riassunti di Biologia Cellulare e Citogenetica, Sintesi del corso di Biologia Cellulare

Scarica riassunti di Biologia Cellulare e Citogenetica e più Sintesi del corso in PDF di Biologia Cellulare solo su Docsity! citogenetica Federica Crema IL CICLO CELLULARE Il ciclo cellulare attraverso il quale una cellula si replica è un processo di trasferimento di materiale genetico. Esso consiste di 4 fasi: G1, S, G2 (interfase) e M (mitosi). La progressione attraverso le fasi del ciclo cellulare avviene sotto la spinta di reazioni biochimiche favorite dall’attivazione sequenziale di molteplici complessi chinasi ciclina-dipendenti/ciclina (CdK-ciclina). Mentre le CdK Federica crema 1 aa. 2015/2016 e le cicline agiscono insieme per far avanzare il ciclo cellulare (fattori positivi), gli inibitori delle chinasi ciclina dipendenti (CKi) bloccano il ciclo a vari livelli (fattori negativi). La fase G1 è caratterizzata da un’intensa attività metabolica e di sintesi proteica, in preparazione della fase S. Diverso è il destino per le cellule specializzate e altamente differenziate, quali ad esempio i neuroni, che vengono, invece, escluse dal ciclo e restano nella cosiddetta fase G0. In fase S avviene la sintesi di DNA; essa è seguita dalla fase G2, durante la quale i cromosomi si condensano in preparazione alla fase M. La progressione delle 4 fasi dipende appunto dall’attivazione dei complessi CdK-ciclina, mediante fosforilazione di proteine specifiche. Gli studi fatti negli anni 70 sulle uova mature non fecondate di Xenopus laevis avevano dimostrato la presenza di un fattore detto MPF (maturation promoting factor), fondamentale per il passaggio da G2 ad M, per questo, promotore della maturazione. La sua attività è stata scoperta quand, iniettando il citoplasma di uovo maturo non fecondato di Xenopus in ovocita immaturo in fase G2, ne veniva indotta la maturazione e poi la divisione cellulare (fase M). Si estraeva citoplasma proveniente da diversi ovociti maturi, di specie diverse come mammiferi, ricci di mare, lieviti, molluschi, a dimostrazione del fatto che il MPF è presente e conservato in tutti gli eucarioti. Si contano circa 100 geni del ciclo di divisione cellulare, che controllano le varie fasi, il momento adatto per il passaggio da una fase a un’altra e/o l’arresto del ciclo quando necessario. La chiave per la progressione e la regolazione normali del ciclo cellulare è rappresentata proprio dall’interazione tra l’attivazione e la disattivazione delle funzioni delle CdK nelle varie fasi, che, a loro volta, presentano uno o più siti di controllo specifico. Pertanto, l’inizio della mitosi (G2M) è contraddistinto dalla degradazione della ciclina da cui dipendono la scomparsa della membrana nucleare, l’inizio della condensazione dei cromosomi e l’organizzazione dell’apparato del fuso. In particolare, si associa all’inizio della mitosi proprio il MPF, che si identifica nel complesso Cdc2-ciclinaB, essenziale per l’ingresso della cellula nella fase M e per l’uscita dalla medesima mediante, rispettivamente, reazioni di fosforilazione e defosforilazione. La divisione cellulare avviene per: - mitosi è un processo dinamico che produce nuclei figli identici al nucleo da cui hanno avuto origine - meiosi riguarda le cellule diploidi che sono destinate a produrre gameti aploidi. Comprende due successive divisioni: la prima riduzionale (meiosi I) e la seconda equazionale (meiosi II). MITOSI MEIOSI - avviene nelle cellule somatiche - cellule germinali - n° cromosomi invariato - n° cromosomico dimezzato - non appaiamento degli omologhi - sinapsi degli omologhi in profase 1 - non crossing-over tra gli omologhi - crossing-over per ogni coppia - processo conservativo - variabilità dei prodotti Federica crema 2 Esistono 3 classi: A, B e C. sembra che l’erronea regolazione delle Aurora contribuisca allo sviluppo di tumori. Condensazione e segregazione dei cromosomi Condensina: complesso multiproteico che media la condensazione dei cromosomi, ed è costituito da 2 proteine a elica superavvolta contenenti domini ATPasici. Appartengono alla famiglia SMC (Structural Maintenance of Chromosomes). Il complesso della condensina comprende anche proteine che inducono modificazioni conformazionali e topologiche al DNA, provocandone il compattamento. L’accesso del complesso condesina ai cromosomi avviene solo durante la mitosi ed è regolata dalla fosforilazione da parte di Cdk1 di una delle subunità del complesso (in Xenopus, Cdk1 stimola il superavvolgimento della condensina). Anche la fosforilazione