Riassunto libro abbas di immunologia, Sintesi del corso di Immunologia

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IMMUNOLOGIA Riassunto Abbas IX edizione  2 Sommario CARATTERISTICHE GENERALI DELLE RISPOSTE IMMUNITARIE ...................................................... 8 CARATTERISTICHE DELL’IMMUNITA’ UMORALE E CELLULARE ............................................................... 9 RISPOSTE IMMUNITARIE AI MICROBI .................................................................................................. 10 CELLULE E TESSUTI DEL SISTEMA IMMUNITARIO ....................................................................... 13 MASTOCITI, BASOFILI ED EOSINOFILI ......................................................................................... 15 CELLULE DENDRITICHE ............................................................................................................... 16 LINFOCITI .................................................................................................................................. 16 LINFOCITI B ......................................................................................................................................... 17 LINFOCITI T ......................................................................................................................................... 17 LINFOCITI NAIVE ................................................................................................................................. 18 LINFOCITI DELLA MEMORIA ................................................................................................................ 19 CELLULE NATURAL KILLER E CELLULE LINFOIDI INNATE CHE SERCERNANO CITOCHINE ............... 20 TESSUTI LINFOIDI ...................................................................................................................... 20 MIDOLLO OSSEO ................................................................................................................................. 20 LINFONODI E SISTEMA LINFATICO ....................................................................................................... 22 MILZA ................................................................................................................................................. 22 SISTEMA IMMUNITARIO DELLA CUTE E DELLE MUCOSE ...................................................................... 23 RECLUTAMENTO DEI LEUCOCITI NEI TESSUTI ............................................................................. 24 CARATTERISTICHE GENERALI DELLA MIGRAZIONE DEI LEUCOCITI .............................................. 24 SELECTINE E LIGANDI DELLE SELECTINE ............................................................................................... 24 INTEGRINE E LINGANDI DELLE INTEGRINE ........................................................................................... 25 CHEMOCHINE E RECETTORI PER LE CHEMOCHINE ............................................................................... 26 ATTIVITA’ BIOLOGICHE DELLE CHEMOCHINE ........................................................................................................ 27 INTERAZIONE LEUCOCITI-CELLULE ENDOTELIALI E RECLUTAMENTO DEI LEUCOCITI NEI TESSUTI ......... 28 MIGRAZIONE DI NEUTROFILI E MONOCITI NEI SITI DI INFEZIONE O DI DANNO TISSUTALE .................. 29 MIGRAZIONE E RICIRCOLAZIONE DEI LINFOCITI T ................................................................................ 29 MIGRAZIONE DEI LINFOCITI T DELLA MEMORIA .................................................................................. 33 HOMING DEI LINFOCITI B .................................................................................................................... 33 IMMUNITA’ INNATA .................................................................................................................. 35 RICONOSCIMENTO DELL’IMMUNITA’ INNATA E ADESIONE ................................................................. 36 RECETTORI DELL’IMMUNITA’ INNATA ................................................................................................. 37 RECETTORI TOLL-LIKE ............................................................................................................................................. 37 RECETTORI CITOSOLICI PER PAMP E DAMP .......................................................................................................... 38 5 TOLLERANZA IMMUNOLOGICA E AUTOIMMUNITA’ ................................................................ 122 Tolleranza centrale dei linfociti T ...................................................................................................... 123 Tolleranza periferica dei linfociti T .................................................................................................... 123 Anergia ............................................................................................................................................. 123 Regolazione da parte dei recettori inibitori ........................................................................................................ 124 Inibizione da parte dei linfociti T regolatori (Treg) ............................................................................. 124 Delezione dei linfociti T mediante apoptosi ...................................................................................... 126 Tolleranza dei linfociti B .......................................................................................................... 127 Tolleranza centrale dei linfociti B ...................................................................................................... 127 Tolleranza periferica dei linfociti B .................................................................................................... 128 Tolleranza agli antigeni e ai microbi commensali .............................................................................. 128 Meccanismi che regolano l’autoimmunità ........................................................................................ 129 Alcune mutazioni che causano malattie autoimmuni ........................................................................................ 130 MALATTIE DA IPERSENSIBILITA’ ............................................................................................... 131 Malattie causate da anticorpi ........................................................................................................... 132 Malattie causate da anticorpi contro antigeni espressi da cellule e tessuti ...................................................... 132 Malattie da immunocomplessi ............................................................................................................................ 132 Malattie causate da linfociti T ........................................................................................................... 133 Ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) ................................................................................................................. 134 Approcci terapeutici alle malattie con base immunitaria .................................................................................. 134 MALATTIE ............................................................................................................................... 136 Lupus eritematoso sistemico ............................................................................................................ 136 Artrite reumatoide ........................................................................................................................... 143 Sclerosi multipla ............................................................................................................................... 146 Diabete di tipo 1 ............................................................................................................................... 147 Agammaglobulinemia di Bruton ....................................................................................................... 151 LAD: deficit di adesione leucocitaria ................................................................................................. 151 Malattia granuloematosa cronica ..................................................................................................... 151 Morbo di Graves ............................................................................................................................... 152 MALATTIA DA ANTICORPI ANTI-FOSFOLIPIDI (APS) ........................................................................... 153 ALLERGIE ................................................................................................................................. 157 Produzione di IgE .............................................................................................................................. 157 Cellule coinvolte nelle reazioni allergiche ......................................................................................... 159 Eosinofili ............................................................................................................................................................... 161 Reazione immediata ......................................................................................................................... 162 Teoria dell’igiene ................................................................................................................................................. 162 Malattie a base allergica: patogenesi e terapia ................................................................................. 162 Anafilassi sistemica .............................................................................................................................................. 163 Asma bronchiale .................................................................................................................................................. 163 Rinite allergica ..................................................................................................................................................... 164 Allergie alimentari ............................................................................................................................................... 164 6 Orticaria ............................................................................................................................................................... 164 Dermatite atopica ................................................................................................................................................ 164 IMMUNODEFICIENZE ............................................................................................................... 166 Immunodeficienze congenite o primarie ........................................................................................... 166 Deficit dell’immunità innata ............................................................................................................. 166 Deficit di adesione leucocitaria ........................................................................................................................... 167 Deficit delle cellule NK e dei fagociti ................................................................................................................... 167 Asplenia congenita isolata ................................................................................................................................... 168 Immunodeficienze combinate gravi .................................................................................................. 168 Sindrome del linfocita nudo ................................................................................................................................ 169 AGAMMAGLOBULINEMIA DI BRUTON ................................................................................................................ 169 Sindrome iper-IgE ................................................................................................................................................ 169 Sindrome iper-IgM ............................................................................................................................................... 170 Linfoistiocitosi emofagocitica familiare .............................................................................................................. 171 Immunodeficienze acquisite o secondarie ......................................................................................... 172 Virus dell’immunodeficienza umana e sindrome dell’immunodeficienza acquisita ................... 172 Caratteristiche molecolari e biologiche dell’HIV ................................................................................ 172 Patogenesi dell’infezione da HIV e dell’AIDS ..................................................................................... 174 HIV DALLE SBOBINE ................................................................................................................. 175 Terapia HIV dalle sbobine ................................................................................................................. 179 CITOCHINE .............................................................................................................................. 181 Interferoni ........................................................................................................................................ 183 IL-2 ................................................................................................................................................... 183 IL-4 ................................................................................................................................................... 184 IL-5 ................................................................................................................................................... 184 IL-13 ................................................................................................................................................. 184 IL-1 ................................................................................................................................................... 185 IL-10 ................................................................................................................................................. 186 IL-12 ................................................................................................................................................. 186 FARMACI ................................................................................................................................. 188 Anakinra ........................................................................................................................................... 188 Ciclosporina A ................................................................................................................................... 188 Etanercept ........................................................................................................................................ 190 Siltuximab ........................................................................................................................................ 190 Tocilizumab ...................................................................................................................................... 191 Interferone alfa ................................................................................................................................ 191 Interferone beta ............................................................................................................................... 191 Interferone gamma ........................................................................................................................... 192 Tacrolimus ........................................................................................................................................ 192 Rituximab ......................................................................................................................................... 193 7 Natalizumab ..................................................................................................................................... 193 Sirolimus (rampamicina) ................................................................................................................... 194 Pirfenidone ....................................................................................................................................... 195 Ciclofosfamide .................................................................................................................................. 195 10 l’inoculazione di anticorpi/linfociti specifici crea invece un tipo di immunità che non prevede l’esposizione dell’immunizzato all’antigene: si parla di immunità passiva. Un esempio di immunità passiva naturale è il trasferimento di anticorpi materni al feto. In ambito clinico l’immunità ad un microbo viene sempre misurata in maniera indiretta, cercando la presenza dei prodotti dell’immunità o amministrando derivati purificati del microbo e misurando la reazione indotta. Le cellule principali del sistema immunitario sono i linfociti, le APC e le cellule effettrici. I linfociti sono cellule che riconoscono gli antigeni estranei e mediano quindi l’immunità innata e quella umorale. Esistono diverse popolazioni linfocitarie che differiscono nel modo in cui riconoscono il non-self: • Linfociti B. Questi linfociti sono gli unici in grado di produrre anticorpi. Riconoscono gli antigeni extracellulari e si differenziano in plasmacellule secernenti gli anticorpi: mediano dunque l’immunità umorale. • Linfociti T. Questi linfociti mediano la risposta cellulo-mediata in quanto riconoscono antigeni intracellulari e si attivano per distruggere microbi e cellule infettate. I linfociti T non producono anticorpi e hanno una specificità ristretta per gli antigeni: riconoscono solo antigeni peptidici attaccati a proteine codificate dall’MHC. I linfociti T consistono di popolazioni funzionalmente distinte, tra le quali quelle codificate meglio sono le cellule T-Helper e le cellule T-Citotossiche. – Le cellule T-Helper in risposta ad un’infezione secernono citochine che servono a stimolare la proliferazione e la differenziazione delle cellule T stesse e l’attivazione di altre cellule, tra cui cellule B, macrofagi ed altri leucociti. – I linfociti T citotossici agiscono uccidendo le cellule che producono antigeni non-self. L’avvio e lo sviluppo dell’immunità adattativa richiedono il sequestro e la presentazione degli antigeni ai linfociti da parte delle APC. Le APC più specializzate sono le cellule dendritiche, che catturano gli antigeni in arrivo dall’ambiente esterno e lo trasportano agli organi linfoidi per presentarlo ai linfociti T naive (vergini ed aspecifici) per iniziare la risposta immunitaria. L’attivazione dei linfociti da parte degli antigeni porta all’attivazione di vari meccanismi. L’eliminazione dell’antigene richiede spesso la partecipazione di cellule dette effettrici in quanto mediatrici dell’effetto finale della risposta immunitaria. Linfociti T attivati, fagociti mononucleati e altri leucociti funzionano da cellule effettrici in differenti risposte immunitarie. RISPOSTE IMMUNITARIE AI MICROBI L’immunità innata blocca l’ingresso di microbi e ne limita l’espansione qualora riuscissero a passare. I principali tratti a rischio sono la cute, il tratto GI e quello respiratorio: sono tutti ricoperti di epitelio continuo che fornisce una barriera efficace. Se il microbo sfonda la barriera trova i macrofagi che esprimono sulle loro membrane recettori che legano e fagocitano il microbo o attivano altre cellule. I macrofagi attivati producono ROS ed enzimi lisosomiali per distruggere il microbo, ma secernono anche citochine che promuovono il reclutamento di altri leucociti. Le citochine sono responsabili di molti aspetti delle reazioni immunitarie e sono quindi molecole messaggere. L’accumulo locale di leucociti e la loro attivazione per distruggere i microbi è parte di ciò che causa l’infiammazione. La risposta innata ad alcuni virus consiste nella produzione di citochine antivirali dette interferoni e nell’attivazione di cellule NK. I microbi che resistono a questo primo intervento possono entrare nel sangue dove vengono riconosciuti dalle proteine circolanti dell’immunità innata: tra di esse le più importanti sono quelle 11 facenti parte del sistema del complemento. Il complemento può essere attivato direttamente dai microbi (via alternativa) con il risultato dello stimolo infiammatorio e della fagocitosi del patogeno, oppure può essere attivato dagli anticorpi (via classica). La risposta adattativa ruota intorno a tre strategie: 1. Anticorpi. Gli anticorpi secreti legano i microbi extracellulari, bloccandone la capacità infettiva e promuovendone la distruzione. 2. Fagociti. I fagociti digeriscono e uccidono i microbi e le cellule T-Helper li favoriscono in questo. 3. Linfociti T -Citotossici. I linfociti T -Citotossici uccidono le cellule infette inaccessibili agli anticorpi. L’immunità adattativa produce un grande numero di linfociti durante la maturazione e, a seguito di stimolo antigenico, seleziona i più utili per combattere il microbo: questo aumenta l’efficacia del sistema. Il numero di linfociti naive per ogni antigene è basso (uno per milione) e la quantità di antigene è spesso anch’essa limitata: esistono meccanismi specializzati nel catturare e concentrare microbi nel- la giusta posizione per una stimolazione ottimale. Le cellule dendritiche sono le APC che portano gli antigeni ai linfociti naive CD4+ e CD8+ e quindi fanno iniziare la risposta adattativa. Queste cellule catturano i microbi, ne digeriscono le proteine in peptidi e li esprimono sulla loro superficie in associazione a molecole MHC: si dirigono poi ai linfonodi dove stazionano. I linfociti specifici per un gran numero di antigeni esistono già prima dell’esposizione e, quando entra l’antigene, questo seleziona e attiva cellule specifiche: questa è la base dell’ipotesi della selezione clonale. L’attivazione dei linfociti T -Naive richiede il riconoscimento del complesso antigene-MHC delle cellule dendritiche: questo passaggio garantisce specificità all’immunità e non autoreattivià. I linfociti CD4+ attivati proliferano e si differenziano in cellule effettrici le cui funzioni sono mediate dalle citochine secrete. Una delle prime azioni è la secrezione di interleuchina-2 (IL-2), un fattore di crescita che agisce sui linfociti antigene-attivati e ne stimola l’espansione clonale. Queste cellule effettrici lasciano l’organo linfoide dove sono state generate e migrano ai siti di infezione e infiammazione. Ai siti di infiammazione le cellule effettrici compiono vari atti: alcune secernono interferon-γ, un potente attivatore macrofagico. Altri CD4+ attivati secernono citochine che sti- molano la produzione di IgE e attivano gli eosinofili, cioè leucociti in grado di uccidere parassiti troppo grandi per essere fagocitati. I linfociti CD8+ attivati proliferano e differenziano in linfociti T-Citotossici che uccidono le cellule infette nel citoplasma. I linfociti B attivati proliferano e si differenziano in cellule che secernono diverse classi di anticorpi con diverse funzioni. La risposta dei linfociti B agli antigeni proteici richiede segnali di attivazione dai linfociti T CD4+ Helper. Parte della progenie dei cloni di cellule B si differenzia in plasmacellule che producono anticorpi; gli antigeni polisaccaridici e lipidici stimolano soprattutto la produzione di IgM, mentre quelli proteici, grazie all’interazione delle cellule helper, inducono la produzione di IgG, IgA ed IgE. La risposta umorale agisce su vari fronti. Gli anticorpi si legano ai microbi impedendo loro di infettare cellule sane. Le IgG avvolgono i microbi e li destinano alla fagocitosi, in 12 quanto i fagociti (neutrofili e macrofili) riconoscono le code delle IgG. IgG e IgM attivano il complemento lungo la via classica, e il complemento promuove la fagocitosi e la distruzione dei microbi. Le IgG sono trasportate attivamente attraverso la placenta e proteggono i neonati fino alla maturazione del sistema. La maggior parte degli anticorpi ha emivita intorno alle tre settimane, anche se le cellule della memoria vivono per anni. 15 I macrofagi, dunque, operano attraverso la fagocitosi dei microorganismi, ma non solo. Infatti, i macrofagi possono anche ingerire le cellule necrotiche o apoptotiche, prima che queste possano riversare il loro contenuto all’esterno danneggiando il tessuto, avviando così un ulteriore processo infiammatorio. Tramite delle citochine sono in grado di agire sulle cellule endoteliali che rivestono i vasi, contribuiscono alla riparazione dei tessuti, stimolando l’angiogenesi, ovvero la crescita di nuovi vasi sanguigno. I macrofagi possono agire anche come cellule presentati l’antigene, in modo da attivare i linfociti T; e a differenza dei neutrofili, i macrofagi non sono cellule terminalmente differenziate, per cui possono andare incontro a divisione cellulare nel sito infiammatorio, motivo per cui persistono per più giorni dopo l’infezione. Infine, i macrofagi possono essere attivati da diversi stimoli e in relazione a questi possono svolgere diverse funzioni. Per esempio, alcune citochine inducono i macrofagi ad uccidere in maniere più efficiente i microbi, e in questo caso si parlerà di macrofagi M1 attivati con la via classica; altre citochine, attraverso l’attivazione alternativa, indurranno i macrofagi M2 a favorire il rimodellamento e la riparazione tissutale. MASTOCITI, BASOFILI ED EOSINOFILI Sono cellule che partecipano sia alla risposta innata che a quella adattativa. Queste cellule sono accomunate dal fatto che presentano granuli citoplasmatici contenenti mediatori infiammatori e antimicrobici, oltre al fatto che possono essere coinvolti anche nelle reazioni contro gli elminti e malattie allergiche. • Mastociti: sono cellule di origine midollare, localizzate nella cute e nelle mucose degli epiteli. Queste cellule quando si attivano rilasciano mediatori infiammatori che ci proteggono dai parassiti, e possono causare sintomi delle malattie allergiche. La citochina SCG (o ligando di c-kit) è fondamentale per lo sviluppo dei mastociti che normalmente non si trovano nella forma matura nel sangue. I mastociti, piuttosto, sono presenti nei tessuti localizzati in prossimità dei piccoli vasi ematici e dei nervi. Sono caratterizzati da numerosi granuli nel citoplasma che contengono molecole come istamina, proteoglicani che legano coloranti basici. Numerosi stimoli possono determinare il rilascio del contenuto dei granuli, portando per esempio ad un evento infiammatorio a livello dei vasi sanguigni. I mastociti esprimono recettori di membrana caratterizzati da un’elevata affinità per gli anticorpi di tipo IgE, il cui legame provoca l’attivazione dei mastociti stessi. • Basofili: sono cellule che derivano da precursori ematopoietici, per poi completare la loro maturazione nel midollo osseo e, infine, circolare nel sangue. Contengono granuli che si colorano in blu con coloranti basici. Esprimono recettori di membrana per gli anticorpi IgE. • Eosinofili: sono cellule che possiedono dei granuli al cui interno sono preseti enzimi che danneggiano la parete cellulare dei parassiti, ma che allo stesso tempo possono danneggiare anche i tessuti dell’ospite. I loro granuli contengono protein basiche e si colorano di rosso negli strisci di sangue. Gli eosinofili derivano da precursori del midollo osseo e circolano poi nel sangue. Alcune interleuchine, come IL-3 e IL-5 ne promuovono la maturazione. Alcuni eosinofili sono presenti nei tessuti periferici, soprattutto nelle mucose dell’apparato respiratorio, gastrointestinale e genitourinario. 