Immobilizzazione di enzimi: metodi e vantaggi - Prof. Pessione, Sbobinature di Biochimica

Scarica Immobilizzazione di enzimi: metodi e vantaggi - Prof. Pessione e più Sbobinature in PDF di Biochimica solo su Docsity! Biochimica Applicata SOSTENIBILITÀ AMBIENTALE L'utilizzo della microbiologia alimentare applicata agli alimenti, agli integratori nutrizionali (nati dopo il 2000), e tutta la strategia dell'utilizzo di batteri risale ad anni '50 dopo la Seconda guerra mondiale. Gli antibiotici sono nati dal'38 al'40, c'era un po' meno la preoccupazione delle infezioni; c'è stato tutto la problematica della guerra con minore espansione industriale perchè tutto era concen- trato nell'industria bellica. Dopo la guerra c'è stato consolidamento di varie industrie alimentari che utilizzavano le fermenta- zioni, producevano starter industriali, miglioravano la produzione di vino, birra, formaggi e vari tipi di caseificazione ------- Boom di tale disciplina che si è aggiornata nel tempo. Un grosso salto di qualità è stato fatto utilizzando tecniche di analisi genomica che prima non erano possibili (le evoluzioni scientifiche spesso sono correlate all'evoluzione nel campo della tecnologia: invenzione microscopio, tecniche di analisi del DNA, scoperta microbiota grazie a nuove tecnologie e metodologie, ecc.) Negli anni '70 inizia ad essere rilevante il problema ambientale: chiazze di petrolio nel mare do- vute a schianto tra petroliere — economia petrolio inizia nel '900, era a basso costo perchè i paesi arabi che lo producevano non si rendevano conto del suo valore, tutta l'economia si è basta sul pe- trolio (inizialmente macchine andavano ad alcool — buona resa, ma non c'era buona resa di aziende alimentare e l'alcool si ricava da zuccheri grazie a batteri che vanno in glicolisi, gli zuc- cheri si ottengono dai vegetali; I mercati di mais ecc non rendevano come oggi grazie ai fertiliz- zanti di sintesi, un anno era più presente che l'altro, per cui il prezzo del carburante ad alcool va- riava in base alla sua disponibilità. Il petrolio era preferibile perchè era stabile e si pensava fosse illimitato, per questo costava meno). 1973 — prima crisi petrolifera; prezzo benzina da 180L a 1200L l'economia del petrolio inoltre prevede lo spostamento in mare di imbarcazioni con petrolio; ci sono 2 grandi incidenti: Alaska e Bretagna, dove chiazze di petrolio danneggiano ecosistemi e animali muoiono. Si comincia a pensare di utilizzare i microrganismi per il biorisanameno — utilizzare le vie meta- boliche microbiche per porre rimedio ai problemi ambientali. Si intuisce che nel mondo microbico ci sonole risposte per “risolvere” problemi dovuti all'ecces- siva industrializzazione — anni '70, già presebti priblemi di inquinamento, accumulo di plastiche, ecc., NO problema di carenza di energia (non si comprava petrolio perchè caro, ma non perchè non c'era come rischia di essere oggi) Il concetto di sostenibilità ambientale nato nel 2004 si discute attraverso differenti approcci, che è problema serio da risovere e nonsolo propaganda, è un problema che coinvolge un'interdiscipli- nalità: APPROCCIO POLITICO: politiche monetarie, prezzi maggiori per tutto ciò che è negativo per l'ambiente (più costo per le plastiche e minore per il vetro, più costo perla benzina - uso mezzi) STILI DI VITA: educazione a partire dalle scuole dell'infanzia APPROCCIO SCIENTIFICO: il nostro punto di vista, usare le nostre conoscenze per ridurre impatto ambientale, migliorare produzione di energia, ecc. (usare chimica, microbiologia...) Da questi tre pilastri, che devono interagire tra loro (legge per meno plastica, ma devo avere alter- native e strategie per plastiche rinnovabili ecc.), si può muovere i primi passi una reale sostenibi- lità ambientale, tramite legislazioni, piccoli gesti quotidiani e green technologies — tecnologie biologiche, chimiche, biochimiche che ci permettono di dare una risposta anche ai problemi di na- tura ambientale. Nell'ambito delle GREEN TECHNOLOGIES rientrano i sistemi per: — rilevare gli inquinanti (in questo modo si sa anche che pericoli corro — rilevamento di particolato nell'aria