Replicazione, trascrizione, traduzione DNA + controlli, Appunti di Biologia

Scarica Replicazione, trascrizione, traduzione DNA + controlli e più Appunti in PDF di Biologia solo su Docsity! SINTESI DEGLI ACIDI NUCLEICI I monomeri che costituiscono gli acidi nucleici, tra cui il DNA sono i nucleotidi. | nucleotidi sono costituiti dall'unione di 3 molecole: un monosaccaride, una base azotata e un gruppo fosfato. Nel caso del DNA il monosaccaride è il D-2-desossiribosio. Le basi azotate che compongono gli acidi nucleici possono essere purine o pirimidine. Le pirimidine sono citosina, timina e uracile e sono costituite da un anello esatomico. Le purine sono adenina e guanina e sono formate da due anelli condensati, uno esatomico e uno pentatomico. Il gruppo OH legato al carbonio 1° del monosaccaride si lega al gruppo NH della base azotata. Viene eliminata una molecola d'acqua e si forma un nucleoside. Il nucleoside presenta un gruppo ossidrile nel carbonio-5', che reagisce con una molecola di acido fosforico H3PO4. Si elimina nuovamente una molecola d'acqua, si forma un legame estereo e il composto che risulta è chiamato nucleotide. Il gruppo fosfato di un nucleotide, legato al carbonio in posizione 5', può poi reagire con il gruppo ossidrile di del carbonio 3' dello zucchero di un altro nucleotide. Si elimina una molecola d'acqua, e si forma un legame fosfodiestere. Quando più nucleotidi si legano tra loro si costituisce un polinucleotide di un acido nucleico. Una delle due estremità del polinucleotide ha libero un ossidrile sul carbonio-3', l'altra ha un gruppo fosfato libero in posizione 5°. STRUTTURA MOLECOLARE DEL DNA Costituito da due catene polinucleotidiche appaiate e avvolte a formare una doppia elica. Queste catene sono antiparallele e complementari. I nucleotidi formano legami covalenti, mentre i legami che uniscono i filamenti sono a idrogeno. Il diametro è costante e l'avvolgimento è destrogiro. Le due catene sono complementari: l'adenina si appaia sempre con la timina formando 2 legami a idrogeno, la citosina con la guanina formandone 3. Le due catene sono anche antiparallele, orientate in direzioni opposte. Infatti all'estremità 3' di un filamento corrisponde l'estremità 5' dell'altro. Le coppie AT e CG hanno la stessa lunghezza, quindi il diametro dell'elica è costante. Ogni piolo è ruotato rispetto a quello precedente di circa 36°. Il DNA ha una struttura strettamente legata alla funzione che svolge. Le informazioni genetiche di un organismo sono contenute nelle basi azotate. Dato che i nucleotidi sono milioni, la variabilità che si genera dà origine alle differenze tra specie e tra individui. La complementarietà delle basi appaiate facilita la duplicazione: ogni filamento, separato da quello complementare, può essere usato come modello per produme un altro. LA DUPLICAZIONE DEL DNA Nella fase S del ciclo cellulare ha luogo la duplicazione del DNA. Watson e Crick. nella loro pubblicazione suggerirono un modello di duplicazione semiconservativo, che verrà poi confermato dall’esperimento di Meselson e Stahl del 1958. All'epoca coesistevano diverse teorie circa la duplicazione del DNA: conservativo, semiconservativo e dispersivo. Il modello conservativo prevede che le due eliche parentali si riassocino dopo la replicazione e che le due eliche figlie si associno tra loro. Il modello semiconservativo prevede che un filamento parentale abbia funzione di stampo per generare il proprio filamento figlio, con la quale si associerà poi. Il modello dispersivo prevede che la doppia elica parentale venga tagliata in segmenti di DNA che fungeranno da stampi per la sintesi di nuovi segmenti a doppia elica. Le doppie eliche complete saranno formate dal mescolamento di segmenti parentali e segmenti nuovi. Arthur Komberg realizzò il primo esperimento a riguardo, dimostrando che era possibile sintetizzare una nuova molecola di DNA che avesse la stessa composizione di quella parentale, in una provetta contenente 3 tipi di sostanze: - i 4 nucleotidi nella forma di desossiribonucleosidi trifosfati AATP, dCTP, dAGTP e dTTP - l'enzima DNA polimerasi (isolato per la prima volta da Komberg stesso nel 1956) -. un DINA campione, che funge da guida per l'ingresso dei nucleotidi Non