16 CELLULE DENDRITICHE Le cellule dendritiche possono trovarsi sia nei tessuti che circolanti. Queste cellule sono in grado di percepire la presenza di microorganismi e possono presentare proteine microbiche ai linfociti T, attivando una risposta immunitaria adattiva. Quando le DC riconoscono i microbi si ha una secrezione di citochine che attivano le cellule dell’immunità innata nei siti di infezione. Inoltre, le DC esponendo frammenti proteici dei microbi sono in grado di stimolare ed attivare i linfociti T. La maggior parte delle DC deriva da precursor midollari che possono differenziarsi anche in monociti. La maturazione delle DC necessita di una citochina denominata ligando di Flt3 che lega il recettore tirosin-chinasico Flt3 presente nei precursori midollari. Nell’epitelio cutaneo ci sono le cellule di Langerhans, un tipo di Dc che si sviluppano a partire da precursori presenti nel sacco vitellino durante la vita fetale. Inoltre, tutte le Dc esprimono molecole del complesso maggiore di istocompatibilità di classe I e di classe II, essenziali per la presentazione degli antigeni ai linfociti T CD8 e CD4. Esistono due principali tipi di DC: • Cellule dendritiche classiche: sono coinvolte nella captazione di antigeni microbici di natura proteica che vengono presentati ai linfociti T. Questo tipo di cellule sono quelle maggiormente presenti negli epiteli e negli organi linfoidi. Esse derivano da precursori mieloidi che migrano dal midollo osseo, per poi differenziarsi nei tessuti linfoidi e non linfoidi. Le cellule dendritiche classiche possono essere ulteriormente suddivise in due popolazioni principali. • Cellule dendritiche plasmacitoidi: producono la citochina antivirale interferone di tipo I in risposta ai virus, e possono catturare microrganismi presenti nel sangue, oltre al fatto che possono trasportare i loro antigeni alla milza e presentarli ai linfociti T. Queste cellule sono così chiamate perché quando si attivano assomigliano alle plasmacellule. Esse si sviluppano sempre nel midollo osseo, poi circolano nel sangue e negli organi linfoidi in numero ridotto. Producono la maggior quantità di interferoni di tipo I e hanno un ruolo importante nella difesa contro i virus. Vi sono anche altre cellule dendritiche, definite follicolari, che non hanno similitudini con queste DC, in quanto sono coinvolte nell’attivazione dei linfociti B negli organi linfoidi. LINFOCITI I linfociti sono le cellule dell’immunità adattativa e sono le uniche cellule in grado di esprimere in modo clonale i recettori per l’antigene, ognuno dei quali ha una specificità antigenica. In un individuo sano adulto il numero dei linfociti è 5x1011. Di questi: • 2% sono nel sangue • 4% nell’epidermide • 10% nel midollo osseo • 15% si trovano nei tessuti linfoidi associati alle mucose del tratto gastrointestinale e respiratorio 17 • 65% si trova negli organi linfoidi I linfociti comprendono classi distinte sulla base delle loro funzioni e proteine prodotte. I linfociti B producono anticorpi, e sono così chiamati perché negli uccelli maturano nella borsa di Fabrizio. I linfociti T, come i linfociti B vengono prodotti da precursori presenti nel midollo osseo, ma la loro maturazione, a differenza di quest’ultimi, non avviene nel midollo, bensì nel timo. Infatti, il termine linfocita T deriva da timo. LINFOCITI B Vi sono diversi tipi di linfociti B: • Linfociti B follicolari: sono i più numerosi nel nostro organismo, e sono presenti nei tessuti linfoidi e nel sangue. Queste cellule esprimono un repertorio di anticorpi che possono agire sia da recettori per gli antigeni, quando vengono espressi sulla membrana; sia da molecole effettrici nell’immunità umorale adattativa. Inoltre, questi linfociti sono i maggiori responsabili della produzione di anticorpi e di cellule della memoria. Sono maggiormente presenti nella milza. • Linfociti B della zona marginale: producono anche anticorpi e sono localizzati nella milza. • Cellule B-1: producono anticorpi, e sono localizzati nella cavità peritoneale e pleurica. LINFOCITI T I linfociti T sono responsabili dell’immunità cellulo-mediata, e se ne riconoscono due principali popolazioni: • Linfociti T CD4+ helper: secernano citochine che agiscono su altre cellule, come linfociti T, linfociti B e macrofagi. • Linfociti T citotossici (CTL) CD8+: questi linfociti riconoscono le cellule infettate dai virus e da altri microrganismi intracellulari. Inoltre, sono anche capaci di uccidere le cellule tumorali. Questi linfociti esprimono dei recettori per gli antigeni, definiti recettori T alfa-beta, che funzionano come mediatori dell’immunità cellulare. I linfociti T CD4+ regolatori rappresentano un terzo tipo di linfociti T che esprime i recettori alfa- beta, e la loro funzione è quella di inibire le risposte immunitarie. Infine, le cellule natural killer T, le cellule T associate alle mucose con un TCR invariante e i linfociti T gamma-delta sono tre popolazioni minori di linfociti T che esprimono un TCR dotato di una diversificazione più limitata. I linfociti originano da precursori staminali presenti nel midollo osseo, dopodiché vanno incontro a maturazione. Solitamente la maturazione avviene in organi linfoidi generativi, rappresentati da: midollo osseo (per tutti i linfociti e i linfociti B) e il timo (maturazione dei linfociti T). I vari linfociti, poi, possono essere anche classificati in base alla loro precedente esposizione all’antigene. 20 Le cellule T della memoria sono meno del 5% di tutti i linfociti T del sangue periferico nel neonato, ma più del 50% nell’adulto e ciò è dovuto al fatto che con l’invecchiamento l’accumulo graduale delle cellule della memoria compensa la riduzione di nuovi linfociti T naive dal timo, il quale va incontro a involuzione dopo la pubertà. I linfociti B della memoria possono esprimere diverse classi di Ig di membrana, come IgG, IgE o le IgA; mentre i linfociti B naive esprimono solo IgM ed IgD. CELLULE NATURAL KILLER E CELLULE LINFOIDI INNATE CHE SERCERNANO CITOCHINE Il sistema dell’immunità innata comprende numerose popolazioni di cellule di origine midollare, e queste possiedono morfologia e funzioni effettrici simili a quelle dei linfociti T, ma non esprimono il recettore per l’antigene caratteristico dei linfociti T. Queste cellule sono in grado di riconoscere e di agire nei confronti di patogeni, oltre al fatto di eliminare le cellule che sono state danneggiate o che sono andate incontro a stress. Le cellule natural killer hanno funzioni effettrici citotossiche e circolano nel sangue e nei vari tessuti linfoidi. Le cellule linfoidi innate secernano citochine e hanno funzioni simili ai linfociti T CD4+ helper. Le cellule linfoidi innate possono essere raggruppate in tre gruppi sulla base delle citochine che secernano. Inoltre, queste cellule sono rare nel sangue, infatti si trovano per lo più nelle mucose polmonari ed intestinali. TESSUTI LINFOIDI Gli organi linfoidi centrali o primari sono il timo ed il midollo osseo. Questi organi sono il luogo dove i linfociti acquisiscono a capacità die esprimere i recettori per l’antigene e la maturità funzionale e fenotipica. I linfociti B maturano nel midollo osseo, dopodiché entrano in circolo e migrano nella milza per completare la loro maturazione. I linfociti T, invece, maturano nel timo e poi, attraverso il circolo, migrano negli organi linfoidi secondari. Gli organi linfoidi primari forniscono i fattori di crescita e i segnali necessari alla maturazione dei linfociti e, inoltre, presentano loro gli antigeni self per il processo di selezione che avviene nel corso della loro maturazione. Gli organi linfoidi secondari comprendono la milza, i linfonodi e i componenti del sistema immunitario mucosale. In questi siti ha inizio e si sviluppa la risposta immunitaria dei linfociti nei confronti degli antigeni. MIDOLLO OSSEO Nel midollo osseo, oltre ad essere prodotte le cellule el sangue, avviene la maturazione dei linfociti B. Durante lo sviluppo fatale ha luogo un processo denominato ematopoiesi, che avviene inizialmente nel sacco vitellino e nel mesenchima paraortico; successivamente, l’ematopoiesi continua nel fegato e poi nel midollo osseo. 21 Alla nascita tale processo ha luogo nelle ossa, soprattutto nel midollo osseo delle ossa piatte; e durante la pubertà, invece, avviene nello sterno, nelle vertebre, nelle ossa iliache e nelle costole, proprio perché in queste ossa si ha un’intelaiatura spugnosa localizzata tra le trabecole ossee. In caso di lesione al midollo osseo, il fegato e la milza possono diventare sede di ematopoiesi extramidollare. Una volta avvenuto questo processo, poi, le cellule vengono riversate nel circolo sanguigno. Globuli rossi, granulociti, linfociti, piastrine e mastociti originano tutte dalla stessa cellula staminale ematopoietica che è una cellula multipotente, ovvero è in grado di generare ogni tipo di cellula matura del sangue. Le cellule ematopoietiche multipotenti, anche dette HSC, possono essere identificate grazie a dei marcatori di superficie, quali le proteine CD34 e c-Kit. Le HSC danno origine a due tipi di progenitori cellulari multipotenti, uno che genera cellule linfoidi e alcune cellule mieloidi; ed un altro che produce cellule mieloidi, eritrociti e piastrine. Il progenitore mieloide-linfoide comune dà origine a precursori specifici dei linfociti T, B, o appartenenti alla linea delle ILC. I progenitori comuni mieloidi-megacariociti-eritroidi danno origine a precursori della linea eritroide, megacariocita ecc. La maggior parte delle DC origina dalla linea monocitica, mentre i progenitori immaturi dei mastociti originano da un precursore comune dei monociti/granulociti, escono dal midollo osseo e si differenziano in mastociti nei tessuti periferici. La proliferazione e la maturazione dei precursori nel midollo osseo sono stimolate dall’azione di citochine che prendono il nome di fattori di stimolazione della formazione delle colonie, proprio perché furono identificate sulla base della loro capacità di stimolare la crescita e lo sviluppo di colonie leucocitarie o eritroidi del midollo osseo. Nel midollo osseo, le citochine ematopoietiche sono prodotte dalle cellule stromali e dai macrofagi, ma possono essere prodotte anche dai linfociti T che a loro volta vengono stimolati dagli antigeni e dai macrofagi anch’essi attivati da citochine o microbi. Oltre alle cellule staminali, il midollo osseo contiene numerose plasmacellule a lunga sopravvivenza che si sono generate negli organi linfoidi secondari, in seguito alla stimolazione dei linfociti B, da parte degli antigeni, e dei linfociti T helper, e sono successivamente migrati nel midollo osseo. Anche alcuni linfociti T della memoria hanno lunga sopravvivenza e possono stazionare nel midollo osseo. TIMO È un organo bilobato, situato nel mediastino anteriore, e che va incontro ad involuzione dopo la pubertà. Nel timo avviene la maturazione dei linfociti T, ed in ogni lobo sono presenti dei setti fibrosi che lo dividono in lobuli, ognuno dei quali è formato da una regione corticale esterna ed una midollare interna. Le cellule della regione corticale producono l’interleuchina 7 (IL-7) una citochina che è essenziale per la maturazione ei linfociti T, agglomerati in questa regione. Nella regione midollare, invece, sono presenti le cellule epiteliali midollari timiche che hanno un ruolo importante nella presentazione degli antigeni self ai linfociti T in corso di maturazione e nella loro eliminazione. 22 Un disordine genetico delle risposte dei linfociti T causato da un mancato sviluppo del timo è la sindrome di DiGeorge, in cui i pazienti che ne sono affetti presentano un deficit di linfociti T dovuto ad una delezione cromosomica che elimina i geni necessari per lo sviluppo del timo. Infine, i linfociti presenti nel timo sono detti anche timociti e sono cellule T a vari stadi di maturazione. Il processo di maturazione ha inizio nella regione corticale, mentre le cellule più mature si trovano verso quella midollare. Solo i linfociti T naive maturi escono dal timo ed entrano nel sangue e nei tessuti linfoidi secondari. LINFONODI E SISTEMA LINFATICO Il fluido interstiziale riassorbito, la linfa, scorre lungo i vasi linfatici, i quali drenano nei seni sotto capsulari dei linfonodi. I vasi linfatici efferenti dei vari linfonodi si congiungono poi per terminare nel dotto toracico che scarica la linfa nella vena cava superiore, riconsegnando al flusso ematico. Il volume di linfa prodotta al giorno è circa due litri. Le cellule dendritiche catturano gli antigeni microbici ed entrano nei vasi linfatici (altri antigeni entrano invece in forma libera); i linfonodi agiscono da filtro e sondano la linfa: tutti gli antigeni e le citochine infiammatorie raggiungono dunque questi tessuti. Giunte nei linfonodi, le cellule dendritiche presentano gli antigeni ai linfociti T naive per iniziare le risposte immunitarie adattative. Ogni linfonodo è avvolto da una capsula fibrosa perforata da parecchi vasi linfatici in arrivo, che svuotano la loro linfa nel seno sottocapsulare. Oltre il seno la corteccia esterna presenta aggregati di cellule detti follicoli, alcuni dei quali contenenti un’area centrale detta centro germinativo. I follicoli privi di centro germinale sono detti primari, quelli dotati sono detti secondari. I follicoli sono zone costituite da linfociti B; i follicoli primari contengono principalmente linfociti B naive, quindi maturi, mentre i centri germinali sono sedi di sviluppo che appaiono in seguito a stimolazione antigenica. I linfociti T sono collocati principalmente in profondità, nei cordoni paracorticali. Il 70% di questi è CD4+ mentre i CD8+ sono più rari anche se le proporzioni possono variare molto durante le infezioni. La segregazione anatomica delle diverse tipologie di linfociti è dipendente da citochine. I linfociti T e B naive vengono consegnati al nodo attraverso un’arteria, in particolare entrano nel tessuto attraverso vasi specializzati detti venule ad endotelio alto. I linfociti T naive esprimono il recettore CCR7 che lega le chemochine CCL19 e CCL21 prodotte nelle regioni delle cellule T. Le cellule dendritiche esprimono anch’esse CCR7 e per questo migrano nella stessa regione delle cellule T. I linfociti B naive esprimono invece il recettore CXCR5 che riconosce la chemochina CXCL13, prodotta esclusivamente nei follicoli. La segregazione anatomica garantisce che ogni popolazione sia in contatto con la corretta APC: cellule dendritiche per i T, FDC per i B. A seguito di stimolazione antigenica i linfociti B e T perdono i loro confini anatomici e diventano liberi di migrare reciprocamente. MILZA La milza, organo di 150g nell’adulto, appare suddivisa in polpa bianca e polpa rossa. Le regioni ricche in linfociti dell’organo sono la polpa bianca e si presentano organizzate intorno ad un’arteriola centrale. L’arteria centrale è circondata da un manicotto di linfociti, quasi tutti T, 25 espressa sulla membrana in risposta alle citochine, all’istamina che viene rilasciata dai mastociti, e alla trombina generata durante la cascata della coagulazione. • E-selectina: è sintetizzata ed è espressa sulla membrana delle cellule endoteliali nell’arco di 1-2 ore, inseguito alla stimolazione da parte delle citochine. Le citochine che ne stimolano l’espressione sono l’interleuchina 1 ed il fattore di necrosi tumorale, prodotte dai macrofagi tissutali e dalle DC lì residenti. A questo punto, i leucociti esprimono i ligandi che si andranno a legare a queste molecole presenti sull’endotelio vascolare delle venule. I ligandi espressi dai leucociti si trovano sulla porzione apicale dei microvilli dei linfociti stessi. Quesi ligandi sono carboidrati sialilati complessi, correlati alla famiglia di antigeni ematici quali Lewis X e Lewis A. Il ligando per la P-selectina è una glicoproteina leucocitaria di membrana, denominata PSGL-1, che deve essere modificata post-trascrizionalmente così da poter esporre il residuo sialil-Lewis X. I leucociti, inoltre, esprimono anch’essi una selectina denominata L-selectina, i cui ligandi sono sialomucine presenti sulle cellule endoteliali delle venule postcapillari e la cui espressione viene aumentata in seguito all’attivazione di citochine. Il principale ligando della L-selectina è il sialil 6-sulfo Lewis X. La L-selectina espressa dai neutrofili promuove l’adesione alle cellule endoteliali, e nell’ambito della risposta adattativa è importante perché indirizza i linfociti B e T naive ai linfonodi attraverso vasi sanguigno specializzati, definiti venule ad endotelio alto. INTEGRINE E LINGANDI DELLE INTEGRINE Le integrine sono le proteine di membrana che sono responsabili dell’adesione cellulare alla matrice extracellulare o dell’adesione intracellulare, attraverso il legame specifico coni rispettivi ligandi. Vi sono 30 proteine omologhe che sono costituite da eterodimeri tra una delle 15 catene alfa e uno dei 17 tipi di catene beta. La porzione extracellulare di ognuna delle due catene forma una testa globulare che contribuisce all’interazione con il ligando. La porzione citoplasmatica interagisce, invece, con le componenti del citoscheletro. I leucociti esprimono due tipi di integrine importanti: • LFA-1: uno dei suoi principali ligandi è ICAM-1 che è una glicoproteina espressa da cellule endoteliali che sono state attivate da altre cellule, tipo i linfociti, macrofagi, DC e fibroblasti. La porzione extracellulare delle ICAM-1 è composta da domini globulari detti immunoglobulinici. Altri due ligandi che si legano a questa interina sono ICAM-2, che viene espressa dalle cellule endoteliali, e ICAM-3 che è invece espressa dai linfociti. • VLA-4: lega il ligando VCAM-1 che viene espressa dalle cellule endoteliali attivate. Ovviamente queste non sono le uniche integrine, ma sono le più rilevanti. Altre integrine sono, per esempio, quelle coinvolte nell’immunità adattativa e innata come Mac-1 lega sempre il ligando ICAM-1. Mac-1 non è solo coinvolta nell’adesione all’endotelio, infatti funge anche da recettore per il sistema del complemento, in quanto è in grado di legare particelle opsonizzate da prodotti che derivano dall’attivazione del complemento, come C3, favorendo così l’uccisione dei microbi. 26 Le integrine aumentano la loro affinità per i rispettivi ligandi in risposta a segnali intracellulari che vengono attivati dal legame delle chemochine con i recettori, e dall’attivazione del recettore dell’antigene nei linfociti T. Entrambi i tipi di recettori generano dei segnali che determinano l’associazione delle code citoplasmatiche delle integrine alle proteine della famiglia RAP e a proteine in grado di interagire con il citoscheletro, con conseguente cambio conformazionale dei domini extracellulari. Nello stato di bassa affinità, i domini extracellulari di ogni subunità integrinica sono ripiegati su loro stessi. In risposta alle alterazioni della coda citoplasmatica, le catene si dispiegano allontanando le teste globulari dalla membrana, generando una conformazione ottimale per l’interazione con il ligando. Il processo attraverso il quale i segnali intracellulari, generati in risposta alle chemochine o all’antigene, cambiano la capacità di legame del dominio extracellulare delle integrine è definito inside-out-signaling. Le chemochine determinano anche l’aggregazione delle integrine in specifiche regioni della membrana cellulare; e questo processo provoca l’aumento della loro concentrazione nelle aree di contatto con le cellule endoteliali dove sono presenti el chemochine, determinando un aumento della forza di legame dei leucociti alle cellule endoteliali. CHEMOCHINE E RECETTORI PER LE CHEMOCHINE Le chemochine sono una grande famiglia di citochine, con struttura affine a queste ultime, in gradi di stimolare il movimento dei leucociti dal circolo sanguigno verso i tessuti. La maggior parte elle chemochine è costituita da polipeptidi di 8-10 kD contenenti due ponti disolfuro. Nell’uomo esistono 47 chemochine, suddivise in 4 gruppi sulla base del numero e della posizione della prima coppia delle quattro cisteine responsabili dei ponti disolfuro. Le principali famiglie di chemochine sono: • Chemochine CXC: in cui gli stessi residui sono separati da un an AA. Queste sono ulteriormente suddivise in due gruppi in base alla sequenza di AA: 1. Acido glutammico-leucocina-arginina: questa sequenza è definita ELR e precede la prima coppia di cisteine, e solo le chemochine che contengono il motivo ELR promuovono la migrazione dei neutrofili. 2. Altre chemochine CXC: inducono la migrazione di monociti, linfociti ed altri leucociti; Queste chemochine sono identificati coni nomi CXCL1-CXCL17. • Chemochine CC: in cui i primi residui di cisteina sono adiacenti, e anche queste inducono la migrazione di monociti, linfociti ed altri leucociti. Inoltre, queste sono identificati con i nomi CCL1-CCL28. Le chemochine dei gruppi CC e CXC sono prodotte dai leucociti e da diversi tipi cellulari, come cellule endoteliali, epiteliali, macrofagi residenti, fibroblasti ed altre cellule stromali. La produzione delle chemochine è innescata dal riconoscimento di microrganismi attraverso l’attivazione di vari recettori espressi dalle cellule dell’immunità innata. Inoltre, le chemochine vengono anche prodotte in risposta a citochine infiammatorie, tra cui l’interleuchina 17 ed 1, oltre al fattore di necrosi tumorale. Numerose chemochine CC sono anche prodotte d linfociti T stimolati dall’antigene, svolgendo un ruolo essenziale di connessione dell’immunità specifica con le cellule reclutate nel processo infiammatorio. 27 I recettori per le chemochine appartengono alla superfamiglia dei recettori GCPR a sette domini transmembrana associati alle proteine che legano GTP, note come proteine G. Questi recettori trasducono il segnale attraverso proteine G a loro associate. Tutti i recettori per le chemochine in grado di promuovere la migrazione cellulare condividono la sequenza amminoacidica DRYLAIV, coinvolta nell’attivazione delle proteine G. le proteine G determino un cambiamento della conformazione delle integrine, aumentando così la loro affinità nei confronti dei ligandi. Sono stati identificati 10 diversi recettori per le chemochine CC, che vengono denominati CCR1- CCR10, e sette per le chemochine CXC, denominati CXCR1-CXCR6 e CXCR8. Poi, vi sarà un recettore per el chemochine C, definito XCR1; ed un recettore per la chemochina CX3CL1, definito CX3CR1. Inoltre, esiste un gruppo di recettori per chemochine, definito recettori atipici per chemochine o ACKR, che non è in grado di attivare le proteine G e le vie relative di trasduzione. Tali recettori hanno il compito di inibire la risposta alle chemochine. ATTIVITA’ BIOLOGICHE DELLE CHEMOCHINE Le chemochine sono prodotte in risposta a stimoli esogeni, mentre atre hanno il compito di regolare la localizzazione di linfociti B e T. infatti, le chemochine regolano l’extravasazione ed il reclutamento tissutale dei leucociti circolanti el processo infiammatorio. Le chemochine hanno il compito di legarsi ai recettori presenti nei vari tipi di leucociti, portando all’attivazione delle molecole di adesione che premettono il legame tra cellule endoteliali delle venule postcapillari e leucociti. Per cui, nel processo infiammatorio le chemochine assolvono a due funzioni. 1. Aumentare l’adesione dei leucociti all’endotelio: ciò è possibile perché le chemochine si legano agli eparansolfati proteoglicani che sono presenti sulla superficie delle cellule endoteliali delle venule postcapillari. In questo modo, le chemochine vengono riconosciute dai leucociti e questo meccanismo provoca un aumento dell’affinità delle integrine e l’adesione salda dei leucociti, che è una fase critica nel processo di extravasazione e reclutamento tissutale. 