per la nostra respirazione, si può fare anche coni microrganismi) -— biorisanamento/bioremediation verso danni già fatti da anni di industrializzazione(di metalli pesanti, fosfati, tesioattivi, fenoli e zolfo, esempio biorisanamento del diesel e ben- zina nei serbatoi delle pompe di benzina, siti che necessitano di una bonifica nel momento in cui sono dismessi a causa di possibili perdite) — bioconversioni— concetto di questo secolo, metre gli altri erano del secolo scorso Bioe- nergie e bio plastiche, il fine è quello di produrre materie o energia utilizzando prodotti di scarto e batteri e non consumare materie prime per produrre materie o energia. Ragiono in ottica circolare (CIRCULAR ECONOMY): alghe che fanno biodiesel da olio di scarto attraverso fotosintesi; batteri che fanno butanolo per combustibile/carburante idrolizzando la cellulosa di scarto da scarto di alberi; far digerire il siero di latte (scarto dell'azienda casearia) in acido lattico, poi usato nella produzione di poli-lattati, plastiche biodegradabili. La Circular Economy (Economia Circolare) è un nuovo paradigma di sviluppo che propone di ri- generare il capitale naturale, re-immettendo nel ciclo della biosfera i materiali di origine biologica e progettando i materiali di origine tecnica in modo tale da massimizzarne il grado di utilizzo. Non è ovviamente un sistema perfetto. Parleremo di: * RILEVAMENTO INQUINANTI: metalli pesanti, pesticidi, fenoli * BIORISANAMENTO: metalli pesanti, fosfati, tensioattivi, fenoli, zolfo? (petrolio e zolfo non sono più eco-sostenibili) * BIOCONVERSIONI: bioenergie (metano, etanolo, butanolo, idrogeno), bioplastiche (lat- tati, polidroxialcanoati) I SUPPORTI INORGANICI sono spesso metalli preziosi (rame, oro, argento) perché devono dare meno interazioni possibili e non ossidarsi. Per quanto riguarda i SUPPORTI ORGANICI, aumenta la forza di legame e la stabilità (2mg/g — doppio di prima) perché intervengono interazioni elettrostatiche più forti e perché ci sono più gruppi che interagiscono (tanti legami deboli possono essere più forti di un solo legame cova- lente). L'enzima, essendo una molecola organica, sarà più compatibile con altre molecole organi- che. PROCEDURA DI IMOBILIZZA ZIONE: (è facile) i supporti, organici o inorganici, vengono incubati con l’enzima a T, pHe forza ionica specifica dopo esser stati lavati in tampone (T, pH e forza ionica varieranno a seconda che l'enzima provenga da un acidofilo, alcalinofilo, da un ter- mofilo, dall'uomo, batterio, lievito (25°), ecc). Esempio - enzima spennellato su supporto di agar. Metodo veloce e facile, ma labile perché legato solo tramite forze ioniche (questa struttura non durerà a lungo nel tempo, legame ionico con supporto inorganico). Per aumentare la forza posso fare delle varianti (questa era un'IMMOBILIZZAZIONE PER ADSORBIMENTO PURA). In entrambi casi, parte dell’enzima può staccarsi dal supporto ed eluirsi nel prodotto. Per evitare che questo incida troppo sul processo, si possono utilizzare varianti dell’assorbimento semplice: — ADSORBIMENTO TRAMITE METALLI DI TRANSIZIONE I metalli di transizione (di solito cationi bivalenti) fungono da chelanti tra la proteina (di qualsiasi tipo) e il supporto, sia esso organico che inorganico (metallo reagisce bene con superfici inorgani- che). È come avere forza di legame maggiore. I metalli di transizione sono caratterizzati dall'avere orbitali parzialmente vuoti, perciò tendono a dare legami dativi, a metà strada tra un legame covalente e ionico, pertanto l'interazione sarà più stabile rispetto al metodo puro. - ADSORBIMENTO CON LEGAME BIO-SPECIFICO (GLICOPROTEINE) Il legame biospecifico si realizza tra componente glicidica delle glicoproteine e lectine adese al sefarosio (Con A- sefarosio, zucchero simile a quello che si usa nelle colonne cro matografiche). Il supporto che è uno zucchero contiene le lectine (famiglia di glicoproteine altamente specifiche per determinati zuccheri, queste sostanze svolgono un importante ruolo biologico nel processo di riconoscimento dei polisaccaridi presenti sulle membrane cellulari). Interazione altamente biospecifica. La