Replicazione del DNA e DNA polimerasi, Appunti di Biologia Molecolare

Scarica Replicazione del DNA e DNA polimerasi e più Appunti in PDF di Biologia Molecolare solo su Docsity! Caratteristiche generali La replicazione del DNA è un processo estremamente efficiente in primis, che nelle cellule eucariote richiede qualche ora. Inoltre, è un processo estremamente accurato, questo perché se la cellula fa un errore nella duplicazione del DNA, e l’errore non viene immediatamente risolto, non c’è possibilità di turnover, e l’errore rimane, diventando mutazione che viene trasmessa alle cellule figlie. Per questo motivo, il tasso di errore è di 10-9/10-10, grazie alla presenza di efficienti sistemi di correzione. La replicazione del DNA è semiconservativa. Ciò vuol dire che ognuno dei due filamenti dell’elica parentale serve da stampo per un nuovo filamento. Si vengono così a creare due coppie eliche figlie: ciascuna doppia elica contiene un filamento appena sintetizzato, e uno vecchio, cioè lo stampo. Per comprendere questo, fu fatto un esperimento: Venne fatta crescere una coltura di batteri in un terreno con azoto ¹⁵N, cioè un isotipo pesante dell’azoto. Crescendo in questo terreno, i batteri sintetizzano nucleotidi più pesanti, inseriti nel DNA. Il DNA quindi contiene questi nucleotidi pesanti dopo qualche ciclo di replicazione. A questo punto, la coltura venne trasferita su un terreno con azoto ¹⁴N, più leggero. L’ipotesi semiconservativa fu confermata, cioè il DNA finale aveva un filamento pesante e uno leggero. DNA polimerasi Classificazione La prima DNA polimerasi fu scoperta poco dopo la scoperta della struttura del DNA. D allora, la famiglia delle polimerasi è diventata molto ampia. Esse in generale catalizzano la sintesi del DNA sulla base di un filamento stampo. L’enzima utilizza come substrati i deossinucletodi 5’-trifosfato (dNTP), aggiunge un dNMP (nucleotide monofosfato) al 3’-OH del filamento in via di sintesi, formando un legame fosfodiesterico, e liberando pirofosfato. La DNA polimerasi attua anche procedure di controllo, proofreading, che si basa sulla sua attività esonucleasica 3’-5’, che elimina gli ultimi nucleotidi aggiunti nel processo di sintesi. DNA polimerasi procariotiche Enzima Funzione Attività esonucleasica DNA polimerasi I Riparazione del DNA, replicazione 3'-5' e 5'-3' DNA polimerasi II Riparazione del DNA 3'-5' DNA polimerasi III Principale fattore replicativo 3'-5' DNA polimerasi IV Riparazione del DNA, 3'-5' DNA polimerasi V Riparazione del DNA, 3'-5' DNA polimerasi eucariotiche Enzima Funzione Attività esonucleasica DNA polimerasi α Primo allungamento degli inneschi di RNA No DNA polimerasi β Riparazione del DNA e "gap filling" 5'-3' DNA polimerasi γ Replicazione del DNA mitocondriale 5'-3' DNA polimerasi δ Sintetizza il DNA sia sul filamento lagging 3'-5' DNA polimerasi ε Sintetizza il DNA sul filamento leading 3'-5' DNA polimerasi γ. Replicazione del DNA mitocondriale DNA polimerasi δ Si occupa di eliminare i Primer ad RNA, mediante azione esonucleasica 5' -> 3', e di sostituirli con nucleotidi a DNA mediante azione polimerica 5' -> 3'. Agisce sul filamento lagging. DNA polimerasi ε Si occupa della duplicazione del filamento leading di DNA, associata alla DNA polimerasi alfa. Possiede attività polimerica 5' -> 3'. Struttura della DNA polimerasi Tutte le DNA polimerasi condividono una subunità catalitica, che ricorda una mano destra, con un pollice, le dita, e un palmo. Il palmo, rappresentato da un dominio foglietto β, è la sede in cui avviene il legame fosfodiesterico, e dove risiede l’attività esonucleasica 3’-5’. Le dita catturano i deossinucleosidi trifosfato che vengono incorporati nella catena, e stabilizza il legame. La stabilizzazione del complesso inoltre è possibile solo se è appaiato un corretto dNTP. Le dita si chiudono sul palmo dell’enzima, trattenendo il dNTP, se è quello corretto, permettendo la formazione del legame fosfodiesterico. Quando il legame è avvenuto, le dita si