2. Migrazione dei leucociti, attraverso l’endotelio vascolare, verso il sito di infezione o di danno tissutale: le chemochine che sono prodotte nei tessuti extra vascolari agiscono sui leucociti che hanno, a loro volta, aderito all’endotelio e ne stimolano il movimento verso il sito di produzione. Tale processo è denominato chemiotassi, e in questo modo i leucociti riescono a migrare verso le cellule infettate o danneggiate presenti nei tessuti, dove le chemochine vengono prodotte. Le chemochine sono anche coinvolte nello sviluppo degli organi linfoidi, in quanto sono in grado di indirizzare i leucociti e altre cellule in aree diverse degli organi linfoidi secondari. E poiché queste chemochine sono prodotte in modo costitutivo e sono responsabili della normale organizzazione anatomica del tessuto, queste vengono definite omeostatiche. Inoltre, le chemochine sono cruciali per la migrazione delle DC dai focolai di infezione ai infondi drenanti. Infatti, le DC sono attivate dai microbi e poi migrano nei linfonodi, così da informare i linfociti T della presenza di un’infezione. Questa migrazione dipende dall’espressione di un recettore per le chemochine, ovvero il recettore CCR7, che viene espresso dalle DC dopo che 30 La Ricircolazione dei linfociti T si basa sull’insieme dei meccanismi che governano il passaggio dei linfociti T naive dal sangue ai linfonodi e dei segnali molecolari che regolano la loro fuoriuscita dai linfonodi. Ogni linfocita passa almeno una volta al giorno dallo stesso linfonodo, in condizioni normali. Ovviamente, quando si è in presenza di un evento infiammatorio si ha un forte afflusso di linfociti T all’interno dei linfonodi, così da poter drenare il focolaio infiammatorio. Allo stesso tempo diminuisce la fuoriuscita delle cellule T attraverso i vasi linfatici efferenti, e si ha un aumento degli antigeni proteici che vengono concentrati nei linfonodi e negli altri organi linfoidi secondari, dove vengono presentati ai linfociti T dalle cellule DC. Questo processo, dunque, aumenta la probabilità che i linfociti T naive riescano a trovare i loro antigeni specifici. Il processo di homing dei linfociti T nei linfonodi e nei tessuti può avvenire grazie al passaggio di queste cellule attraverso le HEV, ovvero le venule ad endotelio alto, che possiedono un endotelio costituito da cellule cubiche, anziché appiattite. Inoltre, questi vasi sanguigni esprimono sulla loro superficie recettori per le chemochine e molecole di adesione che permettono proprio il processo di homing dei linfociti. Anche le citochine hanno un ruolo importante, in quanto le caratteristiche di HEV dipendo dal tipo di citochine presenti. Comunque, la migrazione dei linfociti T naive attraverso le HEV fini al parenchima linfonodale necessita di molecole di adesione, come L-selectina e LFA-1 e del recettore per le chemochine CCR7. La migrazione dei linfociti T può essere così schematizzata: 1. Rolling: i linfociti T naive rotolano sulla superficie delle HEV, ma questo processo richiede la L-selectina, espressa dai linfociti. La L-selectina, poi, si lega alla PNad, un carboidrato solfatato legato a un core glicoproteico espressa, invece, dalle HEV. Nelle placche di Peyer dell’intestino, il ligando della L-selectina è presente su una proteina chiamata MadCAM-1, che è anche il ligando dell’interina alfa4-beta7. 2. Adesione salda dei linfociti T alle HEV: resa possibile dalle integrine, soprattutto da LFA-1. 3. Chemochine CCL19 e CCL21: queste attivano l’affinità delle integrine dei linfociti T naive, ed entrambe le chemochine sono responsabili dell’homing 6nelle aree T dei tessuti linfoidi. La principale fonte di CCL19 e CCL21 sono i fibroblasti reticolari delle aree T linfonodali. L’espressione di queste chemochine sulla superficie delle venule ad endotelio alto sono alla base del meccanismo di rolling. Entrambe le chemochine legano il recettore CCR7, e l’attivazione di quest’ultimo assicura l’aumento dell’avidità delle integrine e l’adesione salda alle HEV dei linfociti T naive. Dopo che i linfociti T sono entrati negli organi linfoidi e nei tessuti mucosi, si assiste ad un’intensa attività migratoria dei linfociti T e delle DC, così da ottimizzare l’incontro delle due specie di cellule e di garantire l’incontro dei linfociti T naive agli specifici antigeni presentati dalle DC. Questo processo però non è semplice, poiché nello stesso organo sono presenti migliaia di DC e di linfociti con diversa specificità. La migrazione dei linfociti T è stimolata dall’attivazione di CCR7 da parte di CCL19 e CCL21, prodotti dai fibroblasti reticolari che formano una rete tridimensionale presente in tutte le aree T linfonodali. Anche le DC si distribuirono in questa rete tridimensionale, cosicché 31 ogni DC possa stabilire numerosi contatti con molti linfociti T che, di solito, stazionano almeno 24 h in un linfonodo. Una volta avvenuto il riconoscimento dell’antigene, il linfocita T si mobilizza e forma un’interazione stabile con la DC, così da innescare tutti questi processi che portano all’attivazione del linfocita T. I linfociti T naive che nel linfonodo non riconoscono l’antigene non si attivano e ritornano in circolo. Il ritorno nel torrente ematico completa il percorso della Ricircolazione e dà ai linfociti T naive la possibilità di continuare la ricerca dell’antigene in altri linfonodi. La via per il ritorno nel sangue è costituita dai vasi linfatici efferenti, per arrivare successivamente nel dotto toracico che si riversa nella vena cava superiore o nel dotto linfatico destro, che si riversa nella vena succlavia di destra. La fuoriuscita dei linfociti T naive dai linfonodi dipende da un fattore chemiotattico lipidico denominato sfingosfina-1-fosfato (S1P) espresso dai linfociti T. La S1P è presente nel sangue e nella linfa a concentrazioni maggiori rispetto ai tessuti, grazie all’azione dell’enzima S1P liasi. I linfociti T naive circolanti esprimono bassi livelli di S1PR1, perché l’elevata concentrazione ematica di S1P causa l’internalizzazione del recettore. Il linfocita T naive che entra in un linfonodo trova una bassa concentrazione di S1P e questo favorisce nelle ore successive la riespressione in membrana di S1PR1. In questo lasso di tempo il linfocita T naive ha la possibilità di interagire con le cellule che presentano l’antigene. In seguito all’espressione del recettore, il linfocita T abbandona il linfonodo seguendo il gradiente di concentrazione della S1P del circolo linfatico efferente. Nel caso di un linfocita T naive riconosca l’antigene, il processo di attivazione inibisce per diversi giorni la ricomparsa in membrana di S1PR1, aumentando il tempo di permanenza del linfocita nell’organo linfoide. Questa inibizione è in parte dovuta all’azione degli interferoni di tipo 1. La stimolazione da parte dell’antigene e l’azione degli interferoni provocano l’espressione di una proteina, denominata CD69, che legandosi al recettore S1PR1 intracellulare ne impedisce l’espressione sulla superficie cellulare. In tal modo, il linfocita T attivato diventa momentaneamente insensibile al gradiente della S1P. questo processo consente ai linfociti attivati di rimanere nell’organo linfoide e andare incontro a espansione clonale e differenziazione in linfociti T effettori. Quando la differenziazione è completata, le cellule perdono l’espressione di CD69 e ricominciano ad esprimere S1PR1. Questo permette ai linfociti T effettori di fuoriuscire dal linfonodo attraverso il seno midollare e il vaso linfatico efferente in risposta al gradiente di concentrazione di S1P. Le molecole di S1P e S1PR1 sono anche coinvolte nella fuoriuscita dal timo di linfociti T naive mauri e nella fuoriuscita dei plasmablasti dagli organi linfoidi secondari. Il fingolimod è un farmaco che blocca la fuoriuscita dei linfociti T dagli organi linfoidi e agisce da potente immunosoppressore. L’utilizzo di questo farmaco è stato autorizzato per il trattamento della sclerosi multipla e per inibire il rigetto degli organi trapiantati. Il processo di homing dei linfociti T naive nei tessuti linfoidi associati all’intestino è simile a quello dei linfonodi e si basa sull’interazione dei linfociti T con le HEV. 32 Queste interazioni sono mediate da selectine, integrine e chemochine. Una caratteristica peculiare dell’homing dei linfociti T naive dell’intestino è costituita dal ruolo svolto da MadCAM-1, esclusivamente espressa dalle HEV dei tessuti linfoidi associati alle mucose. I linfociti T naive esprimono due molecole che legano MadCAM-1, l’L-selectina e l’integrina alfa4-beta7, entrambe coinvolte nel rolling dei linfociti T naive durante l’homing dei tessuti linfoidi associati all’intestino. La migrazione dei linfociti T nella milza avviene attraverso la polpa bianca e differisce da quella dei linfonodi. Nella milza non ci sono HEV e l’arrivo dei linfociti T è privo di regolazione e dovuto all’apporto ematico, quindi in assenza di un coinvolgimento delle selectine, integrine e chemochine. I linfociti T vengono indirizzati verso le aree T della polpa bianca dalla presenza di un gradiente di chemochine che legano CCR7. Il flusso di linfociti T attraverso la milza è molto elevato, ed è stimato che nel corso delle 24h almeno la metà dei linfociti circolanti transiti da questo organo. I linfociti T effettori differenziati in seguito al riconoscimento dell’antigene, fuoriescono dagli organi linfoidi secondari attraverso il circolo linfatico per ritornare nel sangue. Molte funzioni antimicrobiche dei linfociti T effettori devono essere svolte localmente al sito d’infezione e quindi queste cellule devono essere in grado di abbandonare gli organi linfoidi. Durante la differenziazione dei linfociti naive in cellule effettrici, i linfociti T perdono l’espressione di CCR7 e iniziano ad esprimere recettori per le chemochine infiammatorie presenti nei siti di infezione. I linfociti T effettore cessano di esprimere anche la L-selectina e i ligandi per la E e P- selectina, mentre l’espressione di S1PR1 viene ripristinata. Questi cambiamenti promuovono la fuoriuscita dei linfociti dai linfonodi attraverso i vasi linfatici. I linfociti T effettori raggiungono il circolo ematico attraverso i vasi linfatici e da qui potranno distribuirsi in tuti gli organi. I linfociti T effettori circolanti tendono a localizzarsi principalmente nei tessuti periferici sede di processi infettivi piuttosto che negli organi linfoidi, a causa del loro repertorio di molecole di adesione e di recettori per chemochine. Il processo di homing di linfociti effettori ha luogo nelle venule postcapillari. I linfociti T effettori circolanti esprimono i ligandi delle selectine, le integrine e i recettori delle chemochine, che legano i rispettivi ligandi espressi dall’endotelio attivano. La migrazione ei linfociti T effettori nei siti d’infezione non dipende dalla presenza dell’antigene, ma solo dalle cellule effettrici che incontrano il loro specifico antigene vengono qui trattenute. I linfociti T effettori esprimono integrine, le quali si legano alle proteine della matrice extracellulare, un processo che favorisce la ritenzione dei linfociti che vengono attivati localmente dalla presenza dell’antigene. I linfociti T effettori possono esercitare la loro azione per eliminare i microbi e altre fonti di antigeni. La maggior parte delle cellule che entra nei siti di infezione muore al termine della loro funzione. Alcune cellule effettrici migrano in determinati tessuti. Durante la maturazione negli organi linfoidi secondari, i diversi tipi di linfociti T acquisiscono caratteristiche migratore che permettono loro di migrare selettivamente in siti diversi. Esistono differenti tipi di linfociti T. I linfociti T effettori comprendono i linfociti T CD8+ citotossici e i linfociti T helper CD4+. I linfociti T helper comprendono le cellule TH1, TH2, TH17, ognuna di queste popolazioni esprime diversi tipi di citochine e promuove risposte antimicrobiche diverse. 35 Capitolo 4 IMMUNITA’ INNATA il termine immunità innata indica un insieme di meccanismi di difesa dell’ospite che sono prontamente disponibili. L’immunità innata comprende diversi tipi di cellule e molecole solubili he normalmente sono presenti nei tessuti e nel sangue. Queste cellule hanno il compito di impedire l’invasione e le infezioni da parte dei microrganismi. La risposta immunitaria innata garantisce una barriera difensiva precoce che precede lo sviluppo delle risposte immunitarie adattative. Le principali componenti del sistema immunitario innato sono: • Epiteli: bloccano l’ingresso dei microbi • Cellule sentinella: risiedono nei tessuti e sono i macrofagi, le DC e i mastociti che riconoscono i microbi che hanno superato la barriera epiteliale. • Leucociti circolanti: neutrofili, monociti-macrofagi, cellule natural killer ecc. • Proteine plasmatiche: coinvolte nell’eliminazione di microrganismi che hanno raggiunto il circolo ematico. Il sistema immunitario innato è dotato di sistemi di difesa di tipo fisico-chimico a livello delle barriere epiteliali come la cute e la mucosa del tratto gastrointestinale e respiratorio, che bloccano l’ingresso dei microbi. I microrganismi sono in grado di colonizzare i tessuti solo se riescono ad attraversare le barriere epiteliali. Se queste barriere sono danneggiate, o se i microbi riescono a superarle, vengono attivate le risposte immunitarie innate e adattative per garantire successivi livelli di protezione. L’immunità innata costituisce la risposta iniziale ed è in grado di eliminare le cellule danneggiate e di avviare il processo di riparo dei tessuti. L’evento che scatena queste risposte origina in seguito al danno cellulare e tissutale che è causato sia da processi infettivi che da quelli non infettivi. L’immunità innata, inoltre, stimola ed influenza la risposta adattativa, al fine di poter ottimizzare l’efficacia contro diversi tipi di microrganismi. Infatti, l’immunità innata invia dei segnali di pericolo che mettono il sistema immunitario adattativo in allerta. I principali meccanismi di azione dell’immunità innata riguardano l’infiammazione e la difesa antivirale. L’infiammazione è il processo attraverso il quale i leucociti circolanti e le proteine plasmatiche si accumulano nei siti di infezione dove vengono attivati per uccidere ed eliminare i patogeni. In caso di infezione virale, i meccanismi di difesa inibiscono la replicazione del virus e uccidono le cellule infettate, eliminando così gli accumuli di virus senza generare una risposta infiammatoria. Vi sono delle differenze sostanziali tra l’immunità adattativa e quella innata. Innanzitutto, le risposte dell’immunità innata non richiedono una pregressa presentazione del microbo, ed infatti sono immediate. Mentre, l’immunità adattativa sviluppa delle risposte nell’arco di giorni dall’infezione, quando i cloni dei linfociti che sono specifici per l’antigene si espandono e si differenziano in cellule effettrici. Le risposte innate non sono caratterizzate da variazioni apprezzabili nella qualità o nell’entità delle risposte in caso di esposizione ripetuta ad un microrganismo, infatti a memoria è assente o scarsa. Al contrario, nelle risposte adattative l’esposizione ripetuta ad un microbo ne migliorano la rapidità, l’efficacia e l’entità. Vi sono però delle eccezioni a questa regola, infatti i linfociti NK danno una risposta più intensa, ad una infezione virale, se sono stati esposti allo stesso virus. La risposta innata è attivata dal riconoscimento di un numero limitato di strutture molecolari prodotte dai microrganismi, o espresse dalle cellule danneggiate o morte. Viceversa, l’immunità adattativa è in grado di 36 riconoscere milioni di antigeni non self di origine microbica o non microbica e anche antigeni self normalmente espressi nei tessuti sani. Infine, i due tipi di immunità utilizzano recettori differenti. RICONOSCIMENTO DELL’IMMUNITA’ INNATA E ADESIONE L’immunità innata costituisce la prima linea di difesa contro le infezioni e rappresenta la componente del sistema immunitario più antica dal punto di vista filogenetico. La maggior parte dei meccanismi di difesa utilizzati dall’immunità innata sono comparsi nella scala evolutiva subito dopo lo sviluppo degli organismi pluricellulari complessi. Al contrario, è possibile identificare con certezza la presenza dell’immunità adattativa solamente nei vertebrati. L’immunità innata riconosce strutture molecolari che sono prodotte dalle patogene chiamate profili molecolari associati ai patogeni (PAMP). Classi diversi di microrganismi, come per esempio funghi, batteri e virus, esprimono PAMP differenti. Esempi di PAMP sono gli acidi nucleici come l’RNA virale a doppia elica, il DNA ricco di sequenze CpG ipometilate che si riscontra nei batteri, i liposaccaridi LPS dei batteri gram-negativi. L’immunità innata riconosce i prodotti microbici che sono indispensabili per la sopravvivenza dei microrganismi. L’adattamento evolutivo dell’immunità innata è importante perché impedisce ai microrganismi di eludere la risposta immunitaria innata in seguito a mutazione/perdita delle molecole riconosciute. L’immunità innata è anche in grado di riconoscere molecole endogene prodotte o rilasciate dalle cellule danneggiate o morte. Queste sostanze sono chiamate profili molecolari associati al danno (DAMP). I DAMP possono derivare da un danno cellulare di origine infettivo o non infettivo, e le cellule apoptotiche solitamente non ne rilasciano. Un tipico esempio di DAMP sono le allarmine, molecole endogene normalmente prodotte in quantità limitata dalle cellule normali, ma anche quando sono rilasciate in grande quantità dalle cellule danneggiate attivano l’immunità innata. L’immunità innata riconosce i PAMP e i DAMP utilizzando sia recettori cellulari, sia molecole solubili presenti nel sangue e nelle secrezioni mucose. I recettori cellulari sono espressi dai fagociti, DC, cellule epiteliali e mastociti. I recettori cellulari dei PAMP e DAMP sono chiamati recettori per profili molecolari. Essi sono espressi sulla membrana plasmatica, nelle vescicole fagocitiche e nel citosol. Il legame dei recettori cellulari da parte di PMAP o DAMP provoca l’attivazione di vie di trasduzione del segnale che promuovono le funzioni antimicrobiche e proinfiammatoria delle cellule. Esistono anche delle proteine solubili, presenti nel sangue e nei fluidi extracellulari, in grado di riconoscere i PAMP e che hanno il compito di facilitare l’eliminazione dei microrganismi attraverso la fagocitosi e l’attivazione dei meccanismi microbicidi. I recettori dell’immunità innata sono codificati da geni della linea germinale, mentre i recettori dell’immunità adattativa sono generati dalla ricombinazione somatica di segmenti genici durante la maturazione dei precursori dei linfociti. Ne consegue che la diversità dei recettori e il grado di specificità del sistema immunitario innato sono limitati rispetto a quelli del sistema immunitario adattativo. L’immunità specifica può discriminare tra antigeni espressi da microrganismi diversi appartenenti alla stessa classe e tra antigeni differenti di uno stesso microrganismo, mentre l’immunità innata può solo distinguere le diverse classi di microrganismi o le cellule danneggiate rispetto alle sane, ma non la specie microbica o il tipo cellulare. L’immunità innata non reagisce contro cellule e tessuti normali non danneggiati. Il mancato riconoscimento del self è dovuto a tre meccanismi: 1. Le cellule normali non producono ligandi per i recettori dell’immunità innata; 2. Questi recettori si trovano in compartimenti cellulari che non vengono a contatto con le molecole dell’ospite che essi riconoscono; 3. Le cellule normali possiedono proteine che impediscono l’attivazione delle diverse componenti dell’immunità innata. 37 RECETTORI DELL’IMMUNITA’ INNATA Quasi tutte le cellule esprimono recettori, ma le cellule che possiedono maggiore varietà e quantità di questi recettori sono i neutrofili, macrofagi e le DC. I recettori per profili molecolari attivano vie di trasduzione che en determinano risposte cellulari quali la produzione di molecole proinfiammatoria e antimicrobiche. RECETTORI TOLL-LIKE Sono una importante famiglia di recettori che vengono espressi da moltissimi tipi di cellule e sono in grado di riconoscere non solo molecole proprie dei microbi, ma anche molecole rilasciate da cellule danneggiate o morte. Il gene Toll venne identificato per la prima volta nella Drosophila, poi si vide che la proteina Toll era anche in grado di evocare risposte antimicrobiche. Andando più avanti negli studi si vide che il dominio citoplasmatico delle proteine Toll era molto simile a quello dei recettori per l’interleuchina-1, una citochina proinfiammatoria. Così sono stati ricercati geni omologhi anche nei mammiferi, scoprendo di fatto queste glicoproteine integrali di membrana molto simili alle proteine Toll, per questo motivo questi recettori vengono definiti Toll-like receptor (TLR). Essendo delle glicoproteine integrali di membrana, nei vari TLR, che sono in tutto 9 famiglie (TLR-1 fino a TLR-9) è possibile distinguere due regioni: • Regione extracellulare: caratterizzata da ripetizioni di residui ricchi in leucina, fiancheggiati da motivi ricchi di cisteina responsabile del legame con il ligando. • Regione citoplasmatica: in cui vi è un dominio definito Toll-interleuchina-1 receptor (TIR) che invece è essenziale per l’attivazione cellulare. Questi recettori sono in grado di riconoscere diverse sostanze, come le LPS e l’acido lipoteicoico della parete cellulare dei batteri, l’RNA virale e i nucleotidi CpG non metilati che sono comuni nei procarioti. Come detto pocanzi, i TLR sono anche attivati in risposta a molecole endogene la cui espressione o localizzazione indica la presenza di un danno tissutale. Per esempio, molecole self che attivano i TLR sono le proteine da shock e le HMGB-1, quest’ultima una proteina che lega il DNA e che ha una funzione nella trascrizione e nel meccanismo di riparazione del genoma. Queste sostanze vengono generalmente riconosciute dai TLR-2 e TLR-4 espressi dalle DC, macrofagi ed altre cellule. Esistono nove classi di TLR, queste sono distinte in: • TLR-1,2,4,5,6: espressi sulla membrana citoplasmatica e riconoscono i PAMP presenti nell’ambiente extracellulare, come LPS e l’acido lipoteicoico che si legano per lo più a TLR2 e TLR4. • TLR-3,7,8,9: sono intracellulari e riconoscono acidi nucleici microbici come l’RNA a doppia elica che lega TLR-3; l’RNA a singola elica che lega TLR-7,8; ed il DNA ricco di CpG non metilati che lega TLR-9. Questi recettori, però, per funzionare necessitano di una proteina presente nel reticolo endoplasmatico, denominata UNC-93B. La specificità dei TLR è dovuta ai moduli extracellulari ripetuti ricchi di leucina che legano i PAMP direttamente, o attraverso delle molecole adattatrici. Nei TLR sono presenti, infatti, 16-28 moduli ricchi di residui di leucina, ciascuno di questi composto da 20-30 AA organizzati in leucina-aagenerico-aagenerico-leucina-aagenerico-leucina-aagenerico- 40 proteico che presenta un dominio della pirina all’estremità aminoterminale e partecipa alla formazione di un inflammasoma. La formazione dell’inflammasoma avviene quando i sensori citosolici riconoscono prodotti microbici, così si legano e formano l’inflammasoma. L’inflammasoma, però, può essere attivato da tanti stimoli, come stimoli citoplasmatici associati a infezioni o stress cellulare, oppure dalla riduzione della concentrazione di ioni potassio nel citosol. Inoltre, molti stimoli, come alcune tossine batteriche, incrementano l’efflusso di ioni potassio dal citoplasma e dunque una ridotta concentrazione di questi ioni potrebbe rappresentare l’alterazione citoplasmatica responsabile dell’attivazione dell’inflammasoma. Un’altra risposta generata da stimoli di diversa origine è la produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) che sono rilasciati in corso di danno cellulare. L’attivazione dell’inflammasoma è anche causa di una forma infiammatoria di morte cellulare programmata dei macrofagi e delle DC che viene detta piroptosi, caratterizzata da edema cellulare, perdita di integrità della membrana plasmatica e rilascio di mediatori dell’infiammazione quali IL-1beta, IL-18, TNF, IL-6 ed IL-8. La piroptosi causa anche la morte di microrganismi che accedono al citosol. Durante la piroptosi viene effettuato un taglio dalla gasdermina D che causa la formazione di pori nella membrana. La piroptosi può essere innescata dall’attivazione sia degli inflammasomi canonici che contengono la caspasi-1, sia da un inflammasoma atipico che contiene una caspasi diversa. L’amplificazione del processo infiammatorio ad opera della piroptosi facilita l’eliminazione dei batteri ma può anche contribuire all’insorgenza dello shock settico. Molecole effettrici solubili dell’immunità innata Nel sangue e nei fluidi extracellulari sono presenti diverse molecole che fanno parte dell’immunità innata e che portano alla opsonizzazione dei microbi, così da facilitare la fagocitosi. Sistema del complemento Il sistema del complemento è caratterizzato da una serie di proteine che si complessano e che hanno la triplice funzione di garantire l’opsonizzazione dei microbi, il reclutamento dei fagociti e, in alcuni casi, l’uccisione diretta dei microbi. Il sistema del complemento si attiva nel momento in cui vengono riconosciute molecole microbiche che sono assenti nelle cellule normali. L’attivazione del sistema del complemento può avvenire secondo tre vie: • Via classica: caratterizzata dalla presenza di una proteina nota come C1q che riconosce la porzione Fc degli anticorpi legati ai microbi. Legandosi a questa porzione Fc, la proteina C1q andrà ad attivare due enzimi, quali C1r e C1s che porteranno all’attivazione della cascata proteolitica tipica del sistema del complemento, che