degli istoni H1 e H3 è coinvolta nella compattazione dei cromosomi (H3 è fosforilata dalle chinasi Aurora). Coesina: forma e mantiene la connessione tra cromatidi fratelli (dalla replicazione del DNA alla segregazione dei cromatidi). Il complesso della coesina è formato da 2 proteine SMC (diverse da quelle del complesso condensina), e dalle proteine Scc1, Scc3 e Pds5. I cromatidi fratelli vengono separati in 2 fasi con 2 meccanismi diversi. Coesina Condensina Si pensa che la coesina circondi i cromatidi fratelli in una sorta di “abbraccio” per tenerli uniti; il complesso della condensina si serve dell’ATP cellulare per mantenere il DNA cromosomico superavvolto. Profase: rimozione delle coesine dai bracci dei cromosomi, ma non dal centromero. Rimozione dovuta alla fosforilazione di Scc1 da parte di Plk1. Metafase: a livello centromerico la Scc1 è invece degradata dall’azione proteolitica della separasi, che liberando i cromatidi fratelli consente l’inizio dell’anafase. La separasi è normalmente inattiva in quanto legata alla securina. Nel momento della transizione metafase-anafase, la securina viene ubiquitinata e degradata, portando la separasi all’attivazione. APC (Anaphase Promoting Complex): ubiquitina ligasi che degrada la securina e promuove l’ingresso in anafase. Attivo solo durante la mitosi e la fase G1 dove impedisce l’accumulo delle cicline e della securina. L’APC è soggetto a una specificità temporale per il substrato: quando è Federica crema 5 legata a Cdc20 degrada la separasi promuovendo l’ingresso in anafase; quando è legata a Cdh1 degrada la ciclina B e promuove l’uscita dalla mitosi. L’APC è controllata da SAC che controlla il corretto legame dei cromosomi al fuso. Esistono 4 checkpoint nel ciclo cellulare: 1) G1 checkpoint: controllo DNA danneggiato, dimensioni cellulari, presenza di un ambiente favorevole. Questo punto di controllo è chiamato START nel lievito e RESTRICTION POINT negli eucarioti superiori. 2) G1/S checkpoint: controllo DNA danneggiato o replicazione incompleta del DNA. 3) G2 checkpoint: controllo delle dimensioni cellulari, della completa duplicazione e dell’integrità di tutto il materiale genetico, presenza di un ambiente favorevole. È durante questo checkpoint che vengono riparati eventuali danni al DNA. 4) M checkpoint: controllo dell’assemblamento corretto dei cromosomi al fuso mitotico. La struttura di un checkpoint è la seguente: - sensore: registra un’anomalia in un evento (DNA danneggiato o non replicato). - modulo per la trasmissione del segnale: interviene dopo l’identificazione dell’errore. - bersaglio: fa parte del macchinario del ciclo cellulare e viene controllato in modo da produrre l’arresto del ciclo. Punto di controllo dell’assemblaggio del fuso (SAC) Il principale ruolo del sac è di impedire la segregazione dei cromosomi in assenza del corretto attacco bipolare dei cinetocori fratelli. Il mancato o errato attacco dei cinetocori alle fibre del fuso attiva il SAC che genera un segnale di attesa che impedisce che la cellula entri in anafase, fino a che l’attacco dei cromosomi al fuso non sia corretto. Le componenti del SAC risiedono a livello dei cinetocori. Alcune componenti sono chinasi e molte componenti vengono fosforilate. Il malfunzionamento del SAC provoca l’erronea segregazione dei cromosomi. Conseguenze: morte cellulare, aneuploidie, cancro. Regolazione del ciclo cellulare e cancro La perdita di regolazione del ciclo cellulare può portare all’insorgenza del cancro. Proto-oncogeni codificano proteine che promuovono l’entrata delle cellule nel ciclo cellulare. Gli oncosoppressori codificano proteine che inibiscono il progredire nel ciclo cellulare. Mutazioni a carico di questi geni possono alterare la funzionalità dei checkpoint e portare al cancro. Mutazioni a carico di geni codificanti proteine che regolano la segregazione cromosomica possono generare anomalie cromosomiche di alcuni tipi di cellule tumorali (es. Mad2 e altre componenti del Federica crema 6 SAC). Funzionalità del SAC e la sua tempestiva inattivazione sono indispensabili alla stabilità del genoma. I CROMOSOMI Apparato del fuso mitotico La formazione dell’apparato mitotico inizia con la comparsa dei centrosomi, da cui originano i poli verso cui si sposteranno i cromosomi all’inizio dell’anafase. In molti animali, compreso l’uomo, essi sono associati a centrioli, strutture formate da microtubuli e presente a coppie nella cellula durante la duplicazione. Prima della mitosi i centrioli si duplicano e costituiscono i centri di organizzazione