lectina più nota è la concanavalina A- sefarosio (conlo zucchero. - ADSORBIMENTO TRAMITE INTERAZIONE IDROFOBICA (LIPOPROTEINE) L’interazione idrofobica si realizza tra supporti ricchi di composti aromatici e Tyr, Trp, Ile della proteina (aa idrofobici) o tra la componente lipidica della lipoproteina e domini lipofili del sup- porto. Le lipoproteine tendono ad avere amminoacidi idrofobici che attaccano lipidi (lavare un piatto di plastica, tra strutture idrofobiche rimane un'attrazione). Queste si attaccano volentieri su un supporto plastico lipofilo. Quest'interazione è più stabile delle varianti precedenti (legame ionico con supporto organico, inorganico legame dativo), infatti l’adsorbimento mediato da interazioni idrofobiche ha: rese più alte: 30 mg d’enzima/ml di supporto stabilità al pH: tra valori compresi tra 4 e 11 (molto ampia, di solito nelle zone idrofobiche non varia molto) stabilità alla concentrazione: nell’intervallo di 5 mM- 2 M (abbastanza ampio). Se la superficie è plastica posso separarli trattando con detergenti più o meno aggressivi, come si usa per liberare le proteine di membrana dalle membrane (SDS — scompagina un po'la mem- brana). Si può separare l’enzima dal supporto con detergenti come nel caso di separazione di proteine da membrana (SDS 0,1% se è in % maggiore denaturo le proteine, Triton X-100). — INTERAZIONE COVALENTE MEDIATA DA REAGENTE BIFUNZIONALE Per compensare l’impossibilità di creare le gami covalenti tra enzima e supporto, si usano reagenti bifunzionali come la glutaraldeide, che può legarsi covalentemente, facendo da intermedio, all’enzima sugli amino gruppi (chitina ha ammino gruppi, infatti è un amminozucchero; in genere gli zuccheri non sono composti azotati, ma sono composti CHO, ma alcuni sono amminozuccheri e l'amminogruppo da legami) e, su certi supporti organici naturali (collagene, chitina, non plastici ma superfici biotiche), sulle ammine primarie (sistema a ponte). E ----- S > E --- glutaraldeide --- S La scelta tra semplice adsorbimento o interazione covalente mediata, va fatta in base alla durata dell'enzima (quanto voglio usare questo sistema): VITA BREVE - (necessità rigenerazione) --> S.A. VITA LUNGA - (non necessità rigenerazione) --> I.C.M. Per poterlo riutilizzare più volte L'enzima va poi conservato in frigorifero perchè non si danneggi l'attività catalitica o la struttura terziaria della proteina, ecc. 2. IMMOBILIZZAZIONE PER INTRAPPOLAMENTO O INCLUSIONE Non si formano né interazioni covalenti, né legami deboli: semplicemente la proteina è interpo- lata nelle maglie di un reticolo non proprio regolari. Il supporto, o meglio, la matrice (perchè la superficie non è piana ma 3D), è sempre organica ed è strutturata in modo tale da formare una rete tridimensionale in cui si incorpora l'enzima (inorga- nici sarebbero così piccoli da non poter contenere l'enzima). Queste MOLECOLE ORGANICHE possono essere di origine naturale (come l'A gar o l'Algi- nato, di cui posso modulare la densità tramite la concentrazione di Agar che a 45° solidifica in gel, reticolo in cui l'enzima può entrare) o matrici sintetiche (poliacrilammide, PAA e Poliure- tano). Il FATTORE LIMITANTE di questo tipo d’immobilizzazione sta nella corrispondenza, non sempre perfetta, tra maglie del reticolo e la dimensione di enzima e substrato. I requisiti sono 3: + L’enzima deve potersi muovere liberamente all’interno del reticolo (gli enzimi infatti quando catalizzano si muovono, micro-movimenti, aprono e chiudono sito catalitico, mo- lecole dinamiche) e Le maglie devono essere sufficientemente strette per non perdere la proteina (se i pori sono troppo grossi l'enzima tende a fuoriuscire) «Le maglie devono essere sufficientemente grandi da garantire l’accessibilità del substrato e la sua diffusione all'interno della matrice (se le maglie sono troppo strette il substrato non può entrare) Non si potrà immobilizzare per intrappolamento un’amilasi perché l'amido è una molecola enorme che non entrerà mai, così come tutte le idrolasi che tagliano macromolecole, sono enzimi il cui substrato è troppo grosso, o non entra o pori troppo grossi e l'enzima scivola via. L'acetaldeide e l'etanolo, prodotte dall'alcol deidrogenasi, sono invece abbastanza piccoli da poter diffondere senza problemi fino all'enzima, è un sistema invece che funziona benissimo (enzimi che catalizzano reazioni su molecole piccole). POLIMERI NATURALI (ALGINATO) Si mescolano enzimae alginato (zucchero estratto da alghe) in un becker e si fa cadere questa so- luzione mista, goccia a goccia, in un tampone contenente ioni Ca?