generalmente inizia con precursore inattivo detto zimogeno. • Via alternativa: è più antica rispetto alla via classica, ed è attivata quando il complesso C3 convertasi porta alla formazione di C3, il quale poi viene tagliato in due frammenti, ovvero C3b (più grande e che ha funzione di opsina) e C3a (più piccolo e che innesca l’infiammazione). C3b, inoltre, può associarsi ad altre proteine formando il complesso C5 convertasi che scinde C5 in C5a e C5b, dove C5a ha la stessa funzione di C3a ma più esplosiva. C5b, inoltre, può associarsi ad altre proteine e portare alla formazione di MAC, ovvero del complesso di attacco alla membrana, che porta alla formazione di pori sulla membrana plasmatica delle cellule su cui è stato attivato il complesso del complemento. • Via lectinica: molto simile a quella classica, ma qui vi è una collectina, cioè una proteina trimerica, denominata MBL che lega i residui di mannosio presenti sulle glicoproteine e 41 glicolipidi batterici. Questo legame attiverà due enzimi, MASP1 e MASP2 che sono molto simili a C1r e C1s. Esistono anche altre proteine plasmatiche che sono in grado di riconoscere i microrganismi e mediare l’attivazione dell’immunità innata. Queste molecole prendono il nome di pentrassine e le più importanti sono: • Proteina C reattiva (PCR) • Sieroamiloide (SAP) • E la pentrassina lunga (PTX3) Queste proteine sono normalmente presenti in bassa concentrazione nel sangue, ma a seguito di un processo infettivo queste cominciano ad essere prodotte e rilasciate dalle cellule epatiche, in risposta alla stimolazione di IL-1 e IL6. E poiché sono prodotte all’inizio di un’infezione, queste prendono il nome di proteine della fase acuta. Altre molecole che sono in grado di riconoscere i microbi sono le collectine e le ficoline, e si tratta di proteine trimeriche che possono riconoscere i microbi grazie a residui di mannosio, che vengono legati, nel primo caso; e grazie a residui fibrinogeno-simili nel secondo caso. Un esempio di collectine sono le MBL, che mediano la opsonizzazione, e le proteine surfattanti come SP-A e SP-B che si trovano nei polmoni. La principale risposta dell’immunità innata è l’infiammazione, cioè quel processo che recluta una serie di cellule, per primi i neutrofili e poi i monociti, nei tessuti che sono sede di infezione. Un tessuto che è infiammato è caratterizzato da vasodilatazione, aumento del flusso ematico non che aumentata adesività dei leucociti alle cellule endoteliali che rivestono le venule post capillari. Tutto questo avviene grazie alla produzione di importati messaggeri noti come citochine. Le citochine hanno diverse funzioni, in quanto in alcuni casi permettono il differenziamento di alcune cellule, possono stimolare la produzione di chemochine da parte di alcune cellule, come macrofagi e neutrofili che esprimeranno poi i recettori affini a quelle chemochine prodotte; ancora, le citochine possono determinare l’espressione della E-selectina, importante per l’interazione a bassa affinità tra leucociti e cellule endoteliali; oppure le citochine possono portare all’espressione di recettori per le integrine. Generalmente le citochine hanno azione paracrina, anche se in alcuni casi possono agire anche in maniera endocrina. Le citochine proinfiammatorie più importanti sono la IL-1, IL-6 e TNF, ma vi sono anche altri tipi di citochine: • Fattore di necrosi tumorale (TNF): è una citochina prodotta principalmente dai macrofagi e dalle DC, ma può essere prodotta anche da altre cellule. IL TNF viene anche chiamato TNF-alfa, per distinguerlo dal TNF-beta (o linfotossina). l TNF è prodotto, dapprima, come una proteina transmembrana di tipo II lunga 212 amminoacidi e arrangiata in uno stabile omotrimero. Da questa forma legata alla membrana, diventa una citochina solubile omotrimerica (sTNF) grazie al taglio proteolitico di una metalloproteasi detta enzima convertitore il TNF alfa (ossia TACE). La forma trimerica solubile, del peso di 51 kDa, tende a dissociarsi per concentrazioni inferiori all'ordine delle nanomoli, perdendo la sua bioattività. Esistono due tipi di recettori per i TNF, e sono recettori di tipo I e di tipo II che appartengono alla superfamiglia dei recettori per TNF e sono espressi sulla membrana come trimeri. 42 Il legame tra il recettore ed il ligando determina l’associazione della porzione citoplasmatica del recettore con proteine della famiglia TRAF che inducono l’attivazione del fattore nucleare KB e della AP-1. La produzione del TNF è stimolata da PAMP e DAMP, il legame tra recettori e TNF induce processi che possono riguardare la trascrizione o l’apoptosi. Nelle infezioni gravi, il TNF può essere prodotto in grandi quantità andando a determinare malattie sistemiche. Infatti, in questi casi il TNF inibisce la contrattualità del miocardio e il tono della muscolatura dei vasi, causando diminuzione della pressione arteriosa e shock. Inoltre, il TNF può compromettere le normali proprietà anticoagulanti delle superficie endoteliali causando trombosi. Ed infine, la persistente produzione di TNF porta anche alla cachessia, ovvero al danno del tessuto muscolare e adiposo caratterizzato da deperimento fisico dovuto alla soppressione dell’appetito. • IL-1: è un mediatore della risposta infiammatoria e i principali produttori sono fagociti mononucleati attivati, anche se altre cellule come neutrofili, cellule epiteliali la producono. Esistono due forme di IL-1, alfa e beta, ma la principale è l’IL-1beta. Questa viene prodotta a partire da pro-IL-1 beta che poi verrà tagliato dalla caspasi-1 in seguito all’attivazione dell’inflammasoma, portando così alla forma definitiva dell’IL-1beta. Anche il fattore di necrosi tumorale, che condivide diverse capacità con l’IL-1, può attivare questa citochina. IL-1 è secreta per mezzo di una via non classica, ma anche attraverso dei pori che sono formati dalla gasdermina-D. la IL-1 è riconosciuta da recettori di tipo I e di tipo II, ed il legame porta all’attivazione di fattori di trascrizione come NF-kb e AP-1. • IL-6: è prodotta principalmente da fagociti mononucleati, Dc. Le sue funzioni sono sia a livello locale che sistemico. Infatti, questa IL induce la sintesi di proteine di fase acuta a livello epatico, insieme alla IL-1; promuove la differenziazione dei linfociti T helper in cellule che producono la IL-17, stimola la produzione di neutrofili nel midollo osseo. Questa IL viene prodotta in risposta a PAMP e DAMP, e quando si lega al proprio recettore induce l’attivazione del fattore di trascrizione STAT3. • IL-12: è un’altra citochina che viene prodotta principalmente dalle DC e dai macrofagi. Questa citochina si presenta come un eterodimero composto da due subunità, ovvero p35 che appartiene alla famiglia delle citochine di tipo I, e p40 che è presente anche nell’IL-23, infatti gli anticorpi che agiscono contro p40 bloccano entrambe le citochine. In effetti, questi anticorpi sono stati autorizzati per il trattamento contro malattie infiammatorie dell’intestino e la psoriasi. Questa IL-12 si lega a recettori costituiti da due subunità beta che appartengono alla famiglia delle citochine di tipo 1. Questo legame induce l’attivazione del fattore di trascrizione STAT-4, portando a diversi effetti come la produzione di interferone-gamma da parte delle cellule linfoidi innate di tipo 1, delle NK. Inoltre, questa citochina promuove la citotossicità dei linfociti citotossici CD8, e quando le DC presentano l’antigene ai linfociti T CD4 naive, questi saranno indotti a differenziarsi in linfociti TH1. • IL-18: attiva le funzioni delle cellule NK e la sua produzione dipende dall’attivazione dell’inflammasoma. • IL-15: stimola la differenziazione e le funzioni delle cellule linfoidi innate di tipo 1, delle cellule NK e dei linfociti T. Questo tipo di citochina può essere espressa legata alla catena alfa del suo recettore. Inoltre, questa citochina promuove la produzione dell’interferone gamma da parte delle NK. Infine, essa funge anche da fattore di sopravvivenza per i linfociti T citotossici e per le NK. • IL-33: è una citochina che stimola le cellule linfoidi innate, i mastociti e i linfociti TH2 a produrre IL-4, IL-5 ed IL-13 importanti per la difesa contro gli elminti e la patogenesi delle 45 Capitolo 5 ANTICORPI E ANTIGENI Gli anticorpi sono proteine circolanti che vengono prodotte e secrete in risposta agli antigeni. Gli antigeni sono molecole proprie dei microbi, e non solo, che sono in grado di legare i linfociti B e i linfociti T. inoltre, gli antigeni legano anche i complessi maggiori di istocompatibilità che però, a differenza dei linfociti T e B, non riescono ad esprimere una risposta contro i suddetti antigeni, ma piuttosto li presentano ai linfociti T che si attivano. Dunque, nel momento in cui un linfocita B naive riconosce un antigene e vi si lega, si innesca la risposta immunitaria adattativa di tipo umorale. A questo punto i linfociti B naive si differenziano prima in plasmacellule, le quali poi porteranno alla produzione dei diversi tipi di anticorpi che avranno queste funzioni: • Eliminazione dei patogeni e delle tossine da essi prodotte; • Opsonizzazione dei patogeni, così da facilitare il processo di fagocitosi da parte di altre cellule dell’immunità; • Attivazione del sistema del complemento. Gli anticorpi sono presenti, nella maggior parte dei casi, come molecole circolanti nel plasma. Di fatti, quando viene effettuato un prelievo, il sangue va incontro a coagulazione, ad eccezione di una porzione che rimane fluida e che prende il nome di siero. Il siero che contiene egli anticorpi verso i diversi antigeni prende il nome di antisiero. È possibile effettuare una titolazione degli anticorpi, ovvero un controllo della quantità di anticorpi presenti verso un determinato antigene. Questo processo avviene effettuando una serie di diluizioni del siero, fino a quando non vi saranno più anticorpi contro quel determinato antigene. Ovviamente più diluizioni vengono effettuate maggiore sarà il numero di anticorpi presenti. Si stima che ogni giorno vengono prodotti circa 2-3 g di anticorpi, dove i meglio rappresentati sono le IgA. Nel siero sono presenti diversi tipi di anticorpi, dove alcuni sono specifici per un singolo antigene, mentre altri, seppur diversi, sono specifici per un antigene comune. In quest’ultimo caso si parlerà di anticorpi policlonali. Gli anticorpi vengono anche definiti immunoglobuline, perché fanno parte della superfamiglia delle Ig e hanno funzione immunitaria. Gli anticorpi, inoltre, possono essere circolanti oppure espressi sulla membrana dei linfociti B, con la funzione di recettori per gli antigeni in questo ultimo caso. In goni caso, però, gli anticorpi possiedono delle strutture di base simili, essendo costituiti da quattro catene, due catene pesanti e due catene leggere. Anticorpi monoclonali Prima di passare alla struttura vera e propria è opportuno fare una parentesi sugli anticorpi monoclonali: questi sono stati essenziali per comprendere la struttura di tutti gli anticorpi. Visto che ogni linfocita B produce anticorpi con un’unica specificità, e purtroppo questi hanno emivita molto breve, per studiare la struttura degli anticorpi sono stati creati linfociti B immortali detti “ibridomi”. Queste cellule sono state ottenute mediante fusione di linfociti B con cellule di mieloma multiplo, tumore monoclonale delle plasmacellule. Gli anticorpi prodotti da tali cellule sono detti “anticorpi monoclonali”. Per osservare la struttura di un anticorpo di uno specifico antigene, si immunizza un ratto con tale antigene e se ne isolano i linfociti B prodotti, utilizzati poi per la creazione dell’ibridoma. Ogni ibridoma darà poi origine a progenie di ibridomi specifici per tali antigeni. Per confermarne la specificità si effettuano saggi immunologici con l’antigene in 46 questione. Questa scoperta degli ibridomi è stata utilizzata in molte applicazioni e tra le più comuni ricordiamo: • classificazione dei linfociti in base al fenotipo espresso mediante legame con anticorpi specifici. • immunodiagnosi di molte malattie sistemiche mediante riconoscimento in circolo di determinati antigeni • diagnosi di tumori • terapia, ad esempio, di artriti reumatoide o tumore alla mammella • evidenziare presenza di citochine mediante valutazione se l’anticorpo stimola o inibisce una de- terminata cellula. Essendo gli anticorpi monoclonali proteine estranee al nostro organismo, questi creavano un certo grado di resistenza. Sono stati creati i cosiddetti anticorpi umanizzati mediante inserimento genetico del segmento che codifica per i siti di legami specifici dell’antigene all’interno del segmento di DNA che codifica l’impalcatura dell’anticorpo. L’anticorpo ha così sembianze “umane” ma sito di legame specifico. Struttura degli anticorpi Ogni anticorpo è caratterizzato da due catene pesanti e da due catene leggere, ciascuna delle quali è caratterizzato da unità strutturali ripetute che sono composte da una sequenza di 110 AA che si ripiegano a formare una struttura globulare detta dominio Ig. Il dominio Ig è caratterizzato da due foglietti beta planari che sono formati da 4-5 nastri di polipeptidi ad andamento antiparallelo. Inoltre, i due foglietti beta planari sono tenuti insieme da ponti disolfuro, ed ogni nastro è tenuto insieme a quello adiacente per mezzo di anse. Sia le catene pesanti che quelle leggere, poi, presenta regioni variabili V, responsabili del legame con l’antigene, e regioni Costanti C. Le regioni variabili si trovano all’estremità aminoterminale, mentre quelle costanti all’estremità carbossiterminale delle catene. Nelle catene pesanti le regioni V sono composte da un dominio Ig, mentre quella C da 3-4 domini Ig. Nelle catene leggere, invece, sia la regione C che la regione V sono caratterizzate da un singolo dominio Ig. Inoltre, le regioni V di una catena pesanti e la regione V di una catena leggera adiacente si uniscono per formare una porzione definita Fab che corrisponde al sito di legame per l’antigene. Le catene pesanti C, invece, formano la regione FC. da ciò si evince la funzione dei due tipi di regione, infatti: • Regioni V: sono responsabili del legame con l’antigene; • Regioni C: nel caso della catena pesante hanno un ruolo nell’attività biologica delle cellule effettrici. Infatti, ci sono due tipi di forme delle catene pesanti che differiscono dalla loro estremità carbossiterminale. Infatti, una di questa estremità è in grado di legare gli anticorpi alla membrana plasmatica dei linfociti B, mentre l’altro funge da guida nella produzione e secrezione di anticorpi circolanti. Ciò nonostante, le maggiori differenze nella sequenza e nella diversificazione degli anticorpi dipende da tre brevi segmenti della regione V, sia nelle catene pesanti che in quelle leggere. Questi tre brevi segmenti non sono altro che le tre anse che fuoriescono dalla struttura e che connettono i vari nastri adiacenti presenti nei foglietti beta planari. Queste tre brevi sequenze vengono definite regioni ipervariabili ed hanno una struttura tridimensionale che combacia perfettamente con quella dell’antigene. Per questo motivo, le regioni variabili sono il sito di legame per gli antigeni, ed essendo perfettamente complementari, 47 queste regioni ipervariabili prendono anche il nome di CDR, ovvero regioni che determinano la complementarità. Le tre regioni ipervariabili, dette CDR1, CDR2, CDR3, della catena pesante si associano a quelle della catena leggera per formare quella struttura tridimensionale che costituisce il sito di legame per l’antigene. Le sequenze adiacenti a tali regioni sono altamente conservate e mantengono la forma dei domini Ig pressochè identica nei diversi anticorpi. Infine, poiché ogni anticorpo possiede due catene pesanti e due catene leggere, è possibile affermare che in ogni anticorpo vi sono almeno due siti di legame per gli antigeni. Gli anticorpi possono essere suddivisi in classi, anche detti isotipi, ed in sottoclassi. Le classi di anticorpi sono: IgA, IgG, IgM, IgD, IgE. Mentre le sottoclassi sono IgA1-IgA2, IgG1-IgG2- IgG3-IgG4. Le regioni C delle catene pesanti di tutti gli anticorpi di uno stesso isotipo hanno la stessa sequenza amminoacidica. Nelle IgM e IgE le regioni C contengono 4 domini Ig, mentre IgA, IgG ed IgD ne contengono 3. Le diverse classi e sottoclassi di anticorpi, poi, svolgono funzioni effettrici differenti e ciò è dovuto al legame delle regioni CH a recettori per la porzione Fc presente nelle diverse specie di cellule. Le catene pesanti di uno stesso isotipo hanno la medesima sequenza amminoacidica e tali catene vengono nominate con la lettera greca corrispondente al loro isotipo (α, ε, γ, μ, δ). Isotipi diversi svolgono funzioni diverse, infatti abbiamo visto essere le regioni C delle catene pesanti a determinare il tipo di interazione e quindi di risposta delle cellule effettrici. Gli anticorpi sono capaci nonostante la loro forma a Y di legare antigeni situati a 180 gradi tra loro grazie alla loro flessibilità dovuta a due fattori: • capacità dei domini Vh (v delle catene pesanti) di ruotare attorno al corrispondente dominio Ch • flessibilità della regione cerniera tra Ch1 e Ch2 Inoltre, gli anticorpi possono essere espressi in forma secreta o associati alla membrana, e questo dipende dalla sequenza di amminoacidi che è presente nell’estremità carbossiterminale dell’ultimo dominio della regione CH. infatti, gli anticorpi che vengono secreti contengono in questa porzione carbossiterminale una sequenza coda. Mentre quelli associati alla membrana possiedono due segmenti: una regione idrofobica esterna, ed una regione intracellulare caratterizzata da amminoacidi positivi che si legano a quelli negativi in corrispondenza dei fosfolipidi di membrana. Esistono due tipi di catene leggere, una κ e una λ. Ciascun anticorpo è omogeneo per le due catene, ovvero non contiene mai una catena κ e una λ ma sempre due catene dello stesso tipo. Nell’uomo il 60% delle Ig è formato da catene κ. In pazienti con tumori delle cellule B ovviamente questo rapporto varia e dunque si usa questo dato per valutare la presenza di eventuali neoplasie. Abbiamo detto che le catene pesanti sono costituite da tre domini Ig, e che gli anticorpi esistono in forma secreta o in forma di membrana; la sequenza amminoacidica C terminale dell’ultimo dominio Ig delle catene pesanti è quella che determina se un anticorpo sarà di secrezione o di membrana. La porzione carbossiterminale è idrofila, negli anticorpi di membrana in aggiunta vi è una regione transmembrana idrofobica seguita da una regione intracellulare carica positivamente che la ancora alla membrana. Le IgG e IgE secrete sono semplici monomeri ovvero due catene leggere e due pesanti. Le IgD non esistono in forma secreta, mentre le IgA sono spesso dimeri (4e4) e IgM sono o pentameri o esameri dotate di un peptide addizionale detto catena j deputato a stabilizzare il complesso. 50 Capitolo 6 PRESENTAZIONE DELL’ANTIGENE DEI LINFOCITI T E FUNZIONI DEL COMPLESSO MAGGIORE DI ISTOCOMPATIBILITA’ La principale funzione dei linfociti T è quella di eliminare i microorganismi e di attivare altre cellule, come linfociti B e macrofagi. Questo è possibile se i linfociti riconoscono delle molecole microbiche che prendono il nome di antigeni, ma per riconoscerli questi antogeni devono essere associati alle membrane delle cellule, e non devono quindi essere sospesi. Le cellule che permettono il riconoscimento degli antigeni, da parte dei linfociti T, prendono il nome di APC, ovvero cellule presentanti l’antigene. Le APC possono essere le DC, i macrofagi ed in alcuni casi anche i linfociti B. Generalmente, con il termine APC ci si riferisce solo alle cellule che possono presentare gli antigeni ai linfociti T CD4+. Affinché le APC possano presentare l’antigene è necessario che queste cellule esprimano sulla loro membrana dei complessi formati da molecole dell’MHC unite a piccoli peptidi. Infatti, le molecole del complesso maggiore di istocompatibilità sono in grado di legare piccoli antigeni peptidici, in corrispondenza delle loro tasche, e di presentarle ai linfociti T. in particolare, le MHC di classe II presentano gli antigeni ai linfociti T CD4+, mentre le MHC di I classe presentano glia antigeni ai linfociti T CD8+. Ovviamente, questi antigeni sono sempre trasportati dalle APC che sulla loro membrana esprimono questi complessi MHC-peptidi. Il fatto che i linfociti T riconoscano antigeni, generalmente, sottoforma di piccoli peptidi è dovuto proprio alle MHC e alle loro tasche che legano questi peptidi. Inoltre, esiste il processo di restrizione per MHC dove un linfocita T CD4+ è in grado di riconoscere un singolo antigene che viene trasportato da una delle tante molecole di MHC presenti. Come detto pocanzi, vi sono molte cellule che possono svolgere la funzione di APC, ma le principali sono sicuramente le DC. Le DC si trovano in corrispondenza degli epiteli, ma anche negli organi linfoidi. Quando le DC esprimono sulla loro membrana il complesso MHC-peptide, queste si attivano e portano anche all’attivazione dei linfociti T naive. Per garantire l’attivazione, però, le APC necessitano di un segnale primario, che è rappresentato dall’antigene, e di altri segnali, come molecole costimolatorie che aumentano le capacità delle APC di presentare l’antigene ai linfociti T. Inoltre, molte APC come le DC esprimono sulla loro membrana dei recettori per profili molecolari che sono in grado di riconoscere molecole come i PAMP. Ebbene, queste molecole aumentano la capacità delle APC di presentare l’antigene, in quanto innescano una serie di trasduzioni del segnale che aumentano l’espressione delle molecole dell’MHC e di molecole costimolatorie. Anche i linfociti possono avere un ruolo importante nell’aumentare la capacità della APC di presentare l’antigene. Infatti, alcuni linfociti T CD4+ possono esprimere sulla loro membrana recettori per ligandi come CD40 che viene espresso da cellule come DC e macrofagi. Il legame con questo ligando e i recettori per citochine come INF-gamma, sempre espresso da alcune APC, aumenta la capacità delle APC di presentare l’antigene. Come già detto, le DC possono essere localizzate in corrispondenza degli epiteli, dove aderiscono, o anche negli organi linfoidi secondari, questo perché i microbi possono penetrare dalla cute, dal tratto GI e respiratorio, e gli antigeni possono essere localizzati in queste zone, e quindi diretti ai linfonodi, oppure possono circolare nel sangue e quindi diretti alla milza. Dunque, il fatto che le DC occupino tali sedi le rende le APC più efficenti. 