del fuso mitotico. Si distinguono due tipi di fibre: le fibre polari, che attraversano la cellula unendo i due poli, le fibre centromeriche, che si attaccano all’interno della regione centromerica direttamente al cinetocore. Dopo l’inserimento dei microtubuli all’interno del cinetocore, i cromatidi segregano e cominciano a muoversi verso i poli opposti della cellula. Il movimento lungo i microtubuli del fuso, determinato dall’azione combinata del cinetocore e dall’interazione fisica dei microtubuli polari, porta a far sì che essi si accorcino per perdita di singole subunità: questo è il segnale della fine della metafase e dell’ingresso in anafase. La separazione simultanea dei cromatidi fratelli avviene dopo l’allineamento dei cromosomi sul piano equatoriale della cellula, per proteolisi della proteina ISS, la cui funzione sarebbe quella di inibirne la separazione. In questi processi è fondamentale il ruolo svolto dal cinetocore, per la corretta segregazione dei cromosomi in meiosi e mitosi. Federica crema 7 centromero, anche se non si può escludere l’esistenza di sequenze correlate simili comuni a questi organismi e non ancora individuate. Centromero in Mus musculus Il cromosoma tipico del topo appare telocentrico; l’assenza del braccio corto è visibile citogeneticamente eccetto che nel cromosoma Y, in cui si osserva un braccio corto di piccole dimensioni (acrocentrico) contenente pochi geni. Due solo le classi di DNA ripetuto presenti in questa specie: DNA satellite maggiore e DNA satellite minore. Il primo è presente in quasi tutte le specie ed è costituito da milioni di ripetizioni in tandem di un monomero di 234 pb, per genoma aploide identificato nelle regioni pericentriche di tutti i cromosomi eccetto l’Y. Il secondo è molto meno abbondante, costituito da ripetizioni di monomeri di 120 pb organizzato in blocchi di 300 kb, circa 2500 copie per cromosoma ed è localizzato esclusivamente nei centromeri tranne che nel cromosoma Y. Studi molecolari hanno permesso di attribuire al DNA satellite minore un ruolo nella formazione e funzionalità del centromero. Centromero degli eucarioti superiori Nei metazoi e nelle piante superiori i cromosomi sono più lunghi e presentano centromeri molto più complessi. Negli organismi superiori il cinetocore controlla l’assemblaggio e il disassemblaggio dei microtubuli attaccati e, attraverso la presenza di motori molecolari, guida i movimenti cromosomici. Al microscopio elettronico è stato osservato che, sui lati opposti del centromero all’esterno, i cromosomi replicati presentano i cinetocori a forma di disco, distinto in domini strutturalmente differenziati: un dominio esterno, 34-50 nm di spessore, e un dominio interno, associato con l’eterocromatina centromerica. In molti mammiferi sono state isolate proteine diverse con differente peso molecolare: CENP-A (18 kDa), CENP-B (80 kDa), CENP-C (140 kDa), CENP-D, CENP-G, CENP-H, sebbene non sia chiaro per tutte il contributo alla funzionalità del centromero. La CENP-A, confinata nelle regioni centromeriche del cromosoma, è una proteina istonica di tipo H3. La CENP-B è localizzata nell’eterocromatina centromerica dell’uomo e di topo e riconosce una sequenza di 17 pb, la CENP-B box. La localizzazione di questa proteina nei cromosomi pseudocentrici o policentrici, sia in centromeri attivi che inattivi, indica che non è da sola sufficiente per dare origine a un nuovo centromero. Pertanto, la sua assenza nei neocentromeri attivi umani e nel centromero del cromosoma Y di uomo e topo consente di affermare che essa non sia indispensabile, oppure che sia funzionalmente ridondante. La CENP-C è essenziale per la stabilità dei cromosomi, per la segregazione in mitosi e per il controllo del ciclo cellulare in G1. È una proteina centromerica evolutivamente conservata, presente nel dominio interno del centromero attivo. Neocentromeri Centromeri ectopici che si formano occasionalmente in regioni non centromeriche, solitamente all’interno di regioni di genoma codificante. Federica crema 10 Assenza di DNA satellite, formano comunque una costrizione primaria e inducono l’assemblaggio del cinetocore. Nell’uomo identificati circa 70 neocentromeri, localizzati in genere su cromosomi riarrangiati. Individuati in carcinomi umani e spesso associati a malattie genetiche. Compaiono in seguito a riarrangiamenti che producono frammenti acentrici. Occasionalmente compaiono in cromosomi non riarrangiati, come in HSA3: trovato in un individuo fenotipicamente normale, nuovo centromero attivo e centromero