riuscì però a stabilire come avviene questa duplicazione. ESPERIMENTO DI MESELSON E STAHL Nel 1958, gli scienziati Matthew Meselson e Franklin Stahl dimostrarono, attraverso un esperimento, che il modello corretto fosse quello semiconservativo. N15 é più pesante di N14, infatti inizialmente lasciarono sviluppare due colture distinte, una in ambiente ricco di N14, l'altra in ambiente ricco di N15. (Hershey e Chase - 1952). Le marcature di densità permettevano di distinguere filamento parentale e nuovo filamento, infatti quando combinarono gli estratti delle due colture e li centrifugarono in una soluzione di cloruro di cesio, che forma un gradiente di densità durante la centrifuga, si formarono due bande di DNA separate: il DNA della coltura di N15 aveva posizione in gradiente di densità diversa rispetto a quello della coltura di N14 Utilizzarono una coltura di E.Coli cresciuta in un terreno ricco di azoto pesante non radioattivo N15. A questo punto spostarono i batteri marcati con N15 in ambiente ricco di N14 e li lasciarono a duplicare. Ripeterono quindi la centrifugazione ogni 20 minuti, tempo in cui le cellule si dividono. Venne osservato che dopo la prima replicazione la densità del DNA di tutti i batteri assumeva valori intermedi per N15 e N14. Dopo la seconda replicazione, circa metà del DNA occupava la posizione intermedia, mentre l'altra metà occupava la posizione dei valori di N14. CORREZIONE DI ERRORI DI DUPLICAZIONE La replicazione del DNA non è perfetta ma è soggetta a errori e danni dovuti a agenti esterni e sostanze chimiche. In media la DNA polimerasi compie un errore ogni milione di basi duplicate, che porterebbero a 60000 mutazioni ogni volta che la cellula si divide. Le cellule dispongono però di alcuni meccanismi di riparazione: - un sistema di proofreading che corregge gli errori appena la DNA polimerasi li compie -. un sistema di mismatch repair che controlla il DNA appena si duplica e corregge gli appaiamenti sbagliati -. una riparazione per escissione, che rimuove le basi anomale e le sostituisce con basi funzionali. PROOFREADING La stessa DNA polimerasi (coadiuvata da altri enzimi come la DNA polimerasi 1) è in grado di svolgere una funzione di proofreading per evitare di commettere errori di mismatch delle basi, basato sul controllo della distanza tra i due filamenti che deve essere mantenuto costante. Riduce il tasso di errore a una ogni miliardo di basi. MISMATCH REPAIR Dopo che è avvenuta la duplicazione, una seconda serie di proteine esamina la molecola e rileva eventuali ulteriori mismatch sfuggiti. Si basano sui cambiamenti chimici che subiscono i filamenti di DNA in caso di errori di appaiamento. Ad, esempio, potrebbe darsi che le molecole di DNA non si metilino come dovrebbe invece accadere, come succede in alcuni procarioti. ESCISSIONE Le molecole si possono danneggiare anche durante la vita delle cellule, in seguito ad esposizione a raggi altamente energetici o ad agenti chimici esterni. In questo caso si attua una riparazione per escissione. Se è solo una base ad essere danneggiata, essa viene rimossa, il filamento coinvolto viene tagliato e sostituito (escissione di base). Se, come ad esempio in seguito ad esposizione a raggi UV, si formano dimeri di timina che distorcono il DNA, avviene l'escissione di nucleotidi: alcune proteine rimuovono una serie di diversi nucleotidi (circa 24) e in seguito si provvede a sostituirli. Se le molecole vengono esposte a radiazioni altamente energetiche, come i raggi X o i raggi gamma, uno o entrambi i filamenti si strappano completamente. Anche un solo strappo di entrambi i filamenti (DSB - double strand break) può causare la morte della cellula. Il DSB si può però riparare attraverso la ricombinazione omologa oppure con una giunzione finale non omologa (NHEJ - Non Homologous End Joining). La ricombinazione omologa usa una sezione di DNA simile non danneggiato come modello. Specifici enzimi vanno a intrecciare il filamento danneggiato con quello non danneggiato, portandoli a scambiare sequenze di nucleotidi per riempire il buco lasciato dalla sezione danneggiata precedentemente rimossa. La giunzione finale non omologa non necessita di uno stampo: alcuni enzimi rimuovono le sequenze di nucleotidi