51 Durante un’infezione, infatti, le DC perdono la loro capacità adesiva nei confronti dell’epitelio, e iniziano ad esprimere il recettore CCR7 che legherà le chemochine CCL21 e CCL19, permettendo a queste cellule di migrare prima verso i vasi linfatici e poi verso gli organi linfoidi secondari. Anche i linfociti T naive esprimono recettori CCR7, e questo è fondamentale perché la colocalizzazione dei due tipi di cellule è un modo per aumentare la probabilità dei linfociti T naive di incontrare l’antigene e di attivarsi. Se l’infezione non è presente, allora le DC avranno altre funzioni, come presentare gli antigeni ai linfociti T autoreattivi, in modo da indurne la distruzione o la trasformazione in linfociti T regolatori. Ma le DC non sono le uniche cellule in grado di presentare l’antigene questa funzione, infatti, può essere svolta anche dai macrofagi e dai linfociti B, seppur con delle differenze. I macrofagi sono cellule che quando sono inattive prendono il nome di monociti. Quando vi è un’infezione, i monociti migrano verso il tessuto sede di infezione e si trasformano i macrofagi. I macrofagi hanno la capacità di legare l’antigene e di presentarlo ai linfociti T CD4+ che però sono stati già attivati, e la funzione di questi linfociti è quella di potenziare l’attività fagocitica dei macrofagi, cosicché questi possano fagocitare il microbo. Anche i linfociti B possono fungere da APC, ma solo se devono presentare antigeni T-dipendenti ai linfociti T helper, in modo tale che quest’ultimi possano portare all’attivazione della risposta umorale con conseguente stimolazione e produzione di anticorpi da parte dei linfociti B che si differenziano in plasmacellule. Infine, tutte le cellule nucleate possono presentare antigeni proteici citosolici ai linfociti CTL CD8+, in quanto tutte le cellule nucleate sono suscettibili all’infezione da parte di virus e a trasformazioni neoplastiche. Complesso maggiore di istocompatibilità Il sistema umorale combatte gli antigeni extracellulari in due modi: ne blocca l’azione e ne promuove l’eliminazione. Nel caso di antigeni extracellulari abbiamo visto che il testimone passa ai linfociti T che tuttavia necessitano di recettori esposti sulle cellule bersaglio che presentino l’antigene ai propri recettori. Questa funzione è svolta dal complesso maggiore di istocompatibilità (MHC). Vi sono due principali prodotti genici dell’MHC: le molecole MHC di classe I che presentano gli Ag ai linfociti citotossici e le molecole di classe II che li presentano ai linfociti helper. Alcuni geni sono rappresentati da una unica sequenza di DNA identica in tutta la popolazione e tali sono geni non-polimorfici e in genere sono presenti in modo omozigote su entrambi i cromosomi; altri geni esistono in forme alternative, ciascuna variante è detta allele, e vengono chiamati geni polimorfici. Individui detti imbred sono omozigoti di ogni locus genico e in ogni ceppo di tali individui ogni topo è geneticamente identico a un ogni altro: questi organismi si ottengono tramite ripetuti incroci tra individui consanguinei. Trapianti cutanei all’interno di uno stesso ceppo imbred venivano accettati, mentre tra ceppi venivano rifiutati. I geni responsabili di tale rigetto sono detti geni di istocompatibilità; mediante trapianti tra ceppi che differivano un solo locus è stato possibile identificare quello responsabile del rigetto ed è stato chiamato locus maggiore di istocompatibilità: esso era legato a un gene sul cromosoma 17 che codificava l’antigene 2 quindi venne chiamato H2. Successivamente si è visto che tale regione conteneva diversi geni correlati con la istocompatibilità, venne quindi ribattezzata complesso maggiore di istocompatibilità. Qual è il ruolo dell’MHC? I trapianti cutanei non sono qualcosa di naturale, quindi il vero ruolo del complesso rimase un mistero per molto tempo dopo la sua scoperta. Ceppi allogenici per MHC avevano grosse differenze nella capacità di sintesi di anticorpi specifici: i geni rilevanti in tali 52 differenze, chiamati geni della risposta immunitaria Ir, furono anche essi mappati all’interno del MHC, chiarendone definitivamente il ruolo biologico. Le molecole umane del MHC sono chiamate antigeni leucocitari umani (HLA) corrispondono alle H2 del topo. Sieri di pazienti contenenti anticorpi contro antigeni espressi da individui allogenici sono detto alloantisieri, gli anticorpi alloanticorpi e gli antigeni alloantigeni. Questi antigeni sono i nostri HLA. I primi tre geni definiti sono HLA-A, HLA-B, HLA-C: questi sono identificati come geni MHC di classe I e sono gli omologhi dell’ H2 del topo responsabili del rigetto nel trapianto(non- self). I geni Ir del topo responsabili della produzione di anticorpi, nell’uomo corrispondono ai geni MHC di classe II e sono HL A-DR, HL A-DP, HLA- DQ. Nell’uomo il cromosoma che contiene tutto il complesso maggiore di istocompatibilità è il cromosoma 6. In generale le proprietà dei geni dell’MHC possono riassumersi in: • Codifica di due gruppi di proteine (I e II) strutturalmente distinte ma omologhe • Sono i geni con il più alto grado di polimorfismo dell’intero genoma: per HLA-B esistono almeno 250 alleli differenti • Sono geni espressi in codominanza in modo da massimizzare il numero di molecole MHC sintetizzabili L’espressione dei geni MHC determina se gli antigeni non self, ovvero di un microbo, per esempio, vengono riconosciuti dai linfociti T. Le molecole MHC di classe I sono espresse da tutte le cellule nucleate, e la oro funzione è legata ai CTL CD8+ che sono cellule che mediano l’uccisione di altre cellule infettate da microrganismi intracellulari, come virus o tumori che presentano l’antigene. Le molecole MHC di classe II, invece, sono espresse dai linfociti B, dai macrofagi, dalle cellule epiteliali timiche e dalle DC. I linfociti T CD4+ naive riconoscono gli antigeni che sono catturati e presentati dalle DC negli organi linfoidi secondari. I linfociti T helper CD4 differenziati hanno la funzione di attivare i macrofagi che porteranno alla eliminazione dei microbi extracellulari; infine, questi linfociti T helper CD4 sono in grado di attivare i linfociti B, portando quest’ultimi alla produzione di anticorpi per eliminare i microbi extracellulari. Le citochine, prodotte per esempio durante le risposte immunitarie innate o specifiche, sono in grado di aumentare l’espressione delle molecole MHC. In particolare, l’espressione delle molecole MHC di classe I aumenta se vengono prodotte citochine come l’INF alfa e beta durante risposte immunitarie antivirali, ed inoltre questo p un meccanismo che porta anche all’attivazione dell’immunità specifica. Le molecole MHC di classe II, invece, sono maggior mente stimolate dalla produzione di citochine come l’INF gamma, che anche in questo caso consente un’amplificazione dell’immunità adattativa. Ma l’espressione delle molecole MHC di seconda classe, come già precedentemente detto, aumenta anche in risposta a molecole che si legano ai Toll-like espressi da alcune cellule, come le DC. Questa capacità delle citochine di potenziare l’espressione delle MHC avviene grazie alla stimolazione della velocità di trascrizione dei geni di I e di II classe. Questi effetti sono mediati dal legame dei fattori di trascrizione, attivati dalle citochine stesse, con le sequenze di DNA nelle regioni promotrici dei geni MHC. Diversi fattori di trascrizione vengono assemblati e legano una proteina detta induttore di trascrizione della classe II, o semplicemente CIITA; dopodiché, l’intero complesso (fattori di trascrizione e CIITA) si legano ai promotori dei geni e ha inizio la trascrizione. 55 Dunque, la funzione del proteasoma è quella di degradare le proteine citoplasmatiche danneggiate o che non hanno assunto la corretta conformazione. E questa funzione viene eseguita perché queste particolari proteine si legano ad una molecola definita ubiquitina. L’INF-gamma provoca un aumento della trascrizione e della sintesi di tre nuove subunità catalitiche del proteasoma, note come beta1 i, beta 2i e beta 5i, che vanno a rimpiazzare altre tre subunità catalitiche dell’anello beta del proteasoma. La lettera ''i'' indica immunoproteasome, e questo tipo di proteasoma è prodotto nel corso delle risposte innate e adattative ed è importante nella processazione dell’antigene. La produzione di queste subunità modifica la specificità per il substrato, cos’ che i peptidi generati contengano AA idrofobici al C-terminale, tipici peptidi che legano le molecole MHC di classe I. I peptidi generati dai proteasomi nel citosol sono trasportati da un trasportatore del RE definito trasportatore associato con la processazione dell’antigene (TAP). Tale trasportatore porta questi peptidi nel RE, dove sono presenti le molecole MHC di classe I. I peptidi trasporti nel RE legano le molecole MHC di classe I che sono associate a dimeri di TAP tramite la tapasina. I peptidi che entrano nel RE vengono spesso sminuzzati dalle aminopeptidasi residenti nel RE fino alla dimensione giusta per legare l’MHC. Una volta che le molecole di MHC di classe I sono caricate con il peptide, perdono la loro affinità per la tapasina, così il complesso peptide-MHC è in grado di uscire dal RE ed essere trasportata sulla superficie cellulare. I complessi MHC di classe I vuoti sono trasportati nel citosol e vengono, poi, eliminati dal proteasoma. I complessi peptidi-MHC di classe I, una volta espressi sulla membrana cellulare, possono essere riconosciuti dai linfociti T CD8+, con il corecettore CD8 che si lega a regioni non polimorfe di MHC. La produzione di peptidi associati alle MHC di classe II consiste nella degradazione proteolitica delle proteine internalizzate negli endosomi tardivi e nei lisosomi e il legame alle molecole MHC di classe II all’interno di questo compartimento vescicolare con pH acido. Gli antigeni proteici sono digeriti negli endosomi e nei lisosomi delle APC, e la fase iniziale della presentazione di un antigene proteico extracellulare prevede il legame dell’antigene nativo ad un’APC e la sua internalizzazione, quindi. Dopo che sono stati internalizzati, gli antigeni proteici si ritrovano localizzati in vescicole intracellulari rivestite da una membrana, e queste vescicole prendono il nome di endosomi. I microbi ed il materiale corpuscolato vengono poi internalizzati in vescicole chiamate fagosomi, i quali possono fondersi con i lisosomi producendo i fagolisosomi. Raramente proteine citoplasmatiche e di membrana possono essere processate e presentate su molecole MHC di classe II. A volte questo può essere il risultato di un normale processo di turnover del contenuto citoplasmatico, e tale processo prende il nome di autofagia. In particolare, durante questo processo le proteine citoplasmatiche vengono intrappolate in vescicole legate alle membrane, che prendono il nome di autofagosomi e che poi si fondono con i lisosomi e le proteine vengono così degradate. Dunque, l’autofagia è un meccanismo utilizzato per degradare le proteine cellulari e riutilizzarne i prodotti come fonte di nutrimento nei periodi di stress. Le proteine internalizzate vengono degradate enzimaticamente negli endosomi enei lisosomi, generando così dei peptidi che sono in grado di legarsi nelle tasche delle molecole MHC di classe II. La degradazione degli antigeni proteici all’interno delle vescicole è mediata da proteasi, come le catepsine. 56 Le molecole MHC di classe II sono sintetizzate nel RE e poi vengono trasportate negli endosomi, associati però ad una proteina che prende il nome di catena invariante e che occupa la tasca di legame per il peptide. La catena invariante è un trimero composto da tre subunità, ciascuna delle quali si lega ad un eterodimero in modo tale da bloccare la tasca ed impedire, quindi, il legame con altri peptidi. Dunque, le molecole MHC di classe II non possono legare i peptidi presenti nel RE, così questi restano disponibili per l’associazione con molecole MHC di classe II. Nelle vescicole endosomiali la catena invariante viene rimossa grazie alla molecola HLA-DM, in questo modo i peptidi possono legarsi alle tasche delle MHC. Le catepsine agiscono anche sulla catena invariante, lasciando solo un frammento di 24 AA denominato peptide invariante associato alla classe II (CLIP). La rimozione del CLIP, poi, e la sua sostituzione con un peptide che ha maggiore affinità viene effettuata nei lisosomi, ad opera di HLA-DM. La molecola DM ha anche il compito di selezionare i peptidi, favorendo così la presentazione di quelli dotati di maggiore affinità per le MHC di classe II. È anche possibile che si leghino peptidi di grosse dimensioni, i quali potranno essere poi tagliati fino a raggiungere la giusta misura per essere riconosciuti e legati. Le molecole MHC di classe II sono stabilizzate dal legame con il peptide e i relativi complessi sono trasportati sulle membrane delle APC, dove vengono esposti per il riconoscimento dei linfociti T CD4+ ed i corecettori CD4 che hanno il ruolo essenziale di legarsi alle regioni non polimorfe delle MHC. Alcune DC hanno la capacità di catturare ed ingerire cellule infettate da virus o cellule tumorali e di presentarne gli antigeni ai linfociti T CD8+ naive. Tali antigeni vengono ingeriti e trasportati dalle vescicole endocitiche al citosol, da cui i peptidi possono avere accesso alla via di presentazione in classe I. Questo processo avviene in cellule DC che possono presentare questi antigeni attraverso la via dell’MHC di classe II ai linfociti T helper CD4+, necessari per attivare la risposta dei linfociti T CD8+. Tale processo è definito cross-presentazione o cross-priming. In questo processo è necessaria la fusione fra RE e fagosomi che contengono gli antigeni ingeriti. Le proteine ingerite poi vanno al citosol e vengono degradate nei proteasomi, e i peptidi che ne derivano sono trasportati da TAP nuovamente al RE, dove vengono assemblati con MHC di classe I. Il processo di cross-presentazione è importante per le risposte dei linfociti T CD8+ ai virus, microbi e cellule tumorali, permettendo a tali linfociti di dare inizio a risposte più efficaci. I linfociti T CD4+ funzionano come cellule helper stimolando i linfociti B a produrre anticorpi e i macrofagi ad aumentare la loro funzione fagocitica, entrambi meccanismi necessari ad eliminare gli antigeni extracellulari. Il recettore per l’antigene dei linfociti T helper e dei CTL non è in grado di distinguere tra microbi extracellulari e intracellulari. Segregando i peptidi sulla base della localizzazione dei microbi, le molecole MHC determinano quale popolazione di linfociti T, CD4 o CD8, debba rispondere ad un dato patogeno e assicurano la risposta immunitaria più appropriata. Manca immunodominanza e presentazione di antigeni non proteici. 57 Capitolo 7 RECETTORI E VIE DI TRASDUZIONE DEL SISTEMA IMMUNITARIO L’idea che le cellule potessero esprimere recettori sulla loro membrana fu concepita nel 1897 da Paul Ehrilch, oggi considerato padre dell’immunologia moderna. Dunque, le cellule esprimono dei recettori che solitamente sono proteine integrali di membrana e che possiedono un dominio extracellulare capace di legarsi ad una molecola a loro specifica, nota come ligando. Il legame tra recettore e ligando porta all’attivazione di una serie di segnali intracellulari che vengono trasdotti, con esiti finali differenti a seconda delle condizioni. La via di trasduzione del segnale è l’insieme delle vie biochimiche intracellulari attivate all’interno della cellula n seguito al legame con il ligando. La trasduzione del segnale è caratterizzata da una fase citosolica, dove la porzione citoplasmatica del recettore viene modificata da enzimi, permettendo così l’attivazione dei fattori di trascrizione o il loro trasferimento nel nucleo. Alla fase citosolica, segue la fase nucleare dove i fattori di trascrizione inducono la trascrizione dei geni bersaglio. La via della trasduzione del segnale, dunque, porterà ad esiti differenti che possono riguardare la proliferazione cellulare, la crescita, il differenziamento oppure la morte della cellula per apoptosi. Esistono anche altri tipi di recettori, definiti nucleari, che sono in grado di riconoscere ligandi di natura lipidica, in quanto questi ultimi devono essere in grado di superare il doppio strato fosfolipidico. Ma per innescare la via di trasduzione del segnale è necessario che i ligandi inducano l’aggregazione delle proteine recettoriali, secondo un processo definito cross-linking, oppure la modificazione conformazionale del recettore stesso. Un evento iniziale che si verifica durante la via di trasduzione è l’aggiunta di gruppi fosfato, da parte di enzimi definiti chinasi, su residui di tirosina, treonina o serina. Nei linfociti vi sono un particolare tipo di chinasi che aggiungono gruppi fosfato su residui di tirosina, e per tale motivo queste chinasi prendono il nome di proteine tirosine chinasi. Ad una chinasi che effettua una fosforilazione, però, corrisponderà una fosfatasi che, invece, elimina il gruppo fosfato, così da poter modulare la via di trasduzione del segnale. I recettori sono classificati in diverse categorie, in base anche alle vie di trasduzione che attivano. Dunque, è possibile distinguerli in: • Recettori che utilizzano tirosine chinasi non recettoriali e che sono caratterizzate da code citoplasmatiche che non hanno attività enzimatica, e quindi l’attivazione del recettore dipende da una tirosina che fosforila residui specifici del recettore o proteine ad esso associate. • Recettori tirosinchinasici (RTK) che sono proteine integrali di membrana che attivano due o più domini tirosinchinasici presenti nelle code citoplasmatiche. • Recettori nucleari: che riconoscono ligandi lipidici e che vanno ad attivare o inibire la trascrizione dei geni • Recettori accoppiati a proteine G: sono accoppiati a proteine G che, quando il ligando si lega, sostituiscono il GDP in GTP, innescando la via di trasduzione del segnale • Altri recettori: come le proteine appartenenti alla famiglia Notch che hanno un ruolo importante anche nella maturazione ed attivazione dei linfociti. Questi recettori riconoscono ligandi come Wnt e, in seguito al legamene con il ligando, questi recettori subiscono un taglio proteolitico e la traslocazione nel nucleo di un loro dominio citoplasmatico che entra a far parte di un complesso trascrizionale. 60 Quando il complesso MHC-antigene viene riconosciuto dal recettore TCR, quest’ultimo cambia conformazione e rende disponibili i motivi ITAM che sono presenti nella porzione citoplasmatica del CD3 e nella catena zeta, così ce questi possano essere fosforilati dalle chinasi della famiglia Src. Questo è dovuto anche al fatto che i corecettori si aggregano al TCR. Esempi di corecettori sono CD8 e CD4 che vengono espressi dai linfociti T che legano regioni non polimorfe delle molecole MHC, facilitando così la trasduzione del segnale del TCR. I linfociti T alfa- beta maturi possono esprimere o solo CD4 o solo CD8, mai entrambi. Questi corecettori sono delle glicoproteine transmembrana che appartengono alla superfamiglia delle Ig. Inoltre, il CD4 è espresso dai linfociti T periferici e dai timociti, e si può trovare anche in quantità inferiori sui fagociti mononucleati e su alcune cellule dendritiche. Il CD8, invece, è espresso dalla maggior parte delle cellule sottoforma di eterodimero, costituito da due catene alfa e beta unite da ponti disolfuro. Il dominio Ig del corecettore CD8 si lega al dominio non polimorfo alfa-3 della molecola MHC di classe I, ed interagisce anche con porzioni del dominio alfa 2 e con la microglobulina beta2. In corrispondenza della coda citoplasmatica di questi corecettori è presente la chinasi Lck, appartenente alla famiglia Src. Questa chinasi si trova molto vicino agli ITAM delle catene CD3 e zeta, per cui fosforila questi domini ITAM e permette l’attivazione della tirosina chinasi ZAP-70. La fosforilazione delle proteine e dei lipidi è fondamentale per la trasduzione del segnale da parte del complesso TCR e dei suoi corecettori. Anche in assenza di attivazione del TCR è presente un livello basale di fosforilazione delle tirosine dei domini ITAM ed un reclutamento di ZAP-70 a questi ITAM fosforilati. Dopo pochi secondi dall’ingaggio del TCR, la chinasi Lck fosforila le sequenze ITAM delle catene CD3 e zeta. Le sequenze ITAM della catena zeta, quando vengono fosforilate, formano dei siti di ancoraggio per una chinasi appartenente alla famiglia Syk, e questa chinasi prende il nome di ZAP-70. La chinasi ZAP-70 contiene due domini SH2 che possono legare le fosfotirosine degli ITAM. Ogni ITAM ha due residui tirosinici ed entrambi devono essere fosforilati per formare un sito di ancoraggio per una molecola ZAP-70 che è in grado di fosforilare altri substrati coinvolti nella trasduzione del segnale. Un’altra via di trasduzione del segnale coinvolta nell’attivazione dei linfociti T è costituita dall’attivazione della chinasi PI3, enzima che si associa a proteine adattatrici, fosforilando il fosfatidilinositolo bifosfato, così da generare PIP3. Dunque, le proteine che contengono domini PH possono legarsi alla superficie interna della membrana solo quando viene generato PIP3. Dopo che ZAP-70 è stata attivata, questa chinasi fosforila molecole adattatrici che sono in grado di legare alcune molecole coinvolte nella trasduzione del segnale. Un evento importante, che garantisce questo fine, è la fosforilazione delle proteine adattatrici SLP-76 e LAT ad opera di ZAP-70. Una volta fosforilate, LAT si lega alla fosfolipasi C-gamma-1, che ha un ruolo nell’attivazione dei linfociti T e nel reclutamento di altre proteine adattatrici che sono identificate come segnalosoma del TCR. Pertanto, la funzione di LAT è quella di raggruppare componenti della trasduzione del segnale nelle vicinanze degli attivatori collocati in prossimità del TCR. E poiché la funzione di molte proteine adattatrici dipende dalla fosforilazione di ZAP-70 attivata, solo il riconoscimento dell’antigene innesca le vie di trasduzione el segnale che portano alla risposta funzionale dei linfociti T. 61 Formazione della sinapsi immunologica Il riconoscimento dei complessi peptide-MHC da parte del recettore TCR causa il reclutamento di diverse proteine di membrana e citoplasmatiche nel sito di contatto tra il linfocita T e l’APC. Ebbene, questa regione di contatto del linfocita con l’APC prende il nome di sinapsi immunologica (SMAC). La parte centrale di SMAC, che prende il nome di c-SMAC, è caratterizzata dalla presenza del complesso TCR, corecettori CD4 e CD8, recettori per le molecole costimolatorie ed enzimi. Inoltre, in questa regione centrale della sinapsi immunologica, la distanza tra membrana plasmatica del linfocita e APC e di 15nm. Le integrine rimangono nelle regioni periferiche della sinapsi, dove hanno il compito di stabilizzare il legame del linfocita T all’APC formando la regione periferica di SMAC chiamata p-SMAC. Molte molecole coinvolte nella trasduzione del segnale si localizzano dapprima in regioni della membrana citoplasmatica caratterizzate da un peculiare contenuto lipidico, che prendono il nome di raft lipidiche e in essi ha inizio l’attivazione del TCR e dei recettori costimolatori che portano al riarrangiamento del citoscheletro, il quale permette ai raft di unirsi e formare la sinapsi immunologica. Le SMAC assolvono ad alcune funzioni durante e dopo l’attivazione dei linfociti T: • La SMAC rappresenta un punto di contatto stabile tra il linfocita T e l’APC che presenta l’antigene e costituisce il sito di assemblaggio della macchina della trasduzione del segnale del linfocita. La sinapsi immunologica costituisce una regione preferenziale per l’attivazione del TR. L’attivazione dei linfociti T viene ostacolata dalla bassa affinità del TCR per il ligando. La sinapsi rappresenta, infatti, una regione in cui è facilitato l’ingaggio ripetuto dei TCR da parte dei pochi complessi peptide-MHC presenti sulla membrana dell’APC. Questo fenomeno permette alle poche molecole MHC che montano il peptide specifico di promuovere una trasduzione del segnale efficace. • La sinapsi permette un rilascio direzionato del contenuto di granuli secretori e citochine dal linfocita T verso l’APC o la cellula bersaglio. Nelle regioni delle sinapsi anche alcune citochine vengono secrete in modo direzionale verso la cellula che sta presentando l’antigene al linfocita T. • La sinapsi, soprattutto nella regione centrale, rappresenta anche il sito preferenziale di degradazione delle molecole coinvolte nella trasduzione del segnale che avviene mediante ubiquitinazione e ingresso nella via di degradazione endosomiale e lisosomiale, e contribuisce a spegnere l’attivazione dei linfociti T. Chinasi MAP nella trasduzione del segnale dei linfociti T Le proteine G che sono attivate dal legame con l’antigene stimolano tre diverse MPA chinasi che, a loro volta, attivano diversi fattori di trascrizione. Le principali proteine che appartengono alla famiglia delle proteine G sono Ras e Rac. La via di Ras comincia in seguito al riconoscimento dell’antigene, e questa via porta all’attivazione dei fattori di trascrizione attraverso l’attivazione della chinasi ERK. In condizioni di riposo il sito di legame è occupato dal GDP, ma quando il GDP è rimpiattato dal GTP allora Ras subisce un cambiamento conformazionale e può reclutare diversi enzimi, tra questi vi è C-Raf. L’attivazione di Ras nei linfociti T coinvolge le proteine adattatrici LAT e Grb-2. La fosforilazione di LAT da parte di ZAP-70 serve come sito di ancoraggio per il dominio SH2 di Grb-2. Una volta reclutata LAT, grb-2 recluta a sua volta alla membrana plasmatica il fattore di scambio Ras GTP/GDP chiamato SOS. Questo determina la formazione di Ras legata a GTP che è in grado di attivare una cascata di tre chinasi della famiglia MAP. 62 Ras-GTP attiva una chinasi a doppia specificità chiamata MEK-1 in grado di fosforilare residui adiacenti sia di treonina sia di tirosina della terza chinasi della cascata, chiamata ERK. ERK è una MAP chinasi e MAK-1 è definita MAP-chinasi-chinasi. Dopo attivazione, ERK trasloca nel nucleo e fosforila una chinasi chiamata Elk che a sua volta stimola la trascrizione di c-Fos, componente del fattore trascrizionale AP-1. Parallelamente all’attivazione di Ras da parte di grb-2 e SOS, le molecole adattatrici fosforilate reclutano e attivano una proteina di scambio GTP/GDP detta Vav, che agisce su un’altra proteina G chiamata Rac. Il complesso Rac-GTP innesca una cascata di MAP chinasi parallela a quella attivata da Ras, che porta all’attivazione di JNK che va a fosforilare c-Jun. Un altro membro della famiglia delle MAP chinasi è p38 che è attivata da Rac-GTP e ha il compito di attivare diversi fattori di trascrizione. Rac-GTP provoca anche la riorganizzazione del citoscheletro ed è responsabile dell’aggregazione dei complessi del TCR, dei corecettori e di altre molecole di trasduzione a livello della SMAC. L’attività di ERK e JNK termina attraverso un meccanismo a feedback negativo che comporta l’azione di fosfatasi a doppia specificità attivati dalle stesse ERK e JNK. Calcio e proteina chinasi C nella trasduzione del segnale dei linfociti T La trasduzione del segnale del TCR porta all’attivazione dell’isoforma gamma-1 dell’enzima fosfolipasi C. questo enzima catalizza l’idrolisi di fosfolipidi di membrana, dalla quale derivano prodotti che attivano eventi di trasduzione del segnale che portano all’attivazione di specifici fattori trascrizionale. Questa fosfolipasi viene reclutato nel giro di alcuni minuti dall’attivazione del TCR a livello della membrana plasmatica da parte di LAT nella sua forma fosforilata. Una volta fosforilata da ZAP-70 e da altre chinasi, questa fosfolipasi catalizza l’idrolisi di un fosfolipide di membrana chiamato fosfatidilinositolo 4,5-bifosfato, con formazione di due prodotti quali inositolo 1,4,5-trifosfato (IP3) e diacilgligerolo (DAG) che rimane in membrana. L’IP3 è responsabile del rapido aumento della concentrazione citoplasmatica di calcio che si osserva in seguito all’attivazione del linfocita T. L’IP3 diffonde nel citoplasma fino al reticolo endoplasmatico, dove lega il proprio recettore che è un canale del calcio, stimolando così il rilascio del calcio immagazzinato e aumentando la concentrazione di ioni calcio nel citosol. Nel momento in cui la concentrazione di calcio diminuisce nel RE, si attiva una proteina del RE che prende il nome di STIM1 che a sua volta attiva CRAC, che è un canale ionico della membrana plasmatica che permette di mantenere una concentrazione citosolica di cacio di 300-400 nM per più di un’ora. Un componente importante di CRAC è la proteina Orai ed infatti, una mutazione a carico del gene che codifica per questa proteina, causa una rara immunodeficienza. Il calcio citoplasmatico è un importante secondo messaggero che si lega alla calmodulina, attivando così alcuni fattori di trascrizione. Il DAG, invece, attiva la proteina chinasi C (PKC). Ciascuna di queste vie contribuisce all’espressione di geni che codificano per le proteine necessarie per l’espansione clonale, la differenziazione e le funzioni effettrici dei linfociti T. 65 La fosforilazione di ITAM porta allo ‘’smascheramento’’ di un sito d’attacco per i due domini SH2 che sono presenti nella tirosina chinasi