endogeno inattivato. Cromosoma mitoticamente stabile. Comparsa di neocentromeri in individui fenotipicamente normali: formazione di neocentromeri come meccanismo di evoluzione cariotipica. Telomero Il telomero è un complesso di DNA-proteine presente all’estremità di tutti i cromosomi. Ogni telomero consiste di una lunga serie di sequenze brevi ripetute in tandem, con lo scopo di proteggere i cromosomi contro tutti quegli eventi che ne potrebbero favorire l’instabilità, quali la degradazione delle regioni terminali, la fusione di un telomero con un altro o con un’estremità rotta di DNA oppure una ricombinazione inopportuna. A differenza del centromero, non è possibile distinguere il telomero citologicamente. Quando un cromosoma parentale è reduplicato, si originano due nuove molecole di DNA, ciascuna con un primer di RNA in posizione 5’, nella regione del telomero di ogni elica di nuova sintesi. I primer di RNA vengono eliminati, lasciando un’interruzione (gap) al 5’ della nuova elica. Dato che l’enzima DNA-polimerasi può sintetizzare nuovo DNA solo in direzione 5’3’ a partire da un innesco, il gap che si è venuto a formare non potrà essere riempito da questo enzima, poiché non può iniziare una nuova sintesi. In mancanza di un sistema capace di ripristinare la lunghezza del telomero, i cromosomi diventerebbero, ad ogni ciclo, più corti. La scoperta di una trascrittasi inversa, denominata telomerasi, ha consentito di chiarire le problematiche poste dalla replicazione dei telomeri. Infatti è stato dimostrato che l’enzima telomerasi è responsabile del mantenimento della lunghezza dei cromosomi attraverso l’aggiunta di ripetizioni telomeriche alle estremità dei cromosomi stessi. La telomerasi è un enzima costituito da una porzione proteica e da una porzione di RNA, complementare all’unità ripetuta dei telomeri. Possiede tre domini funzionali: Sito di ancoraggio: è una subunità proteica. Sito di stampo: è una molecola di RNA stampo. Sito di taglio. Pertanto, l’enzima si lega alla sequenza ripetuta telomerica che sporge alla fine del cromosoma. Subito dopo, la telomerasi catalizza la sintesi di 3 nt di nuovo DNA (TTG) usando, come stampo, l’RNA della telomerasi, che quindi slitta verso la fine del cromosoma, in modo che il suo AAC, all’estremità 3’ dell’RNA stampo, si possa appaiare con il DNA TTG di neosintesi. Poi, la telomerasi sintetizza il resto di TTGGGG ripetendo più volte il processo per aggiungere più Federica crema 11 ripetizioni telomeriche e far sì che il cromosoma venga allungato. Il gap, originatosi nel DNA dopo la rimozione del primer, viene riempito e il nuovo DNA cromosomico allungato. La telomerasi è definita trascrittasi inversa proprio per il fatto che la sintesi di DNA usa RNA come stampo. Nei Ciliati, l’RNA telomerasico è legato dalla proteina P43, che è in grado di guidare la sua maturazione e localizzazione a livello del nucleo. Nell’uomo, l’RNA telomerasico matura probabilmente nel nucleolo. Durante lo sviluppo embrionale, l’espressione della telomerasi umana è drasticamente ridotta in molte cellule somatiche, per cui le estremità del cromosoma si accorciano con le successive divisioni cellulari. Essa è regolata a livello della trascrizione del gene hTERT, mediante un gene repressore nel cromosoma 3, che controlla lo stato della cromatina e induce l’arresto della trascrizione. Nell’uomo, le cellule che conservano un’attività telomerasica sono i linfociti, le cellule del testicolo, le cellule epiteliali proliferanti; le cellule staminali, invece, presentano una debole attività telomerasica. L’espressione della telomerasi è necessaria per una proliferazione illimitata di organismi unicellulari come il lievito e i protozoi, così come per le cellule immortali negli organismi pluricellulari (germinali, staminali, cancerose). Negli esseri umani la diminuzione della lunghezza dei telomeri è correlata con l’inizio della mortalità cellulare legata all’età. La lunghezza dei telomeri, nell’uomo, varia da 5 a 15 kb, mentre nl lievito è sui 300 nt. Il tasso di accorciamento del telomero, senza telomerasi, corrisponde a 50-200 nt per ciclo di replicazione nell’uomo e a 3 nt per generazione nel lievito. Nel lievito, inoltre, l’enzima allunga i telomeri in tarda fase S, probabilmente per la replicazione semiconservativa del DNA. Federica crema 12 Occorre sottolineare che per gruppi di 6 nucleosomi si verifica un ulteriore avvolgimento che origina una struttura cilindrica (solenoide) presente sia nei cromosomi eucariotici in interfase che in metafase, con