danneggiate ed effettuano una giunzione che va a unire i due filamenti, senza però avere la possibilità di controllare con uno stampo la correttezza dell'intervento. MGMT rimuove le alterazioni legate alla guanina. RELAZIONE TRA GENI E PROTEINE | genetisti Beadle e Tatum ipotizzarono che l'effetto sull'organismo dell'espressione di un gene, quindi il fenotipo, dipendesse dall'attività di un enzima. Utilizzarono la Neurospora crassa, la comune muffa del pane, in quanto facile da coltivare e, soprattutto, aploide per la maggior parte del suo ciclo vitale, il che elimina il problema di dominanza e recessività. Fecero crescere Neurospora su un terreno minimo, quindi contenente solo carbonio e sali minerali. Su questo terreno, i ceppi selvatici di Neurospora erano in grado di catalizzare tutte le reazioni necessarie a fabbricare i costituenti chimici delle cellule. In seguito, seguendo le teorie del genetista Hermann Joseph Muller, che affermava che i raggi X causano mutazioni nei geni, Beadle e Tatum trattarono le spore della muffa con raggi X e studiarono le mutazioni che comportavano alle cellule il deficit di un dato enzima. Lasciarono crescere le spore irradiate in un terreno minimo, sprovvisto dei componenti essenziali prodotti da questo organismo, e notarono che i mutanti non crescevano nel terreno minimo, ma si sviluppavano se al terreno minimo veniva aggiunta una specifica sostanza nutritiva. I mutanti avevano subito mutazioni che rendevano inattivo l'enzima necessario per sintetizzare quello specifico nutriente. Quindi, ciascun gene contiene le informazioni per codificare una particolare proteina. Le scoperte che seguirono questo esperimento dimostrarono che non tutte le proteine che influiscono sul fenotipo sono enzimi, e che spesso le proteine, compresi gli enzimi, hanno struttura terziaria o quaternaria, composta quindi da varie catene polipeptidiche. Ogni catena polipeptidica è specificata da un gene distinto e tale gene esprime tale catena polipeptidica, in quanto non va direttamente a costituirla ma contiene le informazioni per la sua codifica. TRASCRIZIONE E TRADUZIONE DOGMA CENTRALE DELLA BIOLOGIA MOLECOLARE Nel 1958, Francis Crick enunciò il dogma centrale della biologia molecolare: il gene è un tratto di DNA che contiene informazioni per la produzione di una proteina, ma la stessa non contiene informazioni per produrre altre proteine, DNA o RNA. Quindi, per poter essere utilizzata, l'informazione genetica contenuta nel DNA della cellula deve essere trasferita ad una molecola di RNA (processo chiamato trascrizione) e da qui ad una proteina che rappresenta il ricettore finale dell'informazione (processo chiamato traduzione). Venne però trovata un'eccezione a questo dogma negli anni Settanta, con la scoperta dei retrovirus, che hanno una molecola di RNA come materiale genetico e sono in grado di convertirla in DNA (trascrittasi inversa). Questo principio portò a due interrogativi: - come fa l'informazione a passare dal nucleo al citoplasma? - come sono rapportate le sequenze nucleotidiche del DNA e le sequenze di amminoacidi delle proteine? Crick propose due ipotesi, una in risposta a ogni domanda: - TRASCRIZIONE E IPOTESI DEL MESSAGGERO: in risposta a come l'informazione passa dal nucleo al citoplasma, Crick ipotizzò che un da filamento di DNA di un particolare gene si formasse per copia complementare una molecola di RNA. L'RNA messaggero (MRNA) va poi dal nucleo al citoplasma dove, nei ribosomi, funge da stampo per la sintesi delle proteine. Questo filamento di RNA si forma in seguito a un processo chiamato trascrizione. - TRADUZIONE E IPOTESI DELL'ADATTATORE: per spiegare come una sequenza di DNA è legata ad una sequenza di amminoacidi nella molecola di un polipeptide, Crick ipotizzò l'esistenza di una molecola adattatrice che si lega ad un amminoacido e riconosce una serie di nucleotidi. Ipotizzò la presenza di due regioni: una con funzione di legame e una con funzione di riconoscimento. Effettivamente tale molecola esiste: l'RNA transfer (tRNA). Il tRNA riconosce il messaggio portato dall'mRNA, mentre trasporta specifici amminoacidi, e traduce il linguaggio del DNA nel linguaggio dei polipeptidi. Si ha un processo detto traduzione: il tRNA legato