Syk. Inoltre, l’associazione della chinasi Syk alle tirosine fosforilate, che si trovano nelle sequenze ITAM, ne determina l’attivazione, mediante fosforilazione, delle sue tirosine. Quest’ultimo processo avviene grazie alle chinasi della famiglia Src associate al BCR. La presenza di Syk e di Src attiva un’importante chinasi, nota come BTK, che è coinvolta nell’attivazione dei linfociti B. Anche in questo caso vi è l’attivazione di corecettori che porta al potenziamento dell’attivazione dei linfociti B. Infatti, l’attivazione dei linfociti B è garantita anche da proteine del complemento, grazie ad un particolare recettore che pende il nome di CD21 e che fa da tramite tra l’immunità innata e quella umorale. Il complemento, inoltre, è attivato dalla scissione delle sue componenti, e tra questi quello degno di nota è C3 che viene ulteriormente scisso, dando origine al frammento C3b. successivamente, C3b viene scisso, dando origine al frammento C3d che si lega alla superficie microbica o al complesso antigene anticorpo. Questo frammento C3d è riconosciuto dai linfociti B grazie ad un recettore che loro esprimono, noto come CR2 o recettore per il complemento di tipo 2. Questo recettore CR2, però, è espresso sottoforma di trimero, infatti sono presenti anche CD19 e CD81. E in particolare, quando CR2 e C3d si legano, CD19 si trova vicino alle chinasi di BCR, così da poter essere fosforilato. La fosforilazione di CD19 porta all’attivazione della chinasi PI£ che darà origine a PIP3 il quale, a sua volta, lega e attiva Btk e PCL-gamma-2. Quando l’antigene si lega al BCR, allora viene attivata Syk che porta, a sua volta, alla fosforilazione di proteine adattatrici come SLP-65, anche nota come BLNK. Quando viene attivata anche quest’ultima proteina, allora vengono reclutati altri enzimi che contengono domini SH2 e PTB, oltre che la fosfolipasi C e molecole adattatrici che possono attivare separatamente Ras e Rac. L’attivazione di queste molecole contribuisce all’attivazione di distinte vie di trasduzione del segnale. Nei linfociti B che sono stimolati dall’antigene, viene attivata la via delle Ras-MAP chinasi. In questo caso, quando SLP-65 si lega a Grb-2, che è una proteina adattatrice, viene attivato il fattore SOS. Successivamente, quando SOS è stato attivato, Ras passa dalla forma legata a GDP a quella legata a GTP, quindi anche Ras si attiva e contribuisce all’attivazione di Erk. L’attivazione di Rac, invece, porta all’attivazione di JNK. Inoltre, quando BCR viene attivato si attiva anche la fosfolipasi C la quale, legandosi a BLKN, viene fosforilata da Syk e Btk, generando IP3 e DAG. La funzione del IP3, come nei linfociti T, è quella di aumentare la concentrazione di Calcio, cosicché DAG possa percepirlo e possa attivare la chinasi PCK-beta che, a sua volta, fosforila altre proteine, portando all’attivazione di NF-kB. Infine, l’attivazione di alcune proteine porta all’attivazione della chinasi PI3, enzima importantissimo che facilita diversi eventi cellulari, tra cui la sopravvivenza dei linfociti B. Tutte queste cascate di trasduzione del segnale portano all’attivazione di diversi fattori di trascrizione, come NF-kB e Fos che sono coinvolti nella proliferazione e nella differenziazione dei linfociti B. 66 Attenuazione della trasduzione del segnale dei recettori del sistema immunitario L’attivazione dei linfociti deve essere controllata, da recettori inibitori, al fine di evitare che questi linfociti reagendo contro il non self rischino di danneggiare la cellula ospite. La maggior parte dei recettori inibitori del sistema immunitario contiene motivi ITIM che possono reclutare fosfatasi contenenti domini SH2 e attenuare, così, la trasduzione del segnale. I residui di tirosina presenti nei domini ITIM possono essere fosforilati da chinasi della famiglia Src e, inoltre, possono reclutare tirosina fosfatasi contenenti domini SH2, oltre che un inositolo fosfatasi contente domini SH2 che prende il nome di SHIP. Ebbene, queste tipo di fosfatasi hanno un ruolo essenziale nella modulazione della trasduzione del segnale nelle cellule NK e nei linfociti T e B attivati. Nei linfociti T i più importanti recettori inibitori sono CTLA-4, responsabile del mantenimento della tolleranza agli antigeni self, ed il recettore PD-1 che blocca l’attivazione dei linfociti T da parte del complesso TCR. Nei linfociti B, invece, il recettore inibitore più importante è Fc-gamma-IIB che lega immunocomplessi e che recluta SHIP, antagonizzando i segnali generati dalla chinasi PI3. Infine, questo recettore inibitorio spegne l’attivazione dei linfociti B dopo che gli anticorpi sono stati prodotti. Le molecole che devono essere degradate si legano all’ubiquitina, molecola attivata in maniera ATP dipendente dall’enzima E1che poi la trasferisce all’enzima E2, la quale attacca l’ubiquitina ad uno specifico substrato riconosciuto dall’ubiquitina ligasi E3. Dopo che la porzione C-terminale di un’ubiquitina è stata unita ad un residuo della proteina bersaglio, le estremità C-terminali delle successive ubiquitine vengono legate a residui di lisina dell’ubiquitina precedente, così da generare catene di poliubiquitina che verranno, poi, riconosciute dal proteasoma. Alcune ligasi E3 generano un tipo differente di catena di poliubiquitina, e una di queste è Cbl-b che recluta delle monoubiquitine, determinando l’endocitosi e la degradazione lisosomiale del complesso TCR e potrebbe rappresentare anche un meccanismo che regola la trasduzione del segnale dei linfociti T. Invece, i segnali che provengono da CD28 bloccano l’attività inibitoria di Cbl-b, e questo è uno dei modi in cui si ha l’aumentata attivazione di TCR. Recettori per le citochine e trasduzione del segnale I recettori per le citochine sono proteine transmembrana, caratterizzate da un dominio extracellulare, che lega le citochine, ed uno citoplasmatico che è responsabile della traduzione del segnale. La trasduzione del segnale, inoltre, si avvia nel momento in cui un ligando fa aggregare più recettori, così da portare le code citoplasmatiche più vicine e di conseguenza anche le chinasi non recettoriali. Il dominio extracellulare e il modo in cui avviene la trasduzione del segnale sono fondamentale per distinguere i diversi recettori per le citochine. Inoltre, i recettori che legano TNF sono particolari perché sono dei trimeri che subiscono un cambiamento conformazionale dopo essersi legati al ligando. • Recettori per le citochine di tipo I: queste citochine sono rappresentate da quattro alfa- eliche e legano recettori che di solito sono dimeri o trimeri, caratterizzati da catene che legano la citochina e catene, spesso condivise da più recettori che trasducono il segnale. Queste catene sono caratterizzate da domini conservati che contengono residui di cisteina e la sequenza triptofano-serina-AA qualsiasi-triptofano-serina, e sarà proprio l’AA diverso in ogni recettore che lo renderà specifico per una determinata citochina. Inoltre, questa 67 famiglia di recettori presenta dei sottogruppi, come i recettori che legano le citochine IL-2, IL-4, IL-9, IL-15 ed IL-21 che contengono la catena comune gamma, implicata nella trasduzione del segnale. Altri recettori per le citochine Il-6, Il-11 ed IL-27 utilizzano la catena gp130. In ogni caso, tuti questi recettori per le citochine di tipo I inducono la trasduzione del segnale attraverso la via JAK-STAT. • Recettori per le citochine di tipo II: anche questi recettori trasducono il segnale attraverso la via JAK-STAT e legano gli INF ti primo e secondo tipo, oltre che IL-10, IL-20 ed IL-22. • Recettori per TNF: sono recettori caratterizzati da trimeri preformati, costituiti da dominio extracellulari ricchi di cisteina e di meccanismi comuni che possono portare, durante la trasduzione del segnale, o all’espressione genica oppure all’apoptosi. Questi recettori subiscono un cambiamento conformazionale che permette loro di reclutare proteine adattatrici che, a loro volta, reclutano altre chinasiche iniziano la trasduzione del segnale. Inoltre, viene reclutata l’ubiquitina ligasi E3, oppure la proteina adattatrice TRADD che, a sua volta, può reclutare proteine dette TRAF dotati un’attività ligasi E3. Il recettore per il TNF di tipo I e la proteina Fas possono anche reclutare adattatori che causano l’attivazione della caspasi-8 e, quindi, indurre l’apoptosi. • Recettori per l’IL-1: questi recettori possiedono un dominio citoplasmatico detto TIR, e l’unione di TRL determina la dimerizzazione del recettore ed il reclutamento, in corrispondenza di TIR, di proteine adattatrici che contengono, anch’esse, TIR. Queste proteine adattatrici legano i recettori a molecole della famiglia IRAK che, a loro volta, connettono le proteine adattatrici a TRAF6, una ligasi E3 necessaria per l’attivazione di NF- kB. Altri eventi a valle della trasduzione del segnale dei TRL portano all’attivazione di chinasi MAP e alla fosforilazione di IRF3 e IRF7 che sono responsabili della trascrizione di interferoni di primo tipo. • Recettori per IL-7: questi recettori sono oligomeri preformati composti da varie combinazioni di catena A, B, C, D, E dell’IL17R. questi recettori, inoltre, includono almeno una molecola della catena IL-17RA. Ogni catena recettoriale è una proteina integrale di membrana di tipo I che contiene due domini di fibronectina di tipo III e un motivo SEFIR intracellulare, che ha una parziale omologia con il motivo TIR. Il motivo SEFIR non recluta adattatori condivisi con i TRL e il recettore di IL-1. Il motivo SEFIR si lega all’adattatore ACT- 1 che contiene anch’esso un motivo SEFIR e che contribuisce al reclutamento di TRAF6 e porta all’attivazione di NFkB. Trasduzione del segnale tramite JAK e STAT Le citochine di tipo I e di tipo II attivano la via di trasduzione del segnale JAK-STAT. Le JAK sono 4 chinasi Janus, mentre le STAT sono 7 fattori di trascrizione. Le forme inattive delle JAK sono associate ai domini citoplasmatici dei recettori che legano le citochine di tipo I e II. Quando le citochine si legano ai recettori, questi ultimi si aggregano e ciò determina l’attivazione delle chinasi JAK che cominciano a fosforilare i residui di tirosina presenti nella porzione citoplasmatica del recettore. Alcuni di questi residui di tirosina vengono riconosciuti e legati da domini SH2 presenti nelle proteine STAT, in modo tale da fosforilare queste proteine. Le STAT attivate sono in grado di legare il dominio SH2 si un’altra molecola di STAT, formando così un dimero che si stacca dal recettore e che trasloca nel nucleo, dove si lega a sequenze del DNA specifiche che portano alla trascrizione dei geni per le citochine. Una cosa che bisogna evidenziare è che le risposte sono molto specifiche, nonostante esistano molte citochine e pochi STAT e JAK, e ciò dipende dal fatto che i diversi recettori sono in grado di attivare diverse combinazioni di STAT e JAK grazie a specifiche sequenze presenti sulle code 70 Capitolo 8 MATURAZIONE DEI LINFOCITI E RIARRANGIAMENTO DEL RECETTORE PER L’ANTIGENE Il processo di maturazione (o sviluppo) dei linfociti è determinato dal fatto che i progenitori dei linfociti, presenti negli organi linfoidi primari (timo e midollo osseo), si trasformano in linfociti maturi che popolano gli organi linfoidi secondari. Tale processo richiede diverse tappe: • Orientamento dei progenitori verso la linea differenziativa B o T; • Proliferazione, così da aumentare il numero di cellule in grado di generare linfociti maturi; • Selezione di cellule che possiedono un recettore funzionante contro antigeni non self, ed eliminazione di quelle che agiscono contro il self; • Differenziazione dei linfociti T e B. In particolare, i linfociti B si differenziano in linfociti della zona marginale e linfociti B-1; i linfociti T, invece, si differenziano in linfociti CD4+ helper, linfociti CD8+ citotossici, linfociti natural killer, linfociti MAT e linfociti T gamma-delta. Le cellule staminali ematopoietiche, anche note come HSC, sono cellule pluripotenti presenti nel fegato fetale e nel midollo osseo che danno origine ai progenitori da cui deriveranno i vari linfociti B e T. La maturazione dei due diversi tipi di linfociti avviene in organi differenti, in quanto quella dei linfociti B avviene nel midollo osseo, mentre quella dei linfociti T nel timo. Inoltre, le HSC midollari danno origine alla maggior parte dei linfociti B circolanti e a quelli della zona marginale, così come ai linfociti T che esprimono il recettore alfa-beta. Invece, le HSC presenti nel fegato fetale danno origine ai linfociti B-1 e ai linfociti T che esprimono il recettore gamma-delta. L’indirizzamento verso la linea B o T dipende da segnali generati da diversi recettori di membrana, nonché da fattori di trascrizione attivati. Infatti, il differenziamento dei progenitori verso i linfociti B è garantito da fattori di trascrizione come EBE, EA2 e Pax-5; mentre quello dei linfociti T dipende da Notch-1 e GATA-3. Durante lo sviluppo dei linfociti B e T, le cellule progenitrici, già indirizzate verso una delle due linee, proliferano in risposta alle citochine e ai segnali generati da un pre-recettore per l’antigene. Il-7 è necessaria per la proliferazione dei progenitori dei linfociti T, ma non per i B. L’immunodeficienza grave combinata legata al cromosoma X è una malattia caratterizzata dal blocco dello sviluppo dei linfociti T e delle cellule natural killer, ed è dovuta a mutazioni nel gene che codifica per la catena comune gamma. Molti dei processi che avvengono nel nucleo, e che riguardano lo sviluppo dei linfociti, sono regolati a livello epigenetico. Infatti, l’organizzazione strutturale dei cromosomi può variare, rendendo alcuni geni accessibili al legame con fattori di trascrizione in alcune cellule. I meccanismi epigenetici che regolano l’accessibilità e l’attività dei geni comprendono: la metilazione del DNA, il rimodellamento della cromatina, il silenziamento dell’espressione genica ad opera di RNA. Anche i miRNA contribuiscono all’espressione genica, ed inoltre l’indirizzamento dei linfociti T verso le popolazioni CD4 e CD8 dipende da meccanismi epigenetici che silenziano l’espressione del gene che codifica per CD4 nei linfociti T CD8+. l riarrangiamento dei geni del recettore per l'antigene è l'evento chiave nella maturazione linfocitaria, essenziale per la generazione di un repertorio diversificato. I geni funzionali per i 71 recettori per gli antigeni sono prodotti nei linfociti B immaturi a livello del midollo osseo e nei linfociti T immaturi nel timo, attraverso un processo di riarrangiamento genico che genera una grande quantità di esoni diversi in grado di codificare per la regione variabile, a partire da una frazione di genoma relativamente piccola. In ogni singolo linfocita che si sta sviluppando, uno dei molti segmenti dei geni che codificano per la regione variabile viene scelto a caso e coniugato ad un segmento di DNA successivo. Questo processo comporta tagli specifici e il successivo ricongiungimento della doppia elica, con un meccanismo conosciuto come ricongiunzione delle porzioni terminali non omologhe. La diversificazione del repertorio dei linfociti è ulteriormente arricchita dall'aggiunta e rimozione di singoli nucleotidi durante la ricongiunzione dei vari segmenti. I pre-recettori per l'antigene e i recettori per l'antigene trasmettono durante il processo maturativo segnali indispensabili per la sopravvivenza, la proliferazione dei linfociti e la continuazione del processo maturativo stesso. Durante la maturazione delle cellule B, il primo gene che si riarrangia completamente è quello per la catena pesante delle immunoglobuline, o gene IgH. Nelle cellule T, è invece il gene per la catena del TCR che si riarrangia per primo. Il riarrangiamento corretto del gene per la catena pesante delle Ig porta alla sintesi della proteina e all'espressione di un pre-recettore per l'antigene sulle cellule pre-B. In modo analogo, le cellule T che nel loro sviluppo hanno riarrangiato correttamente il gene per la catena del TCR sintetizzano la proteina corrispondente ed esprimono un pre-recettore per l'antigene chiamato pre-TCR. I linfociti che non esprimono un pre-recettore per l’antigene, a causa di un non corretto riarrangiamento dei loci per la catena pesante delle immunoglobuline o per la catena del TCR muoiono per apoptosi. I linfociti che, invece, superano il “controllo di qualità” del pre-recettore per l'antigene si sviluppano ulteriormente negli organi linfoidi primari fino a esprimere il recettore per l'antigene completo. In questa fase, i linfociti sono ancora in uno stadio immaturo in cui le cellule potenzialmente pericolose, poichè in grado di riconoscere ad alta avidità strutture self, possono essere eliminate o indotte a modificare i propri recettori, mentre cellule che esprimono recettori “utili” vengono mantenute in vita. Il processo che salvaguardia quest'ultimi linfociti è detto selezione positiva. I linfociti T maturi, i cui precursori hanno superato la selezione positiva nel timo, saranno quindi potenzialmente in grado di riconoscere, nei tessuti periferici, peptidi antigenici esogeni presentati dalle molecole MHC. La selezione negativa è, invece, il processo che elimina o modifica, durante la maturazione i linfociti i cui recettori si legano tenacemente agli antigeni self presenti negli organi linfoidi primari. Durante questa fase, i linfociti T che hanno un’alta affinità per gli antigeni self sono eliminati per apoptosi, fenomeno conosciuto come delezione clonale. I linfociti B immaturi che hanno forte reattività per i self possono essere indotti a riarrangiare ulteriormente i geni Ig al fine di modificare la loro reattività al self. Questo fenomeno è chiamato editing recettoriale (receptor editing). Riarrangiamento dei geni per il recettore per l’antigene dei linfociti B e T I geni che codificano per i recettori per l'antigene nei linfociti B e T sono generati nei singoli linfociti dal riarrangiamento di segmenti diversi del gene che codifica per la regione variabile (V) con segmenti dei geni delle diversità (D) e/o quelli della ricongiunzione (joining) (J). Per ognuno dei geni che codificano per il recettore per l'antigene viene generato un nuovo esone riarrangiato mediante la fusione di un segmento del gene V, situato in posizione upstream, con un segmento downstream sullo stesso cromosoma. Questo peculiare processo di riarrangiamento selettivo è chiamato ricombinazione V(D)J (i termini ricombinazione e riarrangiamento sono usati indifferentemente). Infatti, in aperto contrasto con le nozioni di genetica molecolare enunciate da Beadle e Tatum nel 1941, come l'ipotesi di “un gene-una proteina”, Dreyer e Bennett nel 1965 72 postularono che ciascuna catena anticorpale fosse in realtà codificata da almeno due geni, uno variabile e l'altro costante, e che i due geni si unissero fisicamente a livello del DNA o dell'RNA messaggero (mRNA) per dare origine alle Ig vere e proprie. L'organizzazione dei loci delle Ig e del TCR nella linea germinativa è fondamentalmente simile ed è caratterizzata dalla segregazione spaziale di sequenze che devono essere congiunte tra loro per produrre geni funzionali in grado di codificare le proteine del recettore per l'antigene. (Organizzazione dei loci genici per le Ig). Esistono tre loci genici separati che codificano per tutte le catene pesanti, le catene leggere di tipo e le catene leggere delle Ig. Ogni locus è localizzato su un diverso cromosoma. Nella linea germinativa ciascun locus per le Ig è formato da copie multiple di almeno due differenti tipi di segmenti genici, i segmenti V e J, che sono localizzati upstream agli esoni della regione costante (C). In aggiunta, il locus per la catena pesante delle Ig possiede diversi segmenti di diversità (D). All'interno di ciascun locus, le sequenze dei diversi tipi di segmenti genici sono separate tra loro da sequenze di DNA non codificante. All'estremo 5' terminale di ciascun locus delle Ig, vi è un insieme di segmenti genici V; nell'uomo esistono circa 35 geni V per la catena leggera e circa 100 geni funzionali nel locus della catena pesante. Localizzato al 5' di ogni segmento V c'è un esone (leader) che codifica i 20-30 residui N-terminali della proteina tradotta. Queste sequenze sono moderatamente idrofobiche e costituiscono il peptide leader, cioè sequenze segnale che caratterizzano tutte le proteine neosintetizzate che sono secrete e/o transmembrana. Le sequenze leader svolgono un ruolo importante durante la sintesi proteica nel guidare i polipeptidi nascenti dai ribosomi al lume del reticolo endoplasmatico (ER). Qui le sequenze segnale sono rapidamente scisse e sono perciò assenti nella proteina matura. Upstream a ogni esone leader c'è un promotore del gene V dove inizia la trascrizione. A distanze variabili in posizione 3' rispetto ai geni V si trovano i segmenti J, lunghi generalmente 30-50 paia di basi e separati da sequenze non codificanti. Tra i geni V e C in ciascun locus si trovano sequenze codificanti aggiuntive, conosciute come segmenti D. Nelle catene leggere (o), il dominio V è codificato dai segmenti dei geni V e J, mentre nelle catene pesanti il dominio V è codificato dai segmenti dei geni V, D e J. La terza regione ipervariabile (CD3) delle molecole anticorpali e del TCR è costituita quindi dalla giunzione VDJ, che include i segmenti D e J e tutti i residui di giunzione (nel caso delle IgH e dei TCR), o dalla giunzione VJ, che include il segmento J e le sequenze giunzionali (nel caso delle catene leggere delle Ig o del TCR). CDR1 e CDR2 cono codificati nella linea germinativa da un segmento presente in ogni gene V. Invece, i geni che codificano per le catene, e del TCR sono localizzati in tre loci separati, mentre il locus per la catena è contenuto all'interno di quello per la catena. Nella linea germinativa, ciascun locus contiene segmenti V, J e C. Inoltre, i loci per le catene e possiedono anche segmenti D, come il locus per la catena pesante delle Ig. All'estremo 5' terminale di ognuno dei loci del TCR, si trova un folto gruppo di segmenti genici V, disposto in modo simile ai geni V delle Ig. Upstream ad ogni gene V c'è un esone che codifica per un peptide leader, e upstream ad ogni esone leader c'è un promotore per ogni gene V. A distanza variabile all'estremità 3' terminale dei geni V del TCR ci sono i geni della regione C. Inoltre, in tutti i loci, i segmenti J si trovano immediatamente upstream ai geni C, mentre i segmenti D sono presenti solo nei loci per le catene e. Nella catena o del TCR (analogamente alle catene leggere delle Ig), il dominio V è codificato dagli esoni V e J, mentre nelle proteine e il dominio V è codificato dai segmenti genici V, D e J. 75 Regola 12/23 La regola 12/23 è il principio che segue la ricombinazione V(D)J. La ricombinazione, infatti, è possibile solo tra due segmenti fiancheggiati l'uno da uno spaziatore di 12 basi e l'altro di 23 basi. Nelle catene leggere dove la ricombinazione avviene fra V e J, le RSS a valle del segmento V sono spaziate da 12/23 bp, mentre quelle a monte di J da 23/12 bp in base al tipo di catena. Nelle catene pesanti, invece, le RSS a valle di V sono sempre spaziate da 23 bp così come quelle a monte di J. La ricombinazione VJ, infatti, non avviene poiché devono prima riarrangiare D e J perché anche V venga unito. Queste sequenze servono ad indicare il sito di taglio (tra l'eptamero e il segmento contenente i geni) in cui poi i due segmenti si uniranno. Una volta avvenuto il taglio a doppia elica, lo spezzone di DNA contenente le RSS viene rimosso sotto forma di anello (per il legame fra le sequenze segnale) e la conseguente unione dei segmenti (ricombinazione per delezione). La ricombinazione avviene per delezione solo quando le RSS sono in direzione opposta (ad esempio segmento V - eptamero - nonamero - [...] - nonamero - eptamero segmento J) in questo modo, infatti il DNA viene piegato e le sequenze segnale si ritrovano a fianco nella stessa direzione. Se le RSS sono disposte nella stessa direzione (ad esempio segmento V - eptamero - nonamero - [...] - eptamero - nonamero - segmento J), avviene la ricombinazione per inversione dove il DNA viene invertito e avvicinato in modo tale che, come per la delezione prima del taglio, le RSS siano di fianco e disposte nello stesso orientamento. Il successivo taglio-incolla porta all'unione fra i due segmenti codificanti e delle due RSS tramite eptameri. La ricombinazione V(D)J avviene solo nei linfociti B e T benché tutte le cellule dell'organismo possiedano in configurazione germinativa i loci per le Ig e per il TCR sopra descritti. In queste cellule un segmento V, uno D e uno J scelti casualmente possono essere affiancati così da creare le regioni variabili di geni ricombinati che possono essere trascritti in mRNA che a loro volta codificano per i recettori dell'antigene. Le regioni costanti sono codificate dai segmenti C collocati accanto, ma a valle (senza sequenze di DNA non codificante interposte) del blocco V(D)J anche nei nuovi geni ricombinati. Le differenti combinazioni di segmenti V, D e J cui si aggiungono modificazioni successive come l'aggiunta o la rimozione di nucleotidi giustificano l'incredibile diversità dei recettori del repertorio linfocitario. La ricombinazione V(D)J non può avvenire in cellule differenti dai linfociti anche perché nel processo sono coinvolti numerosi enzimi, alcuni dei quali sono presenti solo in questo tipo di cellule, altri invece sono presenti in tutte le cellule dove normalmente sono coinvolti nella riparazione del DNA e nella ricombinazione non omologa. La ricombinasi V(D)J dei linfociti (cioè il tetramero Rag-1/Rag-2) agisce a livello di speciali sequenze segnale. La ricombinazione V(D)J provoca l'avvicinamento di sequenze enhancer a valle del segmento V. Queste sequenze si vengono così a trovare adiacenti alle sequenze promotrici a monte, aumentando i livelli di trascrizione. Visto