l’eccezione di alcuni protisti. Eucromatina ed eterocromatina L’intero complesso di DNA nucleare-proteine, noto come cromatina, costituisce la struttura dei cromosomi eucarioti. In base al grado di compattazione si formano regioni di DNA scarsamente ripetitivo, o eucromatina, attive a livello trascrizionale e contenenti una quantità di proteine non istoniche maggiore rispetto all’area più compatta, o eterocromatina, composta prevalentemente da sequenze ripetitive e inattive nella trascrizione. Infatti il notevole grado di compattezza del DNA, che caratterizza l’eterocromatina, impedisce la trascrizione, cosicché i pochi geni restino permanentemente bloccati. Eterocromatina Nel 1928 Heitz, osservando i cromosomi del muschio, ebbe la possibilità di riconoscere l’esistenza, sul cromosoma, di aree fortemente colorate, che definì per la prima volta eterocromatina, in quanto diverse dal resto del cromosoma, che appariva colorato meno intensamente. La colorazione più carica dell’eterocromatina in interfase dipende dalla condensazione del DNA che risulta, per questo, più concentrato. Si deve a Brown, nel 1966, l’ulteriore distinzione dell’eterocromatina in costitutiva e facoltativa. Quando nei cromosomi le regioni di eterocromatina sono presenti costantemente in tutte le cellule, l’eterocromatina è costitutiva. Quando l’eterocromatina è presente solo temporaneamente e in alcune cellule, è detta facoltativa. Le caratteristiche che contraddistinguono l’eterocromatina dall’eucromatina sono: - la replicazione tardiva in fase S; - l’adesività che, in interfase, porterebbe alla fusione dei satelliti dei cromosomi acrocentrici nell’uomo e nel topo, giustificando la frequente associazione che essi manifestano. - la fragilità, che predispone alla rottura dando origine a riarrangiamenti cromosomici. In Drosophila si conoscono due tipi di eterocromatina costitutiva: alfa e beta. Il primo è formato da eterocromatina costitutiva sotto forma di blocchi polimorfici individuabili nel bandeggio C, nei quali sono assenti i chiasmi associati alla ricombinazione. Il tipo beta è riconoscibile nei cromosomi politenici di D., contiene geni univi e forma chiasmi nei processi di ricombinazione omologa. L’eterocromatina facoltativa può acquisire i caratteri dell’eucromatina a seconda della cellula e dello stadio del suo differenziamento. La quantità totale di eterocromatina facoltativa dipende dal tipo di cellule; sembra che le cellule altamente differenziate ne contengano di più rispetto alle cellule embrionali. Questo suggerisce che, man mano che la cellula si sviluppa, viene inattivato in modo permanente un numero sempre più elevato di geni che vengono a trovarsi incapsulati in una struttura fortemente condensata e tale da non renderli più attivi. L’eterocromatina facoltativa, Federica crema 15 quindi, rifletterebbe la differente attività genica dei vari tipi di cellule, in base alla quale le sequenze di DNA, secondo le varie fasi del ciclo cellulare, possono decondensarsi ed essere trascritte. Si tratta essenzialmente di DNA eucromatinico che, durante fasi particolari dello sviluppo, viene inattivato specificamente. L’inattivazione dipende dalla metilazione di ampie regioni del cromosoma X, che si verifica con l’addizione di un gruppo metilico (CH3) al carbonio in posizione 5 delle citosine. L’esempio più noto di eterocromatina facoltativa è rappresentato dal cromosoma X delle cellule somatiche femminili dei mammiferi. In queste cellule uno dei due cromosomi X presenti, a caso, viene inattivato parzialmente allo stadio di morula o blastula, quindi in stadi precoci dello sviluppo embrionale. L’inattivazione riguarda, con eguale probabilità in tutte le cellule embrionali, il cromosoma X di origine materna o quello di origine paterna. Diverso è il comportamento dei cromosomi X dei Marsupiali, in cui obbligatoriamente viene inattivato il cromosoma X paterno subito dopo la fecondazione e tale resta in tutte le cellule. A tale proposito, la genetista Mary Lyon formulò nel 1961 una teoria, nota come ipotesi di Mary Lyon, basandosi sui risultati ottenuti dagli studi sul colore del pelo del topo, che è un carattere X- linked. Se confrontato con il cromosoma X attivo, appare che il cromosoma X inattivo dei mammiferi, senza eccezione per l’uomo, contiene estese regioni di DNA metilato. L’inattivazione, detta anche “lyonizzazione”, induce il cromosoma a replicarsi in ritardo in fase S e a non essere trascritto. L’ipotesi di Lyon ha permesso di spiegare il meccanismo che impedisce lo squilibrio genico