+: gli ioni Ca?* creano delle reti- colazioni tra le catene polisaccaridiche complessandosi con i carbossili di due diverse catene (cross-linking). Si formano granuli di alginato che contengono tra le maglie l’enzima essendo mescolati insieme. POLIMERI SINTETICI (ES. PAA) La quantità di proteina legata è maggiore quanto maggiore è la concentrazione del monomero. L'acrilamide monomerica da sola è tossica per l'uomo, ma anche per l'enzima e durante la polime- rizzazione si possono formare intermedi reattivi (spesso radicali) che danneggiano i siti catalitici. Se ho già la policrilamide l'enzima non può entrare, ma se ho l'arilamide da sola è tossica e in queste condizioni aumenta la denaturazione. Si deve, quindi, trovare un compromesso tra polimerizzazione simultanea e pre -polimerizzazione dell' acrilamide, inserendol’enzima in un tempo che abbia consentito la polimerizzazione, ma che contenga ancora monomeri. Si mescola l’enzima al monomero, prima della polimerizzazione. Si procede allora a pre-polimerizzazione in cui si formano catene lineari, poi si aggiunge l’enzima ed infine si ha la polimerizzazione definitiva con cross-linking: rete tridimensionale con enzima intrappolato. AGAROSIO ATTIVATO/IMMOBILIZZATO CON CNBR Non sempre il supporto e l'enzima si attraggono abbastanza. L’agarosio è un polisaccaride estratto da alghe marine (come l'alginato) ed è la componente prin- cipale dell’agar. Le catene sono avvolte a doppia elica e stabilizzate da ponti H. Il gel è stabile ed ha pori larghi. Per renderlo più reattivo verso i gruppi nucleofili dell’enzima (a cui di solito non si legherebbe), lo si può attivare con l’introduzione di un gruppo elettrofilo nell'agarosio, es. CNBr, che reagisce con gli OH dello zucchero formando legami intra-catena ed inter-catena. L’attivazione avviene in presenza di una base forte che aumenta la nucleofilia della resina, il pH va comunque tenuto in costante osservazione con mezzo fortemente tamponato o mediante addi- zione continua di base meno forte (TEA: TriEtilenAmina) per non danneggiare la struttura. La struttura attivata (zucchero più disponibile a reagire con la proteina) ha lunga durata in am- biente secco e freddo perché il polimero viene stabilizzato. AGAROSIO NH Ho 0 x I LU VA 0—C-NHR— proteina VA AA E CH;OH HO Il legame con l’enzima da immobilizzare avviene tra gli NH: 1 oneri vano modi Petri della proteina e gli ossidrili attivati dai CN, formando un derivato della isourea. Levi ar barato AGAROSIO ATTIVATO CON ACILI E CARBODIIMIDI L’agarosio viene dotato di bracci spaziatori, generalmente acili (acidi grassi, catena idrocarburica con un -COOH), che permettono che l'enzima immobilizzato non sia adesa al supporto e rigido, ma abbia libertà di movimento (peduncolata) tramite covalenza. (Nell'immobilizzazione ionica o reticolata l'enzima ha comunque libertà di movimento) = CH3—(CH2)8-COOH (10C) - 6-diaminoesano - acido e aminocaproico Tutte strutture a catena idrocarburica — acili. Per far si che i gruppi reattivi dei bracci spaziatori si leghino alla proteina da immobilizzare oc- corre attivarli con carbodiimide (se no fanno difficoltà a legarsi). Il processo si può effettuare su supporti naturali (agarosio, sefarosio, alginato), ma anche su sup- porti sintetici (poliacrilici o polietilenici). Il metodo sequenziale che prevede il trattamento a due diversi pH (acido e alcalino) è il più utiliz- zato, ma si può effettuare anche il metodo simultaneo in cui supporto, enzima e carbodiimide vengono messi a contatto simultaneamente. Sono presenti anche composti di scarto, come l'urea. R COOH + RN C NR3 Carbodiimide pH circa 4,8 v NHR, R C_0-_C, + NH; aa NR: pH 7, 4°C, 16h v R__C_NH aa * RiNH