agli amminoacidi si allinea lungo la sequenza data dall'mRNA per garantire la costruzione della giusta sequenza per la formazione della catena polipeptidica. In sostanza il tRNA agisce da intermediario fra l'informazione di una sequenza nucleotidica dell'MRNA e la sequenza degli amminoacidi di una proteina. RNA E DNA L'acido ribonucleico differisce da quello desossiribonucleico principalmente per 3 aspetti: - la molecola di monosaccaride del DNA è il 2-desossiribosio, mentre nell'RNA è il ribosio; - nell’RNA le purine sono uracile (U) e citosina (C), nel DNA sono timina (T) e citosina (C) (Le purine sono formate da due anelli eterociclici azotati, al contrario delle pirimidine che ne hanno solo uno). - generalmente l'RNA è formato da un filamento unico. Quando l'RNA si appaia a un filamento singolo di DNA, questo appaiamento segue le stesse regole di complementarietà delle basi, ma l'adenina si appaia con l'uracile anzichè con la timina. Esistono diverse classi di RNA, con funzioni specifiche. Le principali sono: - mRNA: intermediario che porta una copia delle informazioni di un tratto di DNA ai ribosomi. Caratterizzato da una sequenza lineare. Quando la RNA polimerasi si lega al primer, ha inizio la fase dell'allungamento. La RNA polimerasi apre il DNA e legge il filamento stampo (o filamento senso) in direzione 3'-5. Inserisce quindi nel filamento in sintesi i nucleotidi trifosfato all'estremità 3', quindi l'RNA cresce da 5’ a 3'. Non necessita di un primer per dare inizio a questo processo. L'RNA trascritto è antiparallelo al DNA stampo. La terminazione è stabilita da particolari sequenze di basi presenti sul filamento stampo di DNA, analogamente a quanto accade per il sito di inizio, in corrispondenza dei terminatori. Il primo prodotto della trascrizione negli eucarioti è il trascritto primario, o pre-mRNA, che subisce un notevole processo di trasformazione prima di essere tradotto. La trascrizione è un processo che comporta un elevato dispendio di energia e viene trascritto solo il codice delle proteine effettivamente necessarie alla cellula. È un processo fortemente regolato in quanto sono presenti controlli pre-trascrizionali, controlli durante la trascrizione e controlli post-trascrizionali. IL CODICE GENETICO Il codice genetico è un sistema di regole che permette di usare la sequenza nucleotidica del DNA e dell'RNA per costruire sequenze di amminoacidi e quindi proteine, fondamentali per lo sviluppo e la crescita degli organismi, ed é un codice universale, cioè identico in tutti i tipi di organismi. è organizzato in sequenze di tre basi lungo la catena polinucleotidica dell'RNA, dette codoni, che codificano per un particolare amminoacido, sono quindi le unità fondamentali di lettura dell'informazione genetica. Le possibili combinazioni possibili nella formazione delle triplette sono 443, cioè 64, mentre gli amminoacidi presenti nelle proteine solo 20. Questo si traduce nel fatto che triplette diverse di basi azotate codificano per lo stesso amminoacido. Questa ridondanza viene definita degenerazione del codice genetico. Non vi è però ambiguità: un codone può specificare solo un amminoacido. AUG, che codifica la metionina, è detto codone di inizio, avvia la sintesi proteica, quindi la traduzione. | codoni di fine sintesi vengono definiti codoni non senso, o codoni di stop, in quanto non codificano per alcun amminoacido, e sono UAG, UAA e UGA. Quando viene raggiunto uno di questi, la traduzione è completata e il polipeptide si stacca. La traduzione del codice genetico avviene a livello ribosomiale, dopo che il codice genetico viene copiato dal DNA andando a formare mRNA, la molecola che raggiunge poi i ribosomi e viene tradotta in proteine. GENOMA DEI PROCARIOTI | genomi batterici hanno 3 principali caratteristiche: - Sono relativamente piccoli: da 160000 a 12 milioni di paia di basi (3,2 miliardi nel genoma umano), organizzate in un unico cromosoma circolare formato da DNA a doppia elica. - Sono compatti, in quanto più dell'85% del DNA è costituito da sequenze per proteine o RNA. - Oltre al cromosoma principale, spesso presentano molecole circolari di DNA dette plasmidi, trasferibili da cellula a cellula. La cellula non presenta compartimenti e la zona