tra le cellule femminili (XX) e quelle maschili (XY), noto come compensazione del dosaggio genico. L’inattivazione parziale è dovuta al fatto che i geni, contenuti nella regione distale del braccio corto del cromosoma X, regione PAR, sfuggono al processo di metilazione e rimangono costantemente attivi. Il cromosoma X inattivo rimane in uno stato altamente condensato ed è possibile riconoscerlo nelle cellule somatiche sotto forma di una piccola massa di cromatina aderente alla membrana nucleare, nota come corpo di Barr. Nelle cellule somatiche femminili si osserva un solo corpo di Barr; se il numero di cromosomi X è superiore a due, essi vengono inattivati tutti eccetto uno. Il numero di corpi di Barr osservati nelle cellule somatiche corrisponde, pertanto, al numero dei cromosomi X iattivati: n(Barr) = n(cromosomi X) - 1. L’inattivazione del cromosoma X è un esempio di fattore epigenetico che influenza l’espressione genica senza indurre cambiamenti nella sequenza di DNA. L’eterocromatina costitutiva è presente in tutti gli eucarioti superiori, dagli animali alle piante, variabile in percentuale dal 20 all’80%; nelle piante è più frequente nei telomeri sotto forma di blocchi oppure di segmenti intercalari lungo il cromosoma. È formata soprattutto da DNA mediamente e altamente ripetuto; è localizzata nella regione dei centromeri, dei telomeri e in vicinanza della regione dell’organizzatore nucleolare (NORs), nei cromosomi acrocentrici umani e nel braccio lungo del cromosoma Y. Le sequenze altamente ripetitive di DNA sono note come DNA satellite. DNA di questo tipi non è trascritto e praticamente costituisce il grosso dell’eterocromatina del genoma localizzata nel centromero (eterocromatina pericentromerica). Il termine DNA satellite deriva dagli studi effettuati per identificare il primo DNA centromerico umano. Infatti esso viene isolato da tre frazioni genomiche di DNA, aventi diverse densità di galleggiamento in gradiente di cloruro di cesio. Queste frazioni di DNA vennero indicate come Federica crema 16 satellite I, satellite II e satellite III. Studi di ibridazione in situ nell’uomo hanno dimostrato che il DNA satellite I, II, III è presente in tutti i cromosomi nella regione pericentromerica e nel cromosoma Y nel terzo distale del braccio lungo. Oltre ai satelliti I, II e III si distinguono: il satellite alpha (DNA alfoide) che costituisce il 3/5% circa di DNA di ciascun cromosoma e il 10% del DNA genomico totale. Il monomero alfoide, di 171 pb, è presente in tutti i cromosomi e forma blocchi che vanno da 250 kb nel cromosoma Y a 5000 kb nel cromosoma 11. Il satellite beta è organizzato in tandem; è ricco in G C ed è costituito da monomeri di 68 pb. Il satellite gamma è stato isolato inizialmente come ripetizioni di 220 pb in tandem, derivanti dal cromosoma 8, e poi identificato nel cromosoma X. Come si diffondono le sequenze ripetute nel genoma: 1) Slittamento della replicazione Lo slittamento del complesso di replicazione si verifica quando brevi ripetizioni contigue causano un mispairing tra le ripetizioni vicine durante la replicazione del DNA. 2) Amplificazione/contrazione con il meccanismo del cerchio rotante: Una sequenza satellite ancestrale viene amplificata mediante crossing over ineguale. Questa regione si ibrida su se stessa, si circolarizza e si dissocia dal filamento, formando DNA circolare. Nel caso di perdita di questo DNA ci sarà una riduzione della regione satellite; al contrario, il DNA circolarizzato può replicarsi mediante un meccanismo a cerchio rotante per poi reinserirsi nel DNA cromosomico, portando ad un’amplificazione della regione satellite. 3) crossing-over ineguale: è il meccanismo più accreditato Se l'allineamento tra i due cromosomi è impreciso, i punti di rottura e scambio non si trovano alla stessa altezza sui due cromosomi, dopo lo scambio si avrà un cromosoma più lungo, con duplicazione di una parte del materiale genetico, e uno più corto, con una perdita parziale di materiale genetico. Il fenomeno viene chiamato crossing-over ineguale, ed avviene tipicamente in corrispondenza di regioni ripetute in tandem, perché una serie di moduli uguali ripetuti si può appaiare in modo "sfasato". Cromomeri Mediante il microscopio elettronico, all’inizio della profase, è possibile visualizzare i cromosomi. In questa sono riconoscibili, lungo i filamenti, aree di cromatina despiralizzata intervallate da granuli sottili che acquistano più consistenza man mano che i cromosomi si contraggono. Questi granuli, dovuti alla forte condensazione