La Sintesi e il Trasporto di Proteine e Lipidi attraverso il Reticolo Endoplasmatico, Appunti di Citologia

Scarica La Sintesi e il Trasporto di Proteine e Lipidi attraverso il Reticolo Endoplasmatico e più Appunti in PDF di Citologia solo su Docsity! Reticolo Endoplasmatico La formazione del reticolo endoplasmatico si ipotizza sia avvenuta a partire da un’antica cellula procariotica, in cui erano assenti gli organelli e non era presente la compartimentazione del DNA. Attraverso un’invaginazione della membrana il nucleo viene avvolto prima da una sola membrana e poi da una seconda che origina il reticolo endoplasmatico. Attraverso tale ipotesi si delinea che l’origine del Reticolo sia avvenuta per effetto del prolungamento della membrana che avvolge il DNA, questo spiegherebbe la sua adesione e connessione con il nucleo nelle cellule eucariotiche. I ribosomi sono situati nel citosol, liberi di muoversi, oppure aderiscono a livello della membrana del reticolo endoplasmatico. Questi ribosomi sintetizzano una proteina specifica e la indirizzano all’interno di questo organello, qui le proteine vengono smistate e indirizzate ad altri organelli.  I ribosomi del citosol e quelli localizzati sulla membrana del reticolo endoplasmatico sono identici o presentano differenze? I ricercatori non hanno trovato differenze strutturali nelle varie subunità e a livello degli mRNA dei due ribosomi. Reticolo endoplasmatico Liscio e Rugoso Si trovano in continuità tra loro ma differiscono poiché quello liscio non ha i ribosomi e ha una struttura tubulare. Studio del RER e REL Lo studio dei due organelli è stato effettuato mediante un processo di centrifugazione differenziale, frazionando quindi i tipi cellualare, prima di centrifugare è importante l’omogeneizzazione attraverso una sorta di pestello. Centrifugando si forma un precipitato e un surnatante, il precipitato andrà separato via via dal surnatante per ottenere dopo numerose centriufugazioni il reticolo endoplasmatico che è appunto frammentato in varie vescicole, i microsomi. A questo punto i microsomi sono sia ruvidi che lisci, dobbiamo quindi procedere a separarli. Si utilizza il gradiente di saccarosio, cioè una soluzione con concentrazione crescente di saccarosio lungo la provetta ottenendo un gradiente lineare, questo si ottiene attraverso miscelazioni graduali. Sulla superficie del gradiente dispongo i microsomi e avvio la centrifugazione ottenendo nella parte alta i microsomi lisci, che avendo bassa densità tendono a galleggiare e nella parte bassa i microsomi rugosi che hanno un alta densità e tendono quindi a precipitare Traffico intracellulare delle proteine Le proteine, una volta sintetizzate dai ribosomi devono essere smistate. Esse raggiungono mitocondri, nucleo, perossisomi; oppure nel reticolo endoplasmatico dove passano nel Golgi per gemmazione, in questo organello sono poi smistate ulteriormente attraverso altre vescicole che vanno a fondersi con lisosomi, con la superficie cellulare. Tutte le proteine iniziano la propria sintesi nel citosol e la terminano in due diverse zone. Nel caso delle proteine di membrana, di secrezione e lisosomiali, la sintesi continua quando il ribosoma viene traslocato sulla membrana del reticolo endoplasmatico; in questo caso si effettua una importazione co- traduzionale perché le proteine passano prima nel lume del RE e poi nel Golgi. Nel caso delle proteine nucleari, dei mitocondri, cloroplasti e perossisomi la sintesi prosegue e termina nel citosol; avviene poi un trasporto post-traduzionale specifico, questo è garantito da sequenze segnale specifiche che permettono l’ingresso in un determinato organello. Trasporto Citosol-Nucleo: avviene attraverso pori nucleari che trasportano attivamente le proteine attraverso il riconoscimento delle specifiche sequenze amminoacidiche, si tratta di un trasporto in cui la proteina viene lasciata passare nella sua forma attiva. Trasporto RE-Golgi: è un trasporto di tipo vescicolare, effettuato attraverso gemmazione e fusione con la membrana bersaglio. Trasporto Citosol-mitocondri, perossisomi, plastidi, RE: si tratta di un trasporto mediato da trasportatori