in cui è presente il cromosoma è detta nucleoide. TRASCRIZIONE NEI PROCARIOTI Nei procarioti, i geni che svolgono funzioni correlate sono organizzati in operoni. Coordinano più geni che codificano proteine che operano nella stessa via metabolica, in risposta a stimoli esterni o alle condizioni intracellulari. Vennero scoperti da Francois Jacob e Jacques Monod, che studiarono nel genoma di E.coli l'unità di trascrizione (sequenza di DNA trascritta in un singolo RNA) dei geni che codificano gli enzimi per il metabolismo del lattosio. Ci sono 3 enzimi responsabili del suo metabolismo: - B-galattoside permeasi: proteina di trasporto che porta lo zucchero nella cellula batterica; - B-galattosidasi: enzima che idrolizza il lattosio in glucosio e galattosio; - B-galattoside transacetilasi: trasferisce gruppi acetile dall'aceti-CoA ad alcuni B-galattosidi I geni che codificano questi enzimi sono adiacenti sul cromosoma di E.coli, questo perché i 3 geni sono trascritti in un unico mRNA e regolati insieme. Questi geni sono detti geni strutturali, cioè codificano proteine che svolgono un ruolo enzimatico, strutturale o di difesa della cellula. 1 3 geni strutturali che codificano le proteine del metabolismo condividono anche lo stesso promotore. Fra il promotore e i geni strutturali vi è l'operatore, che può legare il repressore, una proteina regolatrice. C'è infine un terminatore, sequenza che segnala alla RNA polimerasi il termine della trascrizione. Geni strutturali, operatore, promotore e terminatore costituiscono l'unità di trascrizione. - Se.il repressore è legato all'operatore, la RNA polimerasi non si lega al promotore e la trascrizione è bloccata; - Se non è legato, la RNA polimerasi può legarsi al promotore ed effettuare la trascrizione. | geni vengono espressi. Nei procarioti l'unità di trascrizione è detta operone. è controllato da uno specifico gene regolatore che codifica il repressore. Gli operoni possono essere reprimibili o inducibili. - Negli inducibili, il repressore è legato all'operatore, di norma, e viene rimosso solo quando una molecola segnale detta induttore ne causa il distacco; - Nei reprimibili, il repressore si lega all'operatore solo in presenza di un corepressore. SEQUENZE CONSENSO All'inizio del promotore sono poste due sequenze in cis, dette sequenze consenso, che definiscono la posizione del promotore. Queste due sequenze sono poste rispettivamente 35 e 10 nucleotidi a monte del primo nucleotide trascritto. Il -35 ha sequenza 5'-TTGACA-3' quello a -10 ha sequenza 5'-TATAAT-3' ed è anche chiamato Pribnow box. Costituiscono il sito di legame per la RNA polimerasi, formata da 5 subunità: 4 di esse formano il core, la quinta, il fattore o, è una proteina regolatrice che conferisce alla RNA polimerasi la capacità di legarsi alle sequenze consenso. Costituisce un fattore di specificità. OPERONE LAC INDUCIBILE Gli operoni possono essere reprimibili o inducibili. L'operone lac è inducibile. Vi è un repressore che opera la regolazione e blocca la trascrizione (dell'operone?). Quando E. coli viene fatto crescere in un ambiente privo di lattosio, l'operone lac viene represso. In presenza di lattosio si accumula l'allolattosio, metabolita, che funge da induttore. L'allolattosio si lega al repressore, ne modifica la forma (cosicchè il repressore non riesca a legare l'operatore) e permette quindi alla RNA polimerasi di legarsi al promotore e trascrivere i geni che codificano gli enzimi che metabolizzano il lattosio. L'operone lac codifica per la produzione dei 3 enzimi di cui sopra, che degradano il lattosio. Quando la concentrazione scende sotto un certo valore, non si riesce più a bloccare il repressore, quindi si blocca nuovamente la trascrizione. OPERONE TRP REPRIMIBILE L'operone trp regola l'espressione dei geni per la sintesi del triptofano, amminoacido. Contiene un operatore che in condizioni normali non è legato al repressore. Quando si accumula triptofano nella cellula, l'amminoacido stesso funge da co-repressore permettendo al suddetto repressore di legare l'operatore e bloccare la trascrizione, fino a che la concentrazione di triptofano non ritorna sotto una certa soglia. IL GENOMA EUCARIOTICO Differenze con i procarioti: - | genomi eucariotici