della cromatina, sono denominati cromomeri. Essi diventano sempre meno evidenti via via che i cromosomi passano dalla metafase all’anafase e per individuarli è necessario un opportuno trattamento ipotonico durante la coltura oltre a particolari tecniche di bandeggio. Federica crema 17 un’elevata concentrazione di RNA. I cromosomi politenici non sono specifici dei Ditteri, ma sono osservati anche nei Ciliati e nelle piante. Cromosomi B Sono una classe eterogenea di cromosomi, in termini di natura, comportamento e dinamica evolutiva, comuni in molte piante (mais) e in alcuni animali (ortotteri) ma assenti nelle cellule umane. Sono elementi non indispensabili e possono essere presenti o assenti negli individui di una popolazione. Durante la meiosi non si appaiano e non ricombinano con alcun elemento che compone il set diploide standard (cromosomi A). sono quindi ereditati in modo non mendeliano e irregolare, seppure derivino dai cromosomi A. sono generalmente più piccoli dei cromosomi A, a volte microcromosomi. Sono presenti nel nucleo come cromosomi soprannumerari, estremamente variabili nel numero e nella funzione. Possono segregare normalmente sia in mitosi che in meiosi; sono costituiti da eterocromatina ma alcuni anche da eucromatina. Il fatto che il fenotipo non sembra influenzato dalla loro presenza ha indotto gli studiosi a pensare che possa trattarsi di forme antiche di cromosomi privi, ormai, di funzionalità ma con una probabile influenza sulla frequenza dei chiasmi e sulla fecondità dei portatori. È comunque certo che la loro conservazione è la dimostrazione che il DNA non attivo possa essere conservato a lungo in una popolazione cellulare. Stretta associazione dei cromosomi B con il sesso femminile. Cromosomi dei protisti I protisti costituiscono una classe di eucarioti unicellulari, in cui l’organizzazione e la funzionalità della cromatina sono molto variabili. Anche se le numerose differenze farebbero ipotizzare l’esistenza di tipi diversi di cromosomi sembra che ciò non corrisponda a verità. Rispetto alla struttura dei cromosomi il gruppo più eterogeneo è quello dei Dinoflagellati (organismi planctonici), nei quali le proteine legate al DNA sono diverse dagli istoni tipici degli eucarioti. Sono proteine basiche con alcune modificazioni nella sequenza degli amminoacidi. Nella molecola di DNA, la maggior parte della timidina è costituita dal 5-idrossimetiluracile e sono stati identificati molti elementi (Fe, Cu, Zn, Ni e Ca) che conferiscono stabilità alla struttura del cromosoma per mezzo di ponti ionici. I primi studi descrissero questi cromosomi simili a cromosomi acentrici; in seguito, con il microscopio elettronico, è stato possibile individuare una regione analoga al centromero, che in certi casi era coinvolta nel processo di cariocinesi. Cromosomi Piumosi o A spazzola I cromosomi piumosi sono presenti negli oociti I (diplotene) in tutti gli animali le cui uova si sviluppano molto rapidamente, eccetto in alcuni insetti. Il fatto che non compaiano nei mammiferi sembra coerente con il lento sviluppo di questi vertebrati. I più studiati sono quelli degli oociti degli anfibi. Nella Salamandra triturus e nella S. viridiscens essi raggiungono un diametro di 500 micron con lunghezza variabile fino a 1000 micron. Struttura= Dal cromomero, che è formato da 4 parti tenute insieme da proteine che funzionano come una colla, emergono anse asimmetriche, che manifestano un ispessimento sempre più consistente, a mano a mano che ci si allontana dal punto d’origine; l’asse è invece formato dai cromatidi fratelli. All’estremità sottile dell’ansa c’è un sito Federica crema 20 promotore; il sito di stop non funziona. L’osservazione di anse molto lunghe ha rivelato la presenza di più unità di trascrizione in tandem. Il numero di unità di trascrizione coincide con il numero dei geni funzionali. L’intensa attività trascrizionale che avviene nelle anse ne induce la contrazione o la distensione, a seconda della necessità, provocando un accumulo di RNA e proteine. Questa attività indispensabile nelle prime fasi dello sviluppo embrionale permette una straordinaria amplificazione dei geni per la sintesi di rRNA al fine di soddisfare l’esigenza proteica degli oociti e quindi dell’embrione in sviluppo (l’embrione usa l’rRNA materno fino alla gastrulazione. Questo significa che un gene mutato, contenuto nel patrimonio genetico dell’embrione, non viene trascritto e che l’effetto del prodotto alterato non si manifesta nel fenotipo nei primi stadi dello sviluppo.) I cromosomi