aprono e rilasciano il pirofosfato; inoltre, l’apertura delle dita permette alla DNA polimerasi di scorrere di una posizione sul filamento stampo. Il pollice stabilizza la struttura Il nucleotide corretto ha un’affinità maggiore per la polimerasi in movimento del nucleotide non corretto, perchè l’appaiamento corretto è più favorevole energeticamente. Inoltre, dopo l’attac- co del nucleotide, ma prima che il nucleotide venga aggiunto covalentemente alla catena in crescita, l’enzima deve subire un cambiamento conformazionale in cui le sue “dita” si stringono intorno al sito attivo (vedi Figura 5.4). Poichè questo cambiamento avviene più facilmente quando l’appaiamento è corretto, esso permette alla polimerasi un “doppio controllo” dell’esatta geometria di appaiamento delle basi prima di catalizzare l’aggiunta del nucleotide. Nucleotidi appaiati non correttamente sono più difficili da aggiungere, quindi è più probabile che si allontanino prima che la polimerasi riesca erroneamente a inserirli nella sequenza. Formazione del legame fosfodiesterico Per iniziare la sintesi, la DNA polimerasi ha bisogno di una cosiddetta giunzione innesco stampo, cioè un’estremità 3’-OH di una sequenza nucleotidica legata al filamento stampo su cui la DNA polimerasi possa legare il 5’ fosfato del deossinucletide da inserire, per formare il legame fosfodiesterico. Questa giunzione iniziale è formata da RNA, un primer, sintetizzato dalla primasi. Rimosso il pirofosfato, questo viene immediatamente trasformato in due ioni fosfato, reazione estremamente esoergonica, che quindi rende praticamente irreversibile la reazione inversa. Inoltre partecipano anche ioni metallici bivalenti. Solo quando si forma una corretta coppia di basi, l’ossidrile in 3’ dell’innesco e il fosfato a in 5’ del nucleotide che dovrà far crescere la catena, saranno allineati in maniera tale da essere in una posizione ottimale per creare il legame fosfodiesterico tra l’OH in 3’ e il fosfato in 5’ dello zucchero del nucleoside che stiamo aggiungendo. Nel caso in cui si dovesse aggiungere un nucleoside non corretto, l’OH e il fosfato (Pi) del nucleoside che dovrebbe far allungare la catena, non si troverebbero in una posizione ottimale per poter formare il legame fosfodiesterico. Ciò determinerà un forte abbassamento della velocità di sintesi del DNA. Questa polimerizzazione sfavorevole porterà quindi a una riduzione della velocità, di un fattore pari a 10000. Se il desossinucleotide trifosfato aggiunto è quello corretto, permettono la formazione di alcune interazioni intermolecolari, come ad esempio i legami di Van der Waals, che stabilizzano il legame tra il desossinucleotide trifosfato che si sta aggiungendo e facilitano il legame con la DNA polimerasi Proofreading Di base la DNA polimerasi è particolarmente capace di scegliere nucleotidi giusti. Poi, la DNA polimerasi ha attività esonucleasica, quindi può cancellare eventuali dNMP errati in direzione 3’-5’. La subunita che se ne occupa è collocata nel palmo. Ciò che innesca la rimozione del nucleotide è il fatto che un nucleotide errato crea una distorsione nella catena. Oltre alla DNA polimerasi, le cellule utilizzano anche la cosiddetta sliding clamp, o pinza scorrevole, che si lega al DNA da una parte e alla polimerasi dall’altra. Negli eucarioti, c’è un maggiore grado di specializzazione che riguarda la DNA polimerasi. La DNA polimerasi ε e δ si occupano ognuno della sintesi di un filamento: la ε sintetizza il filamento guida, la δ il filamento ritardato. La DNA polimerasi δ viene mantenuta in posizione, ancorata al DNA, tramite un complesso chiamato PCNA. La DNA polimerasi α si occupa di sintetizzare i primissimi nucleotidi dopo l’innesco. Infine è presente la DNA polimerasi γ, che interviene nella replicazione del DNA mitocondriale. A sintetizzare i primer è la RNA polimerasi mitocondriale. Inizio della replicazione Il modello più recente della replicazione prevede la presenza di 3 elementi diversi: replicone, replicatore e