sono più grandi: possiedono più basi che codificano per più proteine. Le cellule sono specializzate e svolgono attività che richiedono un elevato numero di proteine; - Sono presenti più sequenze regolatrici (sequenze del DNA che legano proteine regolatrici); - Possiedono cromosomi lineari multipli: invece dell'unico cromosoma circolare dei procarioti, gli eucarioti hanno cromosomi lineari, con un centromero che unisce i cromatidi e i telomeri posti alla fine; - Sono presenti sequenze ripetute e geni interrotti: le sequenze ripetute sono presenti in più di una copia. La maggior parte non viene tradotta in proteine. | geni interrotti contengono sequenze codificanti alternate a sequenze non codificanti; - Trascrizione e traduzione avvengono separatamente: | sintesi dell'mRNA avviene nel nucleo, la sintesi proteica nel citoplasma. Questa separazione spaziale fa in modo che prima che inizi la sintesi proteica la cellula venga regolata molte volte: durante la REGOLAZIONE DURANTE LA TRASCRIZIONE La trascrizione stessa costituisce il secondo livello di regolazione dell'espressione genica. Un primo meccanismo è la trascrizione differenziale. Le proteine fondamentali per il metabolismo delle cellule vengono codificate da geni “housekeeping” o “costruttivi”, che vengono sempre trascritti. Altri geni, che codificano proteine necessarie solo in determinati tessuti vengono trascritti solo nelle cellule appartenenti a tale tessuto. FATTORI DI TRASCRIZIONE Negli eucarioti, l'’RNA polimerasi Il non è in grado di legarsi al promotore da sola, ma può farlo solo dopo che sul DNA si legano specifiche proteine dette fattori di trascrizione, che a loro volta legano enhancers o silencers. Gli enhancers stimolano l'attività del complesso di trascrizione. Possono trovarsi anche molto lontani dal promotore, contengono un elevato numero di siti di legame per gli attivatori che legano il promotore. | fattori trascrizionali si legano sia al promotore che all'enhancer, portando a un ripiegamento della cromatina, che porta in contatto enhancer e promotore. | fattori trascrizionali fungono da ponte stabilizzando il ripiegamento. Quindi, in prossimità del promotore si concentrano diversi attivatori, che a loro volta reclutano altri fattori di trascrizione. | silencers arrestano la trascrizione legando repressori proteici. La combinazione di diversi fattori di trascrizione determina la velocità finale della trascrizione. DIFFERENZIAMENTO DELLE CELLULE Tutte le cellule hanno lo stesso materiale genetico. La differenziazione e la specializzazione nelle cellule adulte sono date da cambiamenti nell'espressione genica, dati da attivazione o inattivazione di vari fattori di trascrizione. La terapia cellulare si basa sull'implementazione di cellule provenienti dallo stesso organismo del paziente malato, modificate per diventare funzionali e specifiche per il tessuto che si va a trattare. Si possono usare le cellule staminali alterando l'espressione dei fattori di trascrizione per renderle specifiche. AMPLIFICAZIONE SELETTIVA Una cellula può sintetizzare un determinato prodotto genico in quantità maggiori rispetto ad altre cellule anche attraverso l'amplificazione genica, che consiste nel sintetizzare più copie di un gene, che verranno tutte trascritte. REGOLAZIONE POST-TRASCRIZIONALE Nello splicing, che si verifica dopo la trascrizione, il pre-mRNA viene modificato eliminando gli introni e saldando gli esoni. Per molti geni si verifica invece un processo detto splicing alternativo, che elimina, oltre agli esoni, anche alcuni introni. Grazie a questo processo, a partire da un singolo gene è possibile sintetizzare una famiglia di proteine diverse. Nel 2003 venne completato il sequenziamento del genoma umano e venne fuori che i geni erano solo 21000, invece degli 80000-150000 ipotizzati. Il numero dei geni è di gran lunga inferiore rispetto alla varietà delle proteine prodotte in quanto vengono sottoposti a meccanismi post-traduzionali come lo splicing alternativo. I CONTROLLI TRADUZIONALI Nella trascrizione ha inizio la sintesi delle proteine; le informazioni contenute nel DNA vengono trasferite all'’RNA. Viene prodotto l'mRNA che passa nel citoplasma e viene tradotto nella sequenza di amminoacidi. La