piumosi manifestano un caratteristico comportamento in rapporto all’organizzatore nucleolare. È noto che nel corredo aploide almeno un cromosoma contiene la regione dell’organizzatore nucleolare (NOR) che forma un nucleolo per ogni ciclo cellulare. L’organizzatore nucleolare del cromosoma piumoso produce di continuo nucleoli, che poi si liberano e restano sospesi nel nucleoplasma. La sintesi di rRNA che ne consegue determina una notevole concentrazione del materiale nucleolare, tanto che il nucleo degli oociti arriva a contenere molte migliaia di nucleoli, cosiddetti accessori. Nelle specie con cromosomi piumosi, la quasi totalità dell’attività trascrizionale di rRNA e dell’assemblaggio dei ribosomi avviene nei nucleoli accessori. Questa peculiarità dei cromosomi rappresenta un’ulteriore specializzazione per favorire l’intensa attività trascrizionale di RNA (tutti i tipi) necessario per la crescita citoplasmatica degli oociti in diplotene. Negli uccelli, il cromosoma a spazzola termina con un cromomero a cui è associata un’ansa aperta. Questa breve unità trascrizionale terminale sull’ansa telomerica rappresenta unicamente la trascrizione del filamento C-ricco della ripetizione telomerica TTAGGG. Cromosomi sessuali Nei mammiferi, uomo compreso, e in molti insetti il sesso è determinato da una coppia di cromosomi, i cosiddetti cromosomi sessuali o eterocromosomi. Le femmine hanno due copie del cromosoma X e i maschi un Y e un X. Si parla di omogametia femminile e eterogametia maschile. I primi antenati dei mammiferi non presentavano cromosomi sessuali specifici, cosicchè Federica crema 21 la determinazione del sesso avveniva in base a fattori ambientali esterni (come avviene tutt’ora per i rettili). La separazione dei sessi risale a 300 milioni di anni fa, quando in un antenato comune non mammifero un cromosoma X si è separato da una coppia di omologhi omeomorfi XX ed è diventato cromosoma Y. In seguito a mutazione genica, infatti, un gene del cromosoma X si è modificato tanto da diventare il gene (che oggi sappiamo essere il SRY) in grado di innescare il processo di sviluppo dell’embrione in senso maschile. Il cromosoma, che per una serie di mutazioni non poteva più scambiare pezzi di DNA con l’altro cromosoma X, è diventato il cromosoma Y. Il gene SRY non è l’unico responsabile della determinazione sessuale maschile, ma ci sono altri geni autosomici responsabili di questo, tipo SOX3 nel cromosoma X, SOX9 in 17q etc. Quindi si può affermare che il cromosoma Y derivi dal cromosoma X. In altre specie animali, uccelli, rettili e certi pesci, esiste omogametia maschile (ZZ) ed eterogametia femminile (ZW). Molti studi dimostrano che il cromosoma Z corrisponde al cromosoma X dei mammiferi ma, a differenza di quanto avviene nelle femmine XX, nel maschio ZZ non si verificano fenomeni di metilazione per compensare il dosaggio genico dei sessi. Il cromosoma W contiene sequenze altamente ripetute di DNA ed è uniformemente eterocromatico. L’ornitorinco possiede 10 cromosomi sessuali: il maschio è (XY)x5 mentre la femmina è XXXXXXXXXX. Date le caratteristiche di tali cromosomi, alcune simili a quelle dei mammiferi e altre a quelle degli uccelli, si è ipotizzato che uccelli e mammiferi abbiano avuto un percorso evolutivo in parte comune prima della separazione. È stata inoltre descritta la presenza del gene DMRT1, simile all’omonimo localizzato nel cromosoma Z degli uccelli e che, in doppia copia (ZZ), determina il maschio, mentre in singola copia (ZW) la femmina. Nei mammiferi e in drosophila sono stati individuati, rispettivamente, due meccanismi che renderebbero equilibrata l’espressione dei geni X-linked tra i sessi. Il maschio di D. pur possedendo una sola dose di geni X-linked, raddoppia la propria attività trascrizionale per eguagliare quella della femmina XX, al contrario di quanto accade nei mammiferi in cui un cromosoma X nelle femmine XX viene metilato per raggiungere l’equilibrio genico con il maschio XY. Per quanto riguarda i cromosomi X e Y dei mammiferi, occorre sottolineare la loro differenza morfologica: il cromosoma X è un cromosoma submetacentrico con elevato contenuto genico e con ampie regioni eterocromatiniche, mentre il cromosoma Y è un piccolo cromosoma acrocentrico senza satelliti, presente in singola copia solo nei maschi e con pochi geni (circa 27). L’omologia dei cromosomi X e Y è confinata, poi, solo in una breve regione distale del braccio corto di entrambi, denominata PAR, che nel cromosoma Y non supera il 5% del cromosoma. Federica crema 22