l'alto tasso di ricombinazioni può succedere che geni di altri loci risentano di questa aumentata attività provocando tumori dei linfociti B e T. Dopo aver reso accessibili le zone dei cromosomi contenenti i loci alle componenti del processo, la ricombinazione ha inizio con il taglio nelle sequenze RSS. Seguono poi le modificazioni a livello dei nucleotidi per aumentare la diversificazione e l'unione delle estremità codificanti. Affinché possa avvenire il taglio le regioni RSS devono essere avvicinante formando delle strutture ad anello (oppure l'inversione) che rimarranno stabili per tutto il processo. Avvengono quindi i tagli nella doppia elica fra gli eptameri e le regioni codificanti: le proteine deputate a questa azione sono chiamate Rag-1 e Rag-2. Queste due proteine sono codificate da geni specifici per i linfociti detti geni attivanti la ricombinazione 1 e 2' e si assemblano in un tetramero chiamate ricombinasi V(D)J. Delle due Rag-1 funge da endonucleasi di restrizione, mentre Rag-2 76 favorisce l'interazione con altri fattori importanti per la ricombinazione; insieme contribuiscono a tenere stabile la struttura ad anello. La rottura a doppio filamento di Rag-1 genera due tronconi contenenti i geni posti l'uno di fronte all'altro e la struttura ad anello tronca. Quest'ultima rimane così, mentre nei due tronconi la terminazione 3' OH si lega alla terminazione dell'altro filamento generando una struttura a forcina (hairpin). Nel caso della ricombinazione ad inversione le RSS rimangono più a valle nel DNA. Dopo il taglio è il momento dell'aggiunta casuale di nucleotidi che aumenti la diversificazione. Per questo un enzima, Artemis, apre le hairpin consentendo ad un altro enzima di modificare le basi alle terminazioni. L'aggiunta o rimozione di nucleotidi è possibile perché Artemis nell'aprire le hairpin taglia in modo asimmetrico, per cui uno dei due tratti di DNA è più corto dell'altro e deve essere esteso con nucleotidi complementari a quelli del tratto più lungo. I nucleotidi aggiunti o rimossi sono chiamati nucleotidi P e sono codificati da uno stampo. È inoltre possibile l'aggiunta di altri nucleotidi, fino a 20, senza stampo, grazie all'azione della desossiribonucleotidil transferasi terminale (TdT, Terminal deoxynucleotidyl Transferase); tali nucleotidi sono detti nucleotidi N. L'azione della TdT è rischiosa, perché può introdurre un numero di nucleotidi non multiplo di 3 e quindi generare codoni di stop prematuri. L'azione di TdT è comune in particolare nelle catene pesanti delle immunoglobuline e nella catena β del TCR, regioni del recettore dell'antigene con il più alto grado di diversificazione. Tale processo è una ricombinazione per delezione. L'ultima tappa è l'unione dei due filamenti che si ricongiungono attraverso il processo fisiologico di riparazione del DNA a doppio filamento. In particolare, vengono usati Ku70 e Ku80 che ricongiungono le estremità e reclutano l'enzima DNA-PK in grado di riparare la doppia elica. Diversificazione dei linfociti B e T La combinazione di diversi segmenti genici V, J e D che vengono uniti possono portare alla produzione di tantissimi recettori diversi. Il numero massimo di combinazioni di questi segmenti genici è il prodotto del numero di segmenti genici di V, J e D in ogni locus. Per cui, la diversificazione totale è il prodotto della diversità combinatoriale di ognuna delle due catene leggere associate. Il reale grado di diversificazione presente in ogni individuo è inferiore a quello ipotizzato, questo perché non tutte le possibili combinazioni dei segmenti genici hanno la stessa probabilità di realizzarsi. Il numero massimo possibile di combinazioni può variare da 1 a 3 milioni. Ma il contributo più importante per il fatto che vengono generati molti recettori differenti è dato dalla rimozione, o aggiunta, di nucleotidi tra le terminazioni dei segmenti genici V e D, D e J o V e J al momento della loro unione. Questo processo avviene attraverso la rimozione, ad opera di un’endonucleasi, di nucleotidi dalla sequenza germinativa alle estremità dei segmenti genici che si ricombinano. Inoltre, nuove sequenze di nucleotidi possono essere aggiunte ai siti di giunzione. I segmenti genici codificanti, una volta tagliati dalle Rag, formano strutture le cui estremità possono essere scisse in maniera asimmetrica, così da formare un segmento di DNA più lungo ed un altro più corto. Il tratto di DNA più corto deve essere esteso con nucleotidi complementari a quelli del tratto di DNA più lungo. Inoltre, il tratto di DNA più lungo serve da sequenza stampo per l’aggiunta di nucleotidi definiti nucleotidi P. Un ultimo meccanismo giunzionale è legato all’aggiunta casuale di un massimo di 20 nucleotidi casuali definiti nucleotidi N, la cui aggiunta è dovuta all’enzima transferasi terminale di deossinucleotidi (TdT). L’aggiunta di nucleotidi P e N nei siti di ricombinazione, ovviamente, può 77 generare la nascita di codoni di stop che porterebbero alla produzione di proteine non funzionanti, ma questo è il prezzo da pagare per avere il massimo della diversificazione. A causa della diversità giunzionale, gli anticorpi e i TCR mostrano la massima variabilità in corrispondenza delle giunzioni delle regioni V e C che formano la terza regione ipervariabile (CDR3). Queste regioni sono le più importanti nel determinare la specificità del legame dell’antigene. Infatti, a causa della diversità giunzionale, il numero delle diverse sequenze amminoacidiche presenti nelle regioni CDR3 delle Ig e due TCR è maggiore del numero che può essere codificato dai segmenti genici presenti nella linea germinativa. Il reale numero di recettori per l’antigene espressi dai linfociti B e T di ogni individuo è nell’ordine 107, anche se il numero teorico di Ig e TCR che possono essere prodotti è maggiore. Questo è dovuto al fatto che molti recettori non superano i processi selettivi. Vi sono dei test di laboratorio che vengono impiegati per identificare tumori monoclonali. Siccome ogni clone linfocitario esprime un’unica regione CDR3, la sequenza di nucleotidi nel sito di ricombinazione VDJ funziona come marcatore clonale specifico. Così, determinando la sequenza delle regioni giunzionali dei geni per le Ig o il TCR in diversi linfociti B e T, si può stabilire se si tratta dell’espansione di un singolo clone (segno di neoplasia) o di cloni diversi (proliferazione non neoplastica). 80 Questi linfociti secernano anticorpi, in maniera spontanea, diretti contro lipidi e polisaccaridi, e poiché occupano le mucose si pensa che la principale fonte di antigeni che li stimola sia rappresentata dai microbi della flora intestinale. Infatti, si stima che la maggior parte di IgA presenti nelle mucose sia prodotta proprio da questi linfociti. I linfociti B della zona marginale sono localizzati nella milza e producono anticorpi naturali. Questi linfociti esprimono IgM in assenza di IgD e in presenza di alti livelli di CD21, corecettore che li distingue dai linfociti B follicolari. Tuttavia, questi linfociti non riescono ad essere distinti dalle cellule B della memoria che producono IgM. Una caratteristica peculiare dei linfociti B della zona marginale è quella di rispondere velocemente ai microbi presenti nel sangue, per poi differenziarsi in plasmacellule che producono e secernano IgM, anche se hanno una vita breve. I linfociti B immaturi che riconoscono antigeni autoreattivi con grande affinità sono indotti a modificare la loro specificità mediante un processo definito editing recettoriale. Il riconoscimento di antigeni self da parte dei linfociti B immaturi causa la riattivazione dei geni RAG e il riarrangiamento e la produzione di una nuova catena leggera delle immunoglobuline, consentendo alla cellula di esprimere un recettore diverso. Se il processo di editing non va a buon fine su entrambi i cromosomi, allora i linfociti B immaturi possono tentare di riarrangiare la catena leggera lambda prima su un cromosoma, e se non riesce neanche in questo allora provano sul secondo cromosoma. Se questo processo non riesce in nessuno dei due cromosomi, allora i linfociti B immaturi sono indotti a morire per apoptosi, attraverso un processo noto come selezione negativa. Dunque, sia l’editing recettoriale che la selezione negativa sono responsabili del mantenimento della tolleranza dei linfociti B verso gli antigeni self presenti nel midollo osseo. Una volta avvenuta la maturazione, però, nessuno dei due processi menzionati può avere luogo, vengono stimolate invece la proliferazione e la differenziazione dei linfociti B, cosicché questi poi possano generale la risposta adattativa umorale. Sviluppo dei linfociti T La maturazione dei linfociti T a partire da progenitori specifici segue fasi consecutive che consistono nel riarrangiamento e nell'espressione dei geni del TCR, nella proliferazione cellulare, nella selezione indotta dall'antigene e nell'acquisizione di capacità funzionali. I linfociti T originano da precursori che nascono nel fegato fetale e nel midollo osseo e poi migrano al timo. Le cellule in via di sviluppo nel timo sono chiamate timociti e quelli più immaturi non esprimono il TCR o i corecettori CD4 e CD8. Dalla midollare queste cellule migrano nella corteccia del timo dove esprimono per la prima volta i TCR e che le cellule T iniziano a maturare in linfociti T CD4+ MHCII- ristretti oppure CD8+ MCHI-ristretti. L'ambiente timico fornisce gli stimoli necessari per la proliferazione e la maturazione dei timociti. All'interno della corticale, le cellule epiteliali formano un reticolo di lunghi prolungamenti citoplasmatici attorno al quale devono passare i timociti per raggiungere la midollare. Per la maturazione dei linfociti T sono importanti due tipi di molecole prodotte dalle cellule timiche non linfoidi. Le prime sono le molecole MCH di classe I e II, espresse dalle cellule epiteliali e dendritiche del timo. L'interazione dei timociti in corso di maturazione con le molecole MHC all'interno del timo è essenziale per la selezione del repertorio dei linfociti T 81 maturi. Inoltre, altre cellule liberano citochine e chemochine che, rispettivamente, stimolano la proliferazione dei linfociti T immaturi e controllano il passaggio dalla corticale alla midollare dei timociti in sviluppo. Il grado di proliferazione e di apoptosi dei linfociti T immaturi nella corticale è molto alto. Un singolo precursore dà origine ad un'ampia progenie, di cui il 95% muore per apoptosi prima di raggiungere la midollare. La morte cellulare è dovuta alla combinazione dell'incapacità di riarrangiare correttamente il gene della catena del TCR e quindi di superare il controllo della selezione del preTCR/catena, e di superare la selezione positiva indotta dalle molecole MHC e la selezione negativa indotta dagli antigeni self. La maturazione del linfocita T procede attraverso una serie di tappe sequenziali caratterizzate dal riarrangiamento dei geni TCR insieme ai corecettori CD4 e CD8. Nel timo umano fetale, l'espressione del recettore delle cellule T comincia circa alla nona settimana di gestazione ed è seguita dall'espressione del TCR alla decima settimana. I timociti corticali più immaturi, appena giunti dal midollo osseo contengono i geni del TCR nel loro assetto germinativo e non esprimono TCR, CD3, la catena, CD4 o CD8; queste cellule sono chiamate timociti doppio-negativi Questa fase di maturazione è anche nota come stadio pro- T. La maggioranza dei timociti doppio-negativi (90%) darà origine a linfociti T CD4+ e CD8+ MHC- ristretti esprimenti TCR. Le proteine Rag-1 e Rag-2 sono espresse precocemente in questo stadio e sono necessarie per il riarrangiamento dei geni del TCR. Il riarrangiamento D-J al locus della catena del TCR si verifica per primo e implica o l'unione del segmento genico D1 a uno dei 6 segmenti J1 o l'unione del segmento D2 a uno dei 6 segmenti J2. I riarrangiamenti da V a DJ avvengono durante la transizione dallo stadio pro-T a quello successivo pre-T, durante lo sviluppo delle cellule T. Se in una determinata cellula pro-T avviene un riarrangiamento corretto del gene della catena del TCR, la catena proteica è allora espressa sulla superficie delle cellule T in associazione a una proteina invariante chiamata pre-T insieme al CD3 e la catena, a formare il recettore pre-T. La funzione del complesso pre-TCR nello sviluppo del linfocita T è simile a quella del pre-BCR contenente la catena leggera sostitutiva nello sviluppo del linfocita B. Segnali provenienti dal pre-TCR mediano la sopravvivenza delle cellule pre-T e contribuiscono alla grandissima espansione proliferativa che avviene durante lo sviluppo di queste cellule. I segnali provenienti dal TCR fanno inoltre iniziare la ricombinazione del locus della catena e guidano il passaggio dallo stadio doppionegativo a doppio positivo dello sviluppo dei timociti. Questi segnali inibiscono ulteriori riarrangiamenti del locus della catena, limitando l'accesso dell'altro allele al meccanismo della ricombinazione. Questo porta all'esclusione allelica della catena (cioè i linfociti T maturi esprimono solo uno dei due alleli della catena ereditati). Allo stadio successivo della maturazione, i timociti esprimono sia CD4 che CD8 e sono detti timociti doppio-positivi. Il riarrangiamento dei geni della catena del TCR e l'espressione di eterodimeri si verificano nella popolazione CD4+CD8+ doppio-positiva subito prima o durante la migrazione dalla corticale alla midollare, quando l'espressione tardiva del gene Rag nello stadio pre-T promuove la ricombinazione del gene. Una volta iniziato il riarrangiamento della catena, esso procede fino a quando l'espressione dei geni Rag-1 e Rag-2 è interrotta da segnali provenienti dal TCR nel corso della selezione positiva. Gli stadi del riarrangiamento del gene della catena sono molto simili a quelli della catena; poiché vi sono segmenti D nel locus del TCR, il riarrangiamento consiste unicamente nell'unione dei segmenti V e J. Comunque, l'espressione del gene TCR nello stadio doppio-positivo porta alla formazione del TCR completo, che è espresso sulla superficie cellulare in associazione con il CD3 e la catena. Le cellule che vanno incontro con successo a questi processi selettivi proseguono maturando in linfociti T CD4+ o CD8+, detti timociti singolo-positivi. Le cellule CD4+ acquisiscono la capacità di produrre citochine in risposta a successive stimolazioni antigeniche e di esprimere molecole effettrici (come il ligando del CD40) che “aiutano” i linfociti B e i macrofagi, mentre le cellule CD8+ diventano capaci di produrre molecole ad attività citotossica. I timociti maturi singolo positivi entrano nella midollare del timo e quindi lasciano il timo per popolare i tessuti linfoidi secondari. La selezione dei linfociti T in via di maturazione dipende dal 82 riconoscimento di antigeni (complessi peptideMHC) nel timo ed è responsabile della conservazione delle cellule utili e dell'eliminazione di quelle potenzialmente dannose. Il repertorio immaturo dei linfociti T consiste in cellule i cui recettori possono riconoscere qualsiasi antigene peptidico (self o estraneo) presentato da qualsiasi molecola MHC. In ogni individuo, le cellule T che riconoscono antigeni self con elevata avidità sono potenzialmente pericolose in quanto tale riconoscimento può scatenare risposte autoimmuni. I processi di selezione agiscono sul repertorio dei linfociti T immaturi in modo da assicurare che solo le cellule utili completino il processo di maturazione. Quando i timociti doppio-positivi iniziano ad esprimere TCR, questi recettori incontrano peptidi self (i soli peptidi di norma presenti nel timo) presentati da molecole MHC self. La selezione positiva, a questo punto, è il processo attraverso cui i timociti i cui TCR si legano con bassa avidità (cioè debolmente) ai complessi peptide-MHC self sono stimolati a sopravvivere. I timociti i cui recettori non riconoscono le molecole MHC self vengono eliminati per morte apoptotica. Questo assicura che i linfociti T che maturano siano ristretti per MHC self. La selezione positiva fissa anche la restrizione dell'MHC di classe I o classe II delle sottopopolazioni di cellule T, assicurando che i linfociti T CD8+ siano specifici per i peptidi presentati da molecole MHC di classe I e i linfociti T CD4+ per peptidi associati alla classe II. La selezione negativa, invece, è il processo attraverso cui i timociti, i cui TCR si legano fortemente agli antigeni peptidici self in associazione a molecole MHC self, vengano eliminati. Subset dei linfociti CD4 All’interno dei linfociti CD4 esistono vari sottotipi perché nella specificità che è caratteristica del sistema immunitario. dell’immunità acquisita, si è andati incontro ad un’ulteriore specificità di risposta; è chiaro che per eliminare dei patogeni extracellulari servono anticorpi; per eliminare i patogeni intracellulare (per es. virus alcuni protozoi), serve una risposta cellulare che elimini le cellule infettate da quei patogeni intracellulari, non servono anticorpi o servono solo in minima parte; e per eliminare per esempio elminti, che sono patogeni molto grandi e che non possono essere eliminati dai linfociti CD8 citotossici che servono per i patogeni intracellulari, seve un’ulteriore specificità di risposta dell’immunità acquisita: è questo il motivo per cui le cellule CD4, si sono ulteriormente specializzate in vari subset. (“TEORICAMENTE, non scrivetelo”: Quindi avremo un subset di linfociti CD4 che servirà a grandi linee per patogeni intracellulari, ovvero se c’è un patogeno intracellulare virus o protozoo (per es. Leishmania), voglio una risposta di un linfocita CD4 specializzato per questo; questi in particolare si chiamano: linfociti CD4 Th1 (T helper 1). Se avrò necessità di una risposta del sistema immunitario. dell’immunità acquisita verso elminti, dove non serve la riposta intracellulare, verrà attivato un altro subset di linfociti Th, i linfociti CD4 Th2 che sono in grado di attivare delle risposte mediate da citochine, che vano ad attivare gli eosinofili che fanno parte del sistema immunitario. dell’immunità innata e che sono cellule in grado di eliminare dei patogeni extracellulari grandi come per esempio gli elminti. L’attivazione di queste cellule Th2 permetterà inoltre la liberazione dai basofili di amine vasoattive che determinerà un aumento della peristalsi intestinale che permetterà o tenterà l’eliminazione dell’elminta. Quindi c’è un’ulteriore specializzazione all’interno dei linfociti CD4 T helper, a secondo della funzione che devono mediare. Per i patogeni intracellulari ci penserà il Th1 che metterà in atto, attraverso l’attivazione di alcune citochine, una risposta citotossica di distruzione di una cellula infetta mediata da un lato dai linfociti CD8 citotossici, dall’altro dall’attivazione di cellule dell’immunità innata (abbiamo detto che per avere un senso il mantenimento dei due sistemi, ci deve essere una cooperazione tra loro; quindi, è chiaro che una volta che il sistema immunitario. dell’immunità acquisita viene attivato con dispendio energetico, ha senso che una volta attivato coordina l’attivazione sia del sistema 85 citochine che inducono l'attivazione (help) dei macrofagi allo scopo di eliminare i microrganismi fagocitati. Invece, i linfociti T CD8+ citotossici (CTL) svolgono una funzione effettrice che mira ad eliminare le cellule infettate da patogeni e cellule tumorali che esprimono antigeni associati all'MHC di classe I. I linfociti T di memoria rispondono successivamente a un successivo incontro con l'antigene differenziandosi in cellule effettrici che eliminano gli antigeni. Le risposte T scemano a man mano che l'antigene viene eliminato dalle cellule effettrici. Questo declino è importante per ripristinare la condizione di riposo del sistema immunitario (od omeostasi). La risposta T termina principalmente a causa della morte per apoptosi dei linfociti T attivati. Questo è dovuto al fatto che l'eliminazione dell'antigene significa deprivazione dello stimolo di sopravvivenza, costituito dall'antigene stesso e dalle molecole costimolatorie e dalle citochine prodotte durante l'infiammazione. La differenziazione dei linfociti T CD4+ naïve in cellule effettrici delle risposte cellulari richiede il riconoscimento dell'antigene e la presenza di segnali costimolatori. L'attivazione iniziale richiede che i linfociti T CD4+ naïve e gli antigeni si localizzino contemporaneamente nello stesso tessuto linfoide. Questa situazione può avvenire grazie al processo di Ricircolazione; infatti, i linfociti T naïve migrano dal sangue negli organi linfoidi, da un organo linfoide a un altro e nuovamente nel sangue fino a quando incontrano l'antigene per cui sono specifici. Le cellule dendritiche, invece, una volta arrivate ai linfonodi, presentano ai linfociti T CD4+ naïve i peptidi generati a partire dalle proteine antigeniche che sono state endocitate; questi peptidi sono presentati in associazione alle molecole MHC di classe II. Le risposte dei linfociti T CD4+ sono attivate da antigeni proteici di microbi extracellulari che vengono ingeriti dalle cellule dendritiche o, nel caso delle vaccinazioni, da antigeni solubili che sono stati somministrati in associazione a sostanze adiuvanti e vengono catturati dalle cellule dendritiche. Oltre a presentare gli antigeni, queste cellule, in seguito al riconoscimento delle strutture microbiche, esprimono elevati livelli di molecole costimolatorie, come le proteine B7-1 e B7-2, che forniscono il secondo segnale necessario per l'attivazione ai linfociti T e producono citochine che stimolano la differenziazione, come l'interleuchina-2 (IL-2). La proliferazione dei linfociti T in seguito al riconoscimento dell'antigene è dovuta principalmente a un circuito autocrino in cui i linfociti T che si sono attivati producono il proprio fattore di crescita ed esprimono in membrana il relativo recettore. Il principale fattore di crescita autocrino per i linfociti T è IL-2. Il risultato della proliferazione dei linfociti T naïve è l'espansione clonale, che, a partire da un piccolo numero di linfociti specifici, genera le grandi quantità di cellule necessarie per l'eliminazione dell'antigene. Alcuni linfociti T che si sono espansi si differenziano in cellule effettrici, mentre altri andranno a costituire le cellule della memoria, cellule che sopravvivono a lungo e hanno il compito di rispondere rapidamente a una successiva stimolazione da parte dello stesso antigene. Le cellule CD4+ effettrici sono caratterizzate dalla capacità di esprimere molecole che attivano altre cellule (linfociti B, macrofagi e cellule dendritiche) e di produrre citochine che sono coinvolte nelle funzioni dei linfociti T stessi e hanno svariate attività biologiche. Mentre i linfociti T CD4+ naïve attivati producono principalmente IL-2. Anche l'attivazione dei linfociti T CD8+ naïve avviene in seguito al riconoscimento dell'antigene e dei secondi segnali, ma la natura di quest'ultimi differisce da quelli dei linfociti T CD4+. Per proliferare e differenziarsi in cellule CTL effettrici, i linfociti T CD8+ naïve devono riconoscere peptidi antigenici presentati su molecole MHC di classe I oltre che le molecole costimolatorie espresse sulle APC. Le risposte di queste cellule sono stimolate dagli antigeni microbici presenti nel citoplasma di cellule infettate e che vengono presentati in membrana in associazione a molecole MHC di classe I. I microrganismi che generalmente producono antigeni intracellulari sono i virus. Le cellule dendritiche sono dotate della particolare capacità di catturare e ingerire cellule infettate da virus o cellule tumorali e di presentare gli antigeni ai linfociti T CD8+ naïve. In questo modo gli antigeni ingeriti vengono trasportati dalle vescicole endocitiche al citosol, da cui i 86 peptidi possono avere accesso alla via di presentazione in classe I. Questo processo viene definito cross-presentazione, per indicare che una certa cellula (la cellula dendritica) può presentare antigeni che derivano da un'altra cellula (la cellula infettata dal virus o la cellula tumorale) e innescare o attivare, linfociti T specifici per questi antigeni. Comunque, l'attivazione completa dei linfociti T CD8+ naïve e la loro differenziazione in CTL funzionanti è facilitata dall'azione dei linfociti T CD4+ helper. In altre parole, i linfociti T helper forniscono il “secondo segnale” alle cellule CD8+. Però nel caso di una forte risposta innata o nel caso in cui la cross-presentazione degli antigeni microbici sia particolarmente efficiente, il coinvolgimento dei linfociti T CD4+ può essere superfluo. Invece, nel caso di infezioni virali latenti, organi trapiantati e tumori, tutte condizioni che provocano una blanda attività dell'immunità innata, l'interazione con le cellule T CD4+ è indispensabile. I linfociti T helper stimolati esprimono la proteina chiamata ligando di CD40, che appartiene alla famiglia del TFN. Questa proteina viene riconosciuta da CD40 espresso sulla membrana delle APC e tale interazione rende le APC più efficienti nell'indurre la differenziazione dei linfociti CD8+. Successivamente al riconoscimento dell'antigene, il numero dei linfociti T CD8+ specifici può aumentare fino a 1 ogni 10 linfociti; in questo processo di espansione clonale molte citochine possono agire come fattori di crescita, tra le quali IL-12, IL-15 e IL-17. La differenziazione di queste cellule in cellule CTL effettrici comporta l'acquisizione degli strumenti necessari per uccidere le cellule bersaglio. L'aspetto più caratteristico dei CTL è costituito dallo sviluppo di granuli citoplasmatici legati alla membrana che contengono proteine, tra cui la perforina e i granzimi, dotati di attività citotossica. Inoltre, i CTL differenziati sono in grado di produrre citochine, tra cui INF- e TNF, che attivano le cellule fagocitiche e promuovono la risposta infiammatoria. 