iniziatore. Il replicone è la porzione di DNA che deve essere duplicata a partire da una specifica posizione. Negli eucarioti, il replicone è una sequenza di DNA specifica corrispondente ad un gene. Il replicatore è una particolare sequenza anche detta origine di replicazione che si trova sul DNA stesso, e ce ne possono essere anche migliaia lungo i cromosomi eucarioti. Infine l’iniziatore è un insieme di proteine che sono capaci di promuovere l’apertura del doppio filamento e rendere possibile la duplicazione. Inizio della replicazione nei procarioti La prima proteina che agisce a livello del replicatore è DnaA. L’origine di replicazione è definita oriC, che contiene 5 ripetizioni di alcune basi, DnaA box, a cui DnaA si lega. 3 di queste sequenze sono ad alta affinità, due a bassa affinità, e per legarsi necessitano che DnaA si leghi ad ATP. Sempre a livello dell’origine di replicazione, più a valle, sono presenti tre ripetizioni di basi ricche di A e T, le DUE, che facilitano l’apertura della doppia elica (A e T sono più instabili). Quando l’ATP si lega a DnaA, questo si lega alle zone dell’origine di replicazione a bassa affinità. L’insieme delle 5 unità legate a DnaA forma un superavvolgimento positivo. Per compensare, nella sezione DUE si forma un superavvolgimento negativo, e ciò porta infine all’apertura della doppia elica. Si forma così il filamento singolo, su cui si costituisce tutta la struttura del replisoma. Dopo che DNAa si è legata alla sequenza, richiama l'elicasi, per l'apertura delle eliche. Il genoma batterico contiene 2 forcelle di replicazione. La DNA polimerasi 3 è legata al filamento tramite il complesso beta e beta1. Inizio della replicazione negli eucarioti Per l'inizio della replicazione negli eucarioti esiste un complesso detto MCM (Mini chromosome Maintenance), che corrisponde all'elicasi, per aprire i due filamenti di DNA. L'elicasi nel complesso si associa a due attivatori allosterici, Cdc45 e GINS. Sono inoltre presenti diversi complessi di inizio della replicazione. Normalmente la replicazione è ristretta alla fase S del ciclo cellulare, ma alcuni complessi proteici cominciano a legare le origini di replicazione già dalla fase finale della mitosi. Questi complessi prendono il nome generale di complessi pre-RC (pre- replicativi). Tra questi importantissimo è ciò complesso ORC (complesso di origine della replicazione). Terminazione La terminazione della replicazione è diversa tra procarioti ed eucarioti. Nei procarioti, la replicazione permette la sintesi di tutti il cromosoma circolare. Questo meccanismo è regolato da sequenze che hanno la funzione di bloccare l’avanzamento delle forcelle di replicazione. Queste sequenze sono dette sequenze Ter, legate ad una proteina chiamata Tus. Il complesso Tus/Ter blocca la replicazione. Negli eucarioti la terminazione è più difficile, perché i cromosomi sono lineari e non circolari, e su, filamento stampo discontinuo può essere che non vengano tradotto gli ultimi nucleotidi, la parte dei telomeri. Questo potrebbe portare nel corso delle generazioni all’accorciamento dei telomeri. A questo problema ovvia la telomerasi, un enzima a trascrittasi inversa che appunto utilizza degli stampi di RNA per allungare la molecola di DNA. Polimerasi specializzate Il DNA è continuamente sottoposto a modificazioni chimiche, che se non riparate portano a mutazioni. Tra le più comuni c’è la formazione di dimeri di pirimidine, che si formano in seguito ad un’eccessiva esposizione alla luce UV. Normalmente il nostro organismo è in grado di riparare le mutazioni. Per minimizzare i rischi di mutazioni, nelle cellule sono presenti anche DNA polimerasi specializzate, le DNA polimerasi TLS, capaci di attuare la replicazione anche in presenza di dimeri di pirimidine. Tuttavia queste polimerasi non sono molto fedeli, quindi potrebbero portare altre mutazioni. Un altro tipo di DNA polimerasi speciali sono le RT, RNA-dipendenti, che utilizzano segmenti di RNA come stampo per il DNA.