni  cos-tu-vi       •   Geni  regola-     ü   Geni  inducibili  (es.  operone  Lac)   ü   Geni  reprimibili  (es.  operone  Trp)   Controllo  dell’espressione  genica  nei  procarioH   Jacques  Monod:  Nobel  per  la  medicina  1965     Teoria  dell’operone:  un  singolo  segnale  può  regolare   simultaneamente  l’espressione  di  molH  geni,  che  sono   raggruppaH  a  formare  un  cluster  sul  cromosoma  e   coinvolH  nello  stesso  processo.  QuesH  geni  possono   essere  trascriE  insieme  in  un  unico  mRNA  e  quindi  il   meccanismo  che  regola  la  trascrizione  di  questo  mRNA   influsce  su  tuE  geni  del  cluster       Il metabolismo del lattosio TTD Lattosio {B La permessi trasporta ND cellulare attivamente il lattosio nella cellula,... ì ne | se PB ...a) cui interno l'enzima 7 Permeasi Membrana cellulare p-galattosidasi lo scinde in galattosio e glucosio. CUD e, p-Galattosidasi Sd EB La p-galattosidasi [ Li . . opera altresì la B-Galattosidasi la + &b ON del Galattosio Glucosio lattosio nel composto . correlato allolattosio,... e, - -Galattosidasi Allolattosio B tdasi .. «trasformando l'allolattosio in galattosio e glucosio. In  assenza  di  la=osio  i  livelli  di  quesH  enzimi  nella  cellula  sono  molto  bassi.     In  seguito  all’aggiunta  di  la=osio  il  numero  delle  molecole  dei  tre  enzimi  aumenta  di   circa  1000  volte.     transacetilasi La  sintesi  degli  enzimi  b-­‐gala=osidasi,  permeasi  e  transaceHlasi  è   regolata  genicamente  e  dipende  dalla  presenza  di  la=osio  nel  terreno  di   crescita   Regolazione negativa degli operoni inducibili (a) Repressione Induttore “IH Trascrizione \ Repressore | mRNA XK inattivo _— [—;siccr"#@r__<" In assenza di lattosio GL } Repressore attivo In presenza di lattosio Assenza di trascrizione Mutazioni  lacI  -­‐   Sintesi  cosHtuHva  (produzione  dei  tre   enzimi  Lac  anche  in  assenza  di  la=osio)   IPOTESI   Il  gene  lacI  codifica  per  un  regolatore  negaHvo  o  repressore   Le  cellule  hanno  bisogno  di  questo  repressore  per  prevenire   l’espressione  dei  geni  lacZ,  lacY  e  lacA  in  assenza  di  un  indu=ore     Furono  isolate  anche  mutazioni  “regolaHve”   Incrocio  tra  i  ceppi:   Hfr  lacI+  lacZ+                x     F-­‐  lacI-­‐  lacZ-­‐   in  un  terreno  senza  la=osio   La  sintesi  di  β-­‐gal  cessava  dopo  un’ora   Esperimento  PaJaMo  (Pardee-­‐Jacob-­‐Monod):  prova  che  lacI   codifica  per  un  regolatore  negaHvo  (repressore)  dei  geni  lac     lacI-­‐  lacZ-­‐   lacI+  lacZ+  F -­‐   La  sintesi  iniziale  della  β-­‐gal  è  dovuta  all’espressione  del  gene  lacZ  nelle   cellule  F-­‐    che  sono  lacI-­‐.       Poi  cessa  perché  nella  cellula  si  accumula  il  repressore  LacI  in  seguito   all’espressione  del  gene  lacI+  introdo=o  dall’incrocio  con  Hfr.   lacI-­‐  lacZ-­‐   lacI+  lacZ+  F -­‐   Il  gene  O  fu    mappato  a  monte  dei  geni  lac         ü   P:  Sito  promotore,  dal  quale  l’RNA  polimerasi  inizia  la  trascrizione  di  un   mRNA  policistronico.  Il  promotore  agisce  in  cis,  influenzando  solo  la   trascrizione  dei  geni  lac  stru=urali  a  valle,  sulla  stessa  molecola  di  DNA   ü   O:  Sito  operatore  che  agisce  in  cis   ü      ü   lacI:  Il  repressore  agisce  in  trans,  e  può  legarsi  al  sito  operatore;  il   repressore  è  codificato  dal  gene  lacI,  che  è  separato  dall’operone.   ü   La9osio:  l’indu9ore  impedisce  il  legame  del  repressore  all’operatore   In  assenza  di  la=osio,  il  repressore  si  lega  al  DNA  del  sito   operatore  e  questo  legame  impedisce  la  trascrizione.  