proteici; quindi, un trasporto attivo in cui la proteina deve distendersi per poter passare. Segnali di smistamento Sono presenti particolari sequenze segnale che permettono l’importazione o l’esportazione in specifici organelli. Il peptide segnale è formato da aminoacidi idrofobici, in particolare sono i gruppi acilici ad essere idrofobici (es. Valina e Leucina), di solito le sequenze si trovano localizzate nell’estremità amino terminale, ma possono essere anche sparse lungo l’intera proteina; tuttavia, queste zone idrofobiche vanno ad avvicinarsi formando la cosiddetta zona segnale. Inserzione sulla membrana del RE di una proteina trans membranale bipasso In altri casi in cui il peptide segnale è interno alla proteina, svolge il suo ruolo classico ma non viene rimosso, poi avviene l’intervento della sequenza di stop che permette la collocazione sulla membrana, attraversandola due volte. La parte carbossi-terminale e quella amino-terminale sono entrambe rivolte verso il citosol. Modificazioni delle proteine a livello del RE Dopo la sintesi le proteine subiscono modificazioni covalenti all’interno del lume del RE. In particolare, c’è un enzima specifico che catalizza la formazione di ponti disolfuro, quindi legami ad alta energia che stabilizzano le proteine. Questo avviene per esempio ossidando coppie laterali di catene di cisteina. A livello del RE avviene anche la glicosilazione delle proteine cioè l’aggiunta di oligosaccaridi che portano alla formazione di glicoproteine. Processo di Glicosilazione Il processo di glicosilazione non avviene catalizzando l’aggiunta degli zuccheri uno per volta, ma si effettua il trasferimento di un intero oligosaccaride legato al fosfolipide di membrana dolicolo (terpenoide costituito da un numero variabile di unità di isoprene) sulla proteina, in particolare sul gruppo -NH2. La formazione dell’oligosaccaride avviene precedentemente sul versante del citosol mediante il legame di due gruppi fosfato con il dolicolo e l’aggiunta di cinque residui di mannosio, a questo punto uno specifico trasportatore effettua il “flip flop” del dolicolo che si trova quindi rivolto verso il lume del RE. A questo punto si termina con l’aggiunta di altri residui del mannosio e del glucosio. Glicosilazione dell’Asparagina Attraverso l’intervento dell’oligosaccaril transferasi avviene il legame sul gruppo amminico 4dell’oligosaccaride legato al dolicolo. Il legame tra dolicolo e oligosaccaride è un legame ad alta energia Pirofosfato che permette quindi la glicosilazione mediata dallo specifico enzima, che avviene durante la sintesi della proteina. Glicoproteine La glicosilazione ha lo scopo di formare glicoproteine, infatti l’aggiunta di zuccheri ne permette la protezione da eventi di degradazione, lo stallo all’interno del RE in attesa del corretto ripiegamento o la funzione di segnale di trasporto per permetterne il compattamento in alcune vescicole. Le glicoproteine situate a livello della membrana, formano il glicocalice o partecipando al riconoscimento tra cellule. Controllo qualità ripiegamento e assemblaggio proteine Il ripiegamento della proteina non avviene sempre in modo corretto. Nel caso degli anticorpi formati da un complesso proteico di catene pesanti e leggere legate attraverso ponti disolfuro molto stabili. Il ripiegamento corretto è supportato da specifiche proteine, le proteine chaperon, se ne individua una in particolare cioè la proteina BiP che si lega alla catena pesante dell’anticorpo impedendo un ripiegamento verso la seconda proteina pesante presente nell’anticorpo, questo perché l’anticorpo non è completamente sintetizzato. La solfuro isomerasi è uno specifico enzima che catalizza l’ossidazione dei gruppi SH delle cisteine per formare i legami disolfuro che uniscono le catene dell’anticorpo. Degradazione citosolica delle proteine non correttamente ripiegate La proteina non ripiegata presenta un residuo di glucosio, il quale viene tagliato. Il legame con la calnessina, proteina chaperone, permette il controllo a livello della membrana del RE del corretto avvolgimento delle glicoproteine. Se la proteina è ripiegata correttamente avviene l’intervento di