concentrazione di una proteina in una cellula non dipende però solo dalla quantità del suo MRNA. Solo per un terzo dei geni, infatti, c'è proporzionalità diretta tra mRNA e proteine. Nei restanti due terzi l'abbondanza è determinata da fattori agenti dopo la maturazione dell'mRNA. La traduzione può essere controllata in diversi modi, ad esempio attraverso repressori che si legano all'mRNA bloccando il sito di attacco del ribosoma. I MICRORNA Nel genoma umano solo il 5% delle sequenze di DNA sono esoni, ma quasi tutto il DNA viene trascritto. Gli RNA prodotti da porzioni di DNA che non codificano per proteine sono detti RNA non codificanti (ncRNA). Tra questi ci sono i microRNA (MIRNA) e gli small interfering RNA (siRNA). Regolano l'espressione delle proteine. miRNA Uno solo di questi controlla l'espressione di migliaia di geni. Il trascritto primario, detto pri-miRNA è lungo qualche centinaio di nucleotidi, si ripiega e forma una forcina. Si lega quindi a un complesso enzimatico nucleare che taglia le estremità della forcina lasciando intatta la struttura a forcina centrale. SI forma così il pre-miRNA, lungo circa 70 nucleotidi. Viene poi esportato nel citoplasma dove si associa ad un altro complesso enzimatico che provvede ad eliminare la maggior parte della forcina, riducendola ad una sequenza di 20 nucleotidi circa che costituisce il miRNA maturo. In seguito il miRNA si appaia agli MRNA che presentano in estremità 5' o 3' una sequenza complementare. Questo appaiamento indirizza l'MRNA verso la degradazione. Se non viene degradato, l'’RNA bersaglio del MIRNA viene bloccato e la traduzione risulta inibita. Meccanismo di controllo negativo della traduzione (gene silencing). siRNA | siRNA vengono vengono sintetizzati dagli stessi apparati enzimatici dei miRNA, ma sono prodotti solitamente a partire da DNA o RNA esogeno (proveniente dall'esterno dell'organismo), in particolare durante le infezioni virali. Molti virus infatti presentano un genoma a RNA, che solitamente si duplicano e formano doppi filamenti. Questi lunghi RNA vengono convertiti in RNA brevi a singolo filamento, i siRNA. Questi segmenti si appaiano alle sequenze complementari degli mRNA virali, bloccando la traduzione. I siRNA si possono ad oggi sintetizzare in laboratorio, specifici per tutti gli mRNA. Impediscono l'espressione dell'MRNA bersaglio. RNA interference, forma di silenziamento genico CONTROLLI POST-TRADUZIONALI (LONGEVITÀ) Le proteine da degradare sono marcate da un enzima che lega ad esse, in corrispondenza di un residuo di lisina, l'ubiquitina, una proteina di 76 amminoacidi che tende a legare a sè altre molecole dello stesso tipo formando una catena di poliubiquitina. Questo complesso proteina-poliubiquitina si lega a un complesso polienzimatico, il proteasoma. Il complesso entra quindi nel proteasoma, dove la poliubiquitina viene eliminata e la proteina bersaglio viene aggredita da tre proteasi che la riducono in amminoacidi e peptidi più brevi. L'EPIGENETICA Tutte le cellule hanno uguale corredo genetico, ma è diversa l'espressione dei geni in cellule con diverse specializzazioni, detta espressione differenziale dei geni, possibile grazie all'attivazione di specifiche cascate trascrizionali nei tessuti. I meccanismi che agiscono prima della trascrizione coinvolgono la cromatina ed i cromosomi. L'epigenetica è lo studio dei cambiamenti ereditabili che variano l'espressione genica senza alterare le sequenze del DNA (questi cambiamenti vengono influenzati dall'ambiente). Questi cambiamenti includono due processi: la metilazione del DNA e la modulazione del grado di condensazione della cromatina. LA METILAZIONE DEL DNA L'enzima DNA metiltransferasi catalizza l'aggiunta di un gruppo metilico sul filamento di DNA che funge da promotore. Formano regioni dette isole CpG. Durante duplicazione e trascrizione la citosina metilata (metilcitosina) si comporta esattamente come la citosina, appaiandosi con la guanina (non alterando l'informazione genetica, da qui il mutamento epigenetico). La presenza di numerosi gruppi metilici su un promotore attira però i repressori, che si legano al DNA metilato silenziando la trascrizione. È reversibile, attraverso l'enzima demetilasi che rimuove il gruppo metilico.