Il   repressore  funziona  quindi  da  elemento  regolatore  negaHvo.     MutanH  cosHtuHvi  lacOc   Il  repressore  non  può  riconoscere  la  sequenza  di  DNA  alterata  nel  sito   dell’operatore  dei  mutanH  lacOc  e  quindi  non  può  legarla  per  reprimere   l’operone.       Risultato:  i  geni  per  il  la=osio  sono  cosHtuHvamente  espressi.     Con  il  distacco  del  repressore  dal  sito  operatore,  l’RNA  polimerasi  può   accedere  al  promotore  dell’operone  lac  e  iniziare  la  trascrizione  dei  tre   geni  per  l’uHlizzo  del  la=osio,  formando  un  singolo  mRNA  policistronico.     Se  il  repressore  interagisce  sia  con  l’indu=ore  sia   con  l’operatore,  quali  effeE  vi  aspe=ereste  di   o=enere  da  mutazioni  che  aboliscono  solo  una  di   queste  due  interazioni,  senza  influenzare  l’altra?   Struttura del repressore Dominio di legame per il DNA Dominio di legame per l’induttore Estremità C-terminale        Mutazione  lacI-­‐     Il  repressore  agisce  in  trans   Repressore   non  aEvo   Espressione  cosHtuHva,  anche   in  assenza  di  indu=ore         Mutazione  lacIS     Evidenza  geneHca  dell’allosteria   Espressione  bloccata  anche  in   presenza  di  indu=ore   Il  repressoreS   non  può  legare   l’indu=ore   Il  repressore  agisce  in  trans   •   Gli  elemenH  che  agiscono  in  trans  (trans-­‐acHng)  possono   diffondere  nel  citoplasma  e  agire  sui  siH  bersaglio  di   qualunque  molecola  di  DNA  nella  cellula  (es.  repressore)   •   Gli  elemenH  che  agiscono  in  cis  (cis-­‐acHng)  possono   influenzare  solamente  l’espressione  dei  geni  adiacenH,   sulla  stessa  molecola  di  DNA  (es.  operatore)   lacI+  lacO+  lacZ-­‐   lacI-­‐  lacO+  lacZ+   F’   Diploidi  parziali  fenoHpicamente  selvaHci  per  l’espressione  della     β-­‐gala=osidasi,  repressa  in  assenza  di  la=osio  e  indo=a  in  presenza  di   la=osio   La  mutazione  lacIs   (super-­‐repressore.  La  proteina  codificata  da  lacIs  si  lega   all’operatore,  ma  non  è  riconosciuta  dall’indu=ore.)   Nei  diploidi  parziali  lacI+/  lacIs  l’allele  lacIs  è  trans-­‐dominante.  I  geni   stru=urali  possono  essere  repressi  ma  non  più  indoE.  Il  repressore  LacIS   è  dominante  su  quello  selvaHco  LacI+     lacIS  lacO+  lacZ-­‐   lacI+  lacO+  lacZ+   F’   Diploidi  parziali  con  espressione  cosHtuHva  della  β-­‐gala=osidasi,   il  sito  lacO+  sul  plasmide  non  ha  effe=o  sul  gene  lacZ+  che  sta  sul  DNA   cromosomico,  perchè  il  DNA  operatore  agisce  in  cis   lacI+  lacO+  lacZ-­‐   lacI+  lacOc  lacZ+   F’   Viene  definito  OPERONE  un  gruppo  di  geni  la  cui   espressione  è  coregolata  dalle  interazioni  della   proteina  regolatrice  con  il  sito  operatore,  dalla   regione  operatore  stessa  e  dal  promotore   Figura 16.3 Traduzione dell’'mRNA policistronico dei geni per l’utilizzazione del lattosio in (a) E. coli sel- vatico e (b) in un ceppo con una mutazione nonsenso nel gene per la }-galattosidasi (lacZ). a) Selvatico lacZ* lacY* lacA* , e DR = CT , Le subunità mRNA 5 del ribosoma / Î si dissociano Traduzione: Ì Start I Stop Start I Stop Start SIP Viene prodotta \J Viene \_} Viene prodotta PA prodotta nad R-galattosidasi i transacetilasi | permeasi | ribosomi scivolano | ribosomi si legano | ribosomi scivolano fino a lacA* all'mRNA e iniziano fino a lacY* e la traduzione cominciano la traduzione b) Mutante nonsenso lac2- Viene rilasciata una proteina p- galattosidasi incompleta; le subunità del ribosoma si staccano dall'mRNA lacZ _} mRNA 5° too," Mutazione nonsenso Controllo  posiHvo  dell’operone  lac   •   I  geni  lacZ,  lacY  e  lacA  sono  espressi  in  presenza  di  la=osio   solo  se  nel  terreno  non  è  presente  il  glucosio.  