87 Capitolo 9 ATTIVAZIONE DEI LINFOCITI T il processo di attivazione dei linfociti T genera, a partire da linfociti T naive, un grande numero di cellule effettrici che sono dotate della stessa specificità nei confronti di un antigene. Inoltre, si generano anche cellule della memoria che sono più reattive al successivo incontro dello stesso microbo. In ogni caso, sia l’attivazione dei linfociti T naive che quella delle cellule effettrici dipende dal riconoscimento da parte del TCR, ovvero il recettore espresso dai linfociti T, dell’antigene che gli viene presentato dalle APC. I linfociti T naive si muovono all’interno degli organi linfoidi interagendo in maniera casuale con molte DC e si fermano solo quando riconoscono l’antigene specifico per il loro recettore. Una delle caratteristiche delle DC è che queste cellule presentano molteplici antogeni ai linfociti T, ma una volta avvenuto il riconoscimento di quello specifico allora si generano una seri di segnali che determinano l’arresto dei linfociti T, permettendo così la stabilizzazione del contatto tra APC e linfociti T. Il riconoscimento dell’antigene, poi, attiva una serie di risposte nei linfociti T, quali la secrezione di citochine, la proliferazione dei cloni antigene-specifici (espansione clonale) e il differenziamento dei linfociti T naive in cellule effettrici e della memoria. Sia le APC che i linfociti T vanno ad esprimere molecole volte a garantire il processo di proliferazione e differenziamento dei linfociti T naive che si attivano. In particolare, i linfociti T agiscono mediante un processo di feedback negativo e positivo, così da modulare la risposta. Infatti, i linfociti T agiscono mediante un feedback positivo che consiste nell’inviare segnali alle APC le quali poi porteranno ad una maggiore stimolazione dei linfociti T; allo stesso tempo, però, i linfociti T agiscono mediante un processo di feedback negativo, producendo molecole che impediscono che l’attivazione sia eccessiva. I linfociti T naive circolano negli organi linfoidi secondari, mentre le cellule T effettrici possono migrare nei tessuti che sono sede di infezione o sono infiammati. In questi tessuti, queste cellule effettrici incontrano nuovamente l’antigene e mettono in atto le risposte necessarie per la sua eliminazione. I linfociti T effettori CD4 secernano citochine ed esprimono molecole di membrana che possono stimolare altre cellule del sistema immunitario. Infatti, i linfociti T CD4 possono promuovere l’eliminazione dei microorganismi fagocitati dai macrofagi, possono produrre citochine che reclutano altre cellule come i neutrofili, possono rimanere negli organi linfoidi ed aiutare i linfociti B a differenziarsi in plasmacellule che produrranno gli anticorpi. Le cellule T CD8, invece, hanno effetto citotossico, in quanto determinano l’uccisione diretta delle cellule infettate dai microrganismi e delle cellule neoplastiche. Le risposte delle cellule T si esauriscono nel momento in cui l’antigene viene eliminato cosicché il sistema immunitario possa tornare in una situazione di equilibrio e queste determina che i linfociti T effettori, senza il segnale dell’antigene che è stato ormai eradicato, non riescono a sopravvivere e vanno incontro ad apoptosi. Segnali che attivano i linfociti T Affinché vengano attivati i linfociti T sono necessari dei segnali, in particolare un primo segnale ed un secondo segnale. Il primo segnale è rappresentato dal riconoscimento dell’antigene, mentre il secondo segnale è dato da molecole costimolatorie. Dunque, il primo segnale è rappresentato dagli antigeni proteici che si complessano, sottoforma di piccoli peptidi, con le molecole MHC di classe I (per i linfociti T CD8) e di classe II (per i linfociti T CD4). 90 • CD25: è meglio nota come IL-2Rα ed è una delle catene del recettore dell’IL-2. • CD40L: viene espressa dopo 24-48 ore dal riconoscimento dell’antigene da parte dei linfociti. Questa molecola permette ai linfociti di esercitare le proprie funzioni effettrici, ed inoltre attiva le cellule APC, così da renderle più efficaci. Infatti, questo costituisce un meccanismo di feedback positivo di amplificazione delle risposte T. • CTLA-4: espresso dopo 24-48 ore dall’attivazione dei linfociti (cioè dal riconoscimento dell’antigene). • Molecole di adesione e recettori per le chemochine: i linfociti T riducono l’espressione di molecole che ne permettono l’ingresso negli organi linfoidi e, invece, aumentano l’espressione delle molecole necessarie per la loro migrazione nei siti periferici sedi di infezioni e di danno tissutale. L’attivazione determina anche l’espressione di CD44 che è il recettore per l’acido ialuronico il quale contribuisce a trattenere i linfociti T effettori nei tessuti sede di infezione o di danno cellulare. IL-2 Le citochine svolgono un ruolo fondamentale nell’immunità adattativa, ed una di queste è IL-2. IL-2 è, infatti, un importantissimo fattore di crescita che garantisce la sopravvivenza e il differenziamento dei linfociti T. Questa citochina fu chiamata inizialmente TCGF proprio per il suo ruolo di fattore di crescita dei linfociti T. Essa agisce in maniera autocrina o paracrina, ed è prodotta principalmente dai linfociti T CD4 dopo che questi hanno riconosciuto l’antigene e sono intervenute le molecole costimolatorie. La produzione di IL-2 comincia entro 1-2 ore dal riconoscimento dell’antigene, e raggiunge il picco 8-12 ore, per poi esaurirsi entro 24 ore. I linfociti T CD4 rilasciano l’IL-2 nella sinapsi immunologica, dove sono presenti anche le APC e dove è presente il recettore che lega questa citochina. L’IL-2 è secreta sottoforma di glicoproteina globulare contenente 4 alfa eliche, e si lega al recettore con un’affinità molto elevata. Il recettore per IL-2 è espresso in maniera transitoria sulla superficie dei linfociti T naive ed attivati, mentre è sempre espresso sulla superficie dei linfociti T regolatori. Il recettore per Il-2 è costituito da tre proteine che sono legate in maniera non covalente, e queste proteine sono: • IL-2Rα: specifica per questa citochina • IL-2/15Rβ: che costituisce anche la catena per il recettore dell’IL-15 • Catena comune gamma: condivisa con altre citochine per questo è definita comune. I linfociti T non attivati esprimono bassi livelli di IL2-R (recettore IL-2) che in questo caso si trova sotto forma dimerica, infatti è costituito solo dalla catena beta e da quella gamma. L’espressione di IL-2Ralfa aumenta in seguito all’attivazione dei linfociti T CD4 e CD8 naive. In questo caso, la catena alfa si associa a quella beta e gamma, andando a costituire il complesso recettoriale completo che si lega all’IL-2 con un’affinità elevatissima. Conseguentemente a ciò, i linfociti T attivati sono stimolati da concentrazioni più basse di Il-2. Poiché sia la produzione di IL-2 che quella di IL-2Ralfa sono attivate in seguito al riconoscimento dell’antigene, i linfociti che sono stati attivati dall’antigene sono avvantaggiati e proliferano più efficientemente in risposta a Il-2 rispetto a quelli che non hanno riconosciuto l’antigene. Inoltre, IL-2 prodotta in risposta all’antigene stimola l’espressione del suo recettore, innescando un feedback positivo con il quale la risposta dei linfociti T si autoamplifica. I linfociti T regolatori esprimono sempre il complesso trimerico del recettore per IL-2, e a seguito di stimolazione continuata si osserva il distacco di IL-2Ralfa dalla membrana cellulare e l’aumento della concentrazione sierica di Il-2Ralfa che costituisce un marker di stimolazione potente e continuata, utile contro il rigetto acuto di un trapianto d’organo. 91 Funzioni dell’IL-2 Questa citochina possiede svariate funzioni: • Stimola la sopravvivenza, la proliferazione e il differenziamento dei linfociti attivati dall’antigene. Infatti, stimola l’espressione della proteina antiapoptotica Bcl-2, stimola la progressione del ciclo cellulare tramite l’attivazione del complesso mTOR il quale, a sua volta, causa la sintesi delle cicline e la degradazione di p27 che, invece, ha il compito di inibire il ciclo cellulare. Inoltre, IL-2 aumenta anche la produzione di interferone gamma e IL-4 da parte dei linfociti T. • È necessaria per la sopravvivenza e il funzionamento dei linfociti T regolatori, i quali sopprimono le risposte immunitarie contro gli antigeni self. Inoltre, poiché i linfociti T regolatori non producono abbastanza IL-2, la loro sopravvivenza dipender dalla produzione di questa citochina da parte dei linfociti T attivati dagli antigeni. • Stimola la proliferazione ed il differenziamento delle cellule NK e dei linfociti B. Espansione clonale dei linfociti T Come già detto, la proliferazione dei linfociti T dipende da segnali che vengono generati dal recettore per l’antigene, dalle molecole costimolatorie e dai. Fattori di crescita, soprattutto Il-2. Tutti questi fenomeni porteranno all’espansione clonale dove da una piccola quantità di linfociti antigene-specifici vengono generati grandissime quantità di linfociti che sono in grado di eliminare l’antigene. Inoltre, i linfociti T che non sono specifici per quell’antigene non proliferano. Una parte della progenie dei linfociti T stimolati dall’antigene si differenzia, però, in cellule effettrici. I linfociti T CD4 effettori eliminano l’antigene attraverso l’espressione in membrana di nuove molecole e la secrezione di citochine in grado di attivare altre cellule. L’attivazione dei linfociti T CD4 naive causa la secrezione di IL-2, mentre quella dei linfociti effettori porta alla produzione di una grande varietà di citochine. Linfociti T della memoria Le risposte dei linfociti T sono accompagnate dalla generazione di linfociti T della memoria che sono in grado di sopravvivere per diversi anni e, in alcuni casi, anche per tutta la vita. La funzione dei linfociti T della memoria è quella di generare risposte più veloci ed efficaci nei confronti di un microbo che è stato già incontrato, e questo spiega anche il successo delle vaccinazioni. I linfociti della memoria possono originare dalle cellule effettrici secondo una via di sviluppo lineare, oppure seguire un differenziamento divergete rispetto a quello della popolazione effettrice e, in questo caso, le popolazioni effettrici e della memoria rappresentano due vie parallele di attivazione. Non è ancora chiaro cosa porta alla genesi di cellule effettrici o cellule della memoria, ma si pensa che un ruolo importante ce l’abbiano i fattori di trascrizione. Infatti, il fattore di trascrizione Blimp-1, che viene attivato in seguito al riconoscimento dell’antigene da parte del linfocita, spinge le cellule effettrici a differenziarsi in cellule della memoria. Invece, il fattore di trascrizione T-bet favorisce il differenziamento dei linfociti T CD4 e Cd8 in cellule effettrici. Generalmente, dopo che l’antigene vinee eliminato, i linfociti della memoria sopravvivono in uno stato quiescente, ma sono pronte a generare risposte veloci ed efficaci nel caso in cui il microbo dovesse ripresentarsi. I linfociti T naive vivono solo per settimane o mesi, per poi essere rimpiazzati da altri linfociti T naive che si sviluppano nel timo. Questo però non avviene el caso delle cellule della memoria che, infatti, sopravvivono anche per molti anni grazie al fatto che producono molecole antiapoptiche, come Bcl-2 e Bcl-XL, le quali permettono ai linfociti della memoria di sopravvivere anche quando 92 viene eliminato l’antigene. Infatti, dopo che l’antigene è stato eliminato si disattiva la risposta immunitaria, in modo tale da mantenere l’omeostasi del sistema immunitario. Questo avviene perché quando l’antigene è eliminato allora cessano di esistere anche tutti i segnali da esse generati, ovvero la costimolazione ed il livello di Il-2 che si abbassano notevolmente, diminuendo perciò anche l’espressione delle proteine antiapoptotiche. Infatti, questa cascata induce uno stress cellulare che condurrà i linfociti, inevitabilmente, all’apoptosi, ad eccezione delle cellule della memoria per i motivi sopra esposti. Un’altra differenza tra cellule naive e della memoria è che le prime impiegano dai 5 ai 7 giorni per differenziarsi, mentre le seconde solo 1-3 giorni. Questo è dovuto probabilmente a particolari conformazioni che la cromatina delle cellule della memoria assume, rendendo accessibili i loci de geni che codificano le citochine e le altre molecole effettrici. Inoltre, il numero dei linfociti T naive rispetto a quello delle cellule della memoria è minore e con l’aumentare dell’età il numero dei linfociti T naive diminuisce, mentre quello delle cellule della memoria aumenta. I linfociti T della memoria sono meno dipendenti dalla costimolazione riaspetto alle cellule naive, e. ciò consente alle cellule della memoria presenti nei tessuti periferici di rispondere agli antigeni presentati da tipi diversi di APC; al contrario, i linfociti T naive sono attivati solo in seguito alla presentazione dell’antigene da parte di cellule detritiche mature a livello degli organi linfoidi. Infine, la sopravvivenza dei linfociti della memoria dipende dall’espressione di un recettore che lega IL-7 e Il-15 (espressa dai linfociti T CD8 della memoria). I marcatori di superficie per identificare i linfociti T della memoria sono il recettore per l’Il-7 e la molecola Cd27, oltre che marcatori che qui dovrebbero essere assenti perché peculiari di altre cellule. Inoltre, i linfociti della memoria esprimono CD45RO, a differenza dei linfociti T naive che, invece, esprimono CD45RA. I linfociti T CD4 e CD8 della memoria sono eterogenei e possono essere suddivisi in diverse popolazioni. I linfociti T della memoria centrale esprimono il recettore CCR7 e la molecola di adesione L-selectina, grazie ai quali si trovano per lo più a livello linfonodale. Essi possiedono limitate capacità differenziativa, ma proliferano attivamente inseguito alla stimolazione da parte dell’antigene, dando origine ad un elevato numero di linfociti effettori. I linfociti T della memoria effettrice, invece, non esprimono né CCR7 né L-selectina, e si localizzano nei tessuti periferici, soprattutto nelle mucose. L’attivazione di queste cellule da parte dell’antigene provoca il rilascio di interferone gamma o, in alternativa, l’assunzione immediata di un profilo citotossico. La ridotta proliferazione di questa popolazione effettrice spiega come essa possa non essere sufficiente per la completa eradicazione dell’infezione in assenza della proliferazione dei linfociti T della memoria centrale, che porta alla rapida generazione di una grande quantità di cellule effettrici. Alcuni linfociti T della memoria, infine, migrano in tessuti non linfoidi e in quelle sedi sopravvivono per un lungo periodo di tempo. Le cellule della memoria localizzate nei tessuti sono responsabili della rapida risposta che si osserva nei tessuti in caso di infezione. Queste cellule esprimono elevati livelli di CD69 e, come conseguenza, i linfociti T della memoria non sono suscettibili alle alte concentrazioni di S1P presenti nel sangue e nei linfonodi, per cui questa caratteristica faciliterà la loro localizzazione nei tessuti. Infine, i linfociti della memoria sono eterogenei anche dal punto di vista delle citochine che producono. 95 Linfociti TH1 Sono la principale popolazione di cellule T effettrici coinvolte nella difesa dell’ospite che viene colpito da microbi che verranno poi ingeriti dai fagociti. Infatti, il differenziamento dei linfociti T CD4 naive in linfociti TH1 avviene in risposta a microbi intracellulari che attivano le DC e i macrofagi, i quali porteranno alla produzione di IL-12 e INF-gamma che sono essenziali per il differenziamento di questi linfociti. Anche IL-18, processata insieme alla potente IL-12, partecipa al processo differenziativo. Inoltre, L’INF non solo permette il differenziamento di questi linfociti, ma è anche in grado di inibire il differenziamento dei linfociti T naive in TH2 e in TH17. Un’altra funzione dell’INF-gamma è quella di agire sui macrofagi e sulle DC aumentano la secrezione di IL-12. Quando i linfociti T legano, con la molecola CD40L, il recettore CD40 espresso dalle APC, sono in grado di potenziare la produzione di citochine da parte delle DC e dei macrofagi. In generale, però, il differenziamento dei linfociti T naive in TH1 dipende dall’attivazione di fattori di trascrizione, quali STAT-1, STAT-4 e T-Bet. Saranno proprio l’IL-12 e l’INF-gamma a portare all’espressione di questi fattori di trascrizione. Infatti, quando i linfociti T naive riconoscono l’antigene e viene prodotto INF-gamma, allora si attiva il fattore di trascrizione T-Bet. L’INF di tipo uno, però, porterà anche all’attivazione di STAT-1 il quale attiva ulteriormente T-Bet. T-bet, a sua volta, indurrà in maniera diretta ed indiretta la produzione di INF-gamma che, ancora una volta, stimola T-Bet che stimolerà la produzione di altro INF-gamma, innescando un processo di amplificazione. Anche l’IL-12, quando si lega a recettori espressi dai linfociti T CD4 attivati dal riconoscimento dell’antigene, induce l’espressione di STAT-4 che, a sua volta, aumenterà ulteriormente la produzione di INF-gamma. L’azione principale dei TH1 è quella di indurre i macrofagi alla fagocitosi dei microbi, e questa può essere svolta grazie all’INF-gamma che viene prodotto nel momento in cui il recettore del linfocita T riconosce gli antigeni. Inoltre, la produzione di INF-gamma può essere ulteriormente stimolata da IL-12 e IL-18. I linfociti T CD4 non sono le uniche cellule in grado di produrre interferone gamma, infatti, altre cellule come NK, o i CTL sono in grado di produrlo, seppur con scopi differenti. L’INF-gamma appartiene alla famiglia delle citochine di tipo II, e viene anche definito interferone immunitario o di tipo due. Esso è composto da due catene polipeptidiche omologhe che appartengono alla famiglia delle citochine di secondo tipo, e si lega ad un recettore costituito da due catene, IFNgammaR1 e IFNgammaR2, che al momento del legame con l’interferone immunitario si dimerizzano e portano all’attivazione di JAK1 e JAK2. Questi ultimi, poi, attiveranno STAT1 che induce la trascrizione dei geni che codificheranno per diverse proteine che svolgono molte attività biologiche. L’interferone gamma ha diverse funzioni: • Attiva i macrofagi potenziandone l’attività microbicida, fenomeno definito attivazione della via classica dei macrofagi. • Promuove la differenziazione dei linfociti T CD4 in TH1, inibendo il differenziamento in senso TH2 e TH17. • Stimola l’espressione di diverse proteine, come MHC, molecole costimolatorie B7 che sono necessarie per la presentazione dell’antigene da parte delle APC. • Agisce sui linfociti B promuovendo lo scambio isotipico verso alcune classi di IgG, inibendo al tempo stesso lo scambio verso altri isotipi. Dunque, favorisce l’opsonizzazione dei 96 microbi che devono essere fagocitati, ma in questo caso la fonte di attivazione di INF- gamma è TFH. I linfociti TH1, oltre a produrre INF-gamma, producono anche altre molecole come TNF e chemochine che contribuiscono al reclutamento dei leucociti per innescare il processo infiammatorio. I linfociti TH1 attivano i macrofagi mediante una via di attivazione definita classica, e i macrofagi attivati sono definiti M1. L’attivazione dei macrofagi è dovuta alla produzione di interferone gamma e al legame di CD40L, espressa dai linfociti, con CD40 che è espressa, invece, dai macrofagi. L’interazione di queste molecole e la liberazione di interferone gamma, indotta dal riconoscimento dell’antigene da parte del recettore, attivano i fattori di trascrizione NF-kB e AP1, nel primo caso, e il fattore STAT1 nel secondo caso. Questi fattori di trascrizione agiranno a livello dei fagolisosomi, inducendo la liberazione di enzimi come l’ossido nitrico sintasi inducibile (iNOS) e dell’ossidasi fagocitica che porteranno alla produzione diossido nitrico e ROS, molecole utilizzate dai macrofagi per uccidere i microrganismi che vengono fagocitati al loro interno. Tuttavia, queste molecole microbicide possono essere rilasciate all’esterno avendo, così, un’azione distruttiva sia nei confronti dei microrganismi extracellulari che del tessuto. Mutazioni a carica di CD40L causano la sindrome da iper-IgM legata al cromosoma X, e i soggetti che ne sono affetti sono sensibili alle infezioni microbiche che necessitano per l‘eradicazione l’attivazione dei macrofagi da parte dei linfociti T. Inoltre, questi pazienti presentano anomalie anche nella produzione di classi di anticorpi che dipendono dalla cooperazione con i linfociti T. Inoltre, i macrofagi attivati da questi linfociti TH1 stimolano l’infiammazione attraverso la produzione di diverse molecole come TNF, e altre chemochine, la cui azione principale è anche quella di potenziare il reclutamento dei monociti per favorire l’eliminazione dei patogeni, di potenziare l’azione di APC dei macrofagi e delle MHC di seconda classe e, infine, la differenziazione dei linfociti T in cellule effettrici. Linfociti TH2 Questi linfociti sono responsabili delle strategie di difesa che si fondano sull’azione degli eosinofili e dei mastociti, importanti per l’eradicazione delle infezioni elmintiche. Gli elminti, infatti, sono molecole troppo grosse e resistenti per essere fagocitate dai macrofagi, per questo motivo l’azione di questi linfociti è essenziale e dipenderà dall’azione di diverse citochine. Infatti, la differenziazione in TH2 avviene in risposta agli allergeni, agli elminti e alla IL-4, oltre che da IL-25, IL-33 e TSLP prodotta da cellule epiteliali e cellule danneggiate. In particolare, l’IL-4 stimola l’attivazione dei linfociti TH2 attivando il fattore di trascrizione STAT6 che, a sua volta, attiverà GATA-3 che stimola l’espressione dei geni che codificano per le diverse citochine. Inoltre, i linfociti TH2 promuovono il riparo dei tessuti e la stimolazione nella produzione di IgE da parte di linfociti B. Interleuchina 4 È la principale citochina dei linfociti TH2 e ha un ruolo sia nella generazione di questi linfociti sia nella loro funzione. Questa citochina appartiene alla famiglia delle citochine di primo tipo e, infatti, possiede quattro domini alfa elica. Le principali cellule che la producono sono i TH2, i mastociti attivati ed altre cellule tissutali. Il recettore dell’IL-4 è caratterizzato dall’unione della catena alfa con quella gamma comune, formando il complesso IL-4Ralfagammac. Il legame tra 97 citochina e recettore porta alla trasduzione del segnale tramite la via JAK-STAT e che causa l’attivazione di JAK1, JAK3, STAT6. STAT6, successivamente, causa la trascrizione dei geni responsabili di molte funzioni biologiche di questa citochina. Inoltre, l’IL-4 è in grado di legare il recettore dell’IL-13. Questa citochina ha diverse funzioni: • Nei linfociti B, l’IL-4 prodotta dalle cellule THF promuove lo scambio isotipico della catena pesante delle immunoglobuline verso la classe IgE. • Induce lo sviluppo dei linfociti TH2 • Insieme all’IL-13 contribuisce ad attivare in maniera alternativa i macrofagi, inibendo così le difese contro i microrganismi intracellulari che normalmente vengono eliminati mediante fagocitosi. • IL-4 e IL-13 stimolano la peristalsi gastrointestinale e, inoltre, IL-13 stimola la secrezione di muco da parte delle cellule dell’epitelio intestinale e delle vie aeree superiori, così da contribuire nuovamente all’eliminazione dei patogeni in questi tratti. • IL-4 e IL-13 promuovono, infine, il reclutamento dei leucociti e, in particolare, degli eosinofili. Interleuchina 13 È un’altra citochina che ha un ruolo importante nella difesa contro gli elminti e nella genesi di malattie su base allergica. È una citochina appartenente alla famiglia delle citochine del primo gruppo e agisce di concerto con l’IL-4 solo che, a differenza di quest’ultima, l’IL-13 non promuove la differenziazione dei linfociti TH2. È prodotta principalmente da linfociti TH2, ma anche dalle cellule linfoidi innate. Questa citochina si lega ad un recettore composto dalla catena IL-13Ralfa1 e la catena IL-4Ralfa, per cui questo recettore, espresso dai linfociti B, fagociti mononucleati, Dc, leucociti, lega sia IL-4 che IL-13, portando dall’attivazione della trasduzione del segnale attraverso la via JAK1, JAK3 e STAT6. Interleuchina 5 Rappresenta il principale collegamento tra l’attivazione dei linfociti T e le risposte infiammatorie che coinvolgono gli eosinofili. Questa citochina è prodotta principalmente dai linfociti TH2 e dalle cellule linfoidi innate. È un omodimero contenente 4 domini alfa elica che lega un recettore costituito da una catena beta comune (presente anche nel recettore dll’IL-3) e una subunità alfa. Il legame tra IL-5 e recettore porta all’attivazione di JAK3 e STAT3. La funzione principale di questa citochina è quella di stimolare la proliferazione e la differenziazione degli eosinofili, cellule che esprimono sulla loro superficie un recettore che riconosce la porzione Fc delle IgE ed IgG, e quindi gli eosinofili possono eliminare i microrganismi rivestiti da questi anticorpi. L’interleuchina 4 stimola la produzione di IgE per gli elminti, mentre l’IL-5 attiva gli eosinofili, i quali rilasciano gli enzimi contenuti nei loro granuli, come la proteina basica maggiore e la proteina cationica maggiore che sono in grado di distruggere gli elminti. Inoltre, le IgE rivestono i mastociti e causano la loro degranulazione in seguito all’incontro con l’antigene. Le citochine prodotte dai linfociti TH2 svolgono anche un ruolo nell’impedire l’ingresso dei microrganismi a livello delle mucose, come è stato già spiegato parlando dell’L-4 e IL-13. Queste ultime due citochine, inoltre, possono attivare i macrofagi a produrre enzimi che catalizzano la sintesi del collageno e che promuovono la fibrosi. L’attivazione dei macrofagi da parte dei linfociti TH2 è detta attivazione alternativa, e questi macrofagi così attivati producono citochine che promuovono la cicatrizzazione e la fibrosi, la sintesi di collageno e l’angiogenesi.