una glicosidasi che rimuove il glucosio; se invece non avviene in modo corretto avviene l’intervento della glicosil transferasi che aggiunge il glucosio permettendo un corretto ripiegamento della proteina. Se la proteina non si ripiega correttamente è probabile che ci sia una mutazione, ma non è così in tutti i casi, infatti la cellula produce un eccesso di proteine proprio perché anche se sintetizzate correttamente, alcune possono presentare problemi di assemblaggio. Le proteine non ripiegate vengono trasportate con uno specifico traslocatore all’esterno dove vengono deglicosilate, si aggiunge l’ubiquitina e il loro ingresso nel proteosoma che le porta alla degradazione. Nella fibrosi cistica la proteina mutata viene inserita sulla membrana ma essendo mutata e quindi non avendo una corretta conformazione non svolge in modo efficace la sua funzione, perciò viene successivamente eliminata, non permettendo l’esocitosi dello ione cloruro. Sintesi dei Lipidi nel RE liscio La sintesi lipidica è svolta a livello della membrana del RE sul versante del citosol, in cui gli enzimi specifici catalizzano le reazioni, essi sono proteine integrali di membrana che hanno i siti attivi rivolti verso il citosol. I lipidi sintetizzati a livello del versante citosolico devono essere distribuiti anche nella seconda metà rivolta verso il lume per bilanciare la distribuzione, questo viene effettuato dalla scramblasi, uno specifico enzima, che garantisce l’accrescimento simmetrico di entrambe le metà. Interazione Ribosoma-Membrana (sperimentalmente) Si introduce a livello del citosol una molecola fluorescente che lega lo ioduro risultando spento; tuttavia, c’è un momento in cui lo ioduro non lega il tracciante che è quindi acceso, questo evidenzia lo stretto legame del ribosoma e il peptide. L’accensione del tracciante successivamente evidenzia che il ribosoma si leghi con un poro acquoso che permette quindi l’ingresso dello ione. Dimostrazione che le proteine secrete sono interne al RE Si centrifuga e si omogeneizza un campione per isolare il RE ruvido, si aggiunge poi la proteasi che non andrà a scomporre le proteine che sono interne al microsoma; per avere conferma di ciò svolgiamo una seconda prova in cui si aggiunge un detergente che disgregando la membrana del microsoma permetterà in questo caso l’azione della proteasi, confermando la prima prova fatta. Trasporto vescicolare (generale) Avviene attraverso gemmazione che permette la formazione di una vescicola, la quale distaccandosi dal compartimento donatore si fonde con un compartimento bersaglio rilasciando il suo contenuto. Le vescicole possiedono specifiche proteine di membrana che vengono poi collocate sul compartimento bersaglio dopo la fusione vescicolare, questo avviene perché le vescicole mantengono il proprio orientamento di membrana. Il RE a livello epatico Il reticolo endoplasmatico liscio si può presentare normalmente sviluppato o ipertrofico, questo accade per esempio in una cellula epatica impegnata in un processo di detossificazione da farmaci liposolubili. L’eccesso di reticolo liscio verrà poi sequestrato all’interno di una vescicola ed eliminato mediante un processo autofagico ad opera dei lisosomi. A livello degli epatociti, ma in generale in tutte le cellule, avviene la sintesi del colesterolo da parte del RE; nel fegato avviene nella zona surrenale. Invece nelle cellule endocrine della corteccia del surrene e nelle gonadi, avviene a livello del reticolo endoplasmatico liscio la sintesi degli ormoni steroidei. A livello epatico avviene la glicogenolisi, la quale viene effettuata dal reticolo che effettua una defosforilazione del glucosio-6-fosfato, trasformandolo in glucosio. Il glucosio attraverserà la membrana attraverso la permeasi e circolare nel sangue per essere trasportato ai tessuti che ne necessitano Reticolo Sarcoplasmatico (Nei Muscoli) Il Reticolo sarcoplasmatico rappresenta una varietà del RE liscio, infatti a livello delle fibre muscolari è presente questo organello che ha il ruolo di immagazzinare il calcio, necessario per la contrazione e quindi per la sinapsi tra la fibra e il terminale assonico del motoneurone