AltrimenH   questo  zucchero  viene  usato  preferenzialmente   •   Perché  E.  coli    su  un  terreno  che  conHene  glucosio  e   la=osio  non  inizia  a  trascrivere  i  geni  per  l’uHlizzo  del   la=osio?     •   Se  il  la=osio  è  presente  perché  non  agisce  da  indu=ore?     Le  proteine  di  regolazione  interagiscono  con  l’RNA  pol   (a)  Il  repressore  LacI,  legato  all’operatore,  impedisce  all’RNA  pol  di   legarsi  al  promotore.  C’è  una  sovrapposizione  tra  i  siH  di  legame  per   l’RNA  pol  e  per  il  repressore.  (b)  Il  complesso  CRP-­‐cAMP  entra   dire=amente  in  conta=o  con  l’RNA  polimerasi  aiutandola  a  iniziare  la   trascrizione.   Le mutazioni dell’operone /ac e i diploidi parziali di E. coli e Mutazioni nei geni strutturali: /acZ, /acY, lacA e Mutazioni che alterano la regolazione dell'espressione genica: lacl, lacO, lacP ZY ZVIZY ZVIZY B-GALATTOSIDASI (Z) Non indotta Indotta ni nei geni strutturali PERMEASI (Y) Non indotta Indotta  el gene regolatore: /acF -GALATTOSIDASI (Z) _ PERMEASI (Y) Non indotta Indotta Non indotta Indotta Fenotipo ZY _ + _ + inducibile PLY -_ - - repre PZYVINZY - _ _ PZYIS[ZY - - - Eterozigote /+/1S e 0000 } Il repressore /S non è IC dff in grado di legarsi all'induttore uil La mutazione /ac/S è dominante sul mutante /ac/” e sul selvatico lacl*  tazioni /ac O° B-GALATTOSIDASI (Z) _ PERMEASI (Y) Non indotta Indotta Non indotta Indotta Fenotipo O' Z° Y° - + - + inducibile O° Z° Y* + + costituti O'Z'YVIOZ"Y + + OZ YVIOZ"Y + + Genotipo B-Galattosidasi Induttore assente Permeasi B-Galattosidasi Induttore presente: Permeasi po z:r rpozr rpozy rpozry IsPpro* Z*:Y* EPOZ'Y* PP-O°Z-Y IPO Z:Y- 1 |P a |P Rep rpo*z'Y- rpo:z'Y Ep z-Y rpo'z*Y Hpro'z:Y° IFP-O*Z°Y- rpozy PPOZY rpozy rpoz*Y rpozy* BP-O°Z*Y° EP 0° Z+Y* po zY Ppoz:Y Ep-oZ'Y reozy Peo ZY- po zz PO}: Z*y TEBtOXZ:Yr PrO vzY TeP-063-:Y* L’a=enuazione  dell’espressione  genica:   regolazione  fine  dell’operone  trp  a=raverso  la   terminazione  della  trascrizione   a 1 COOH oi 7 o L- “qiutsmmina Ha0=C-COOH O A Duo Fa een 9 Oro. c go co CH. OP» H Das N CH © HH sora SI "ET H la OP C-C-COOH ORfs (n H L-Serina L’a=enuazione  nell’operone  del  triptofano  di  E.  coli     Nell’mRNA  dell’operone  trp  sono  possibili  due  diverse  stru=ure  secondarie:       1.   La  forcina  che  si  forma  per  la  complementarità  delle  basi  tra  le  regioni  1  e  2   perme=e  la  formazione  della  forcina  3  e  4,  che  rappresenta  un  segnale  di   terminazione  per  l’RNA  polimerasi.   2. L’appaiamento  delle  basi  tra  le  regioni  2  e  3  impedisce  la  formazione  della  forcina   3-­‐4.  Nella  parte  iniziale  del  trascri=o  ci  sono  due  codoni  per  il  trp.     Quando  è  presente  il  triptofano,  il  ribosoma  procede  spedito  lungo  il   trascri=o,  impedendo  la  formazione  della  forcina  2-­‐3.  Può  quindi   formarsi  la  forcina  3-­‐4  e  la  trascrizione  si  arresta.     Quando  il  triptofano  è  assente,  il  ribosoma  temporeggia  in   corrispondenza  dei  codoni  trp,  perme=endo  la  formazione  della  forcina   2-­‐3  che  impedisce  l’appaiamento  tra  le  regioni  3-­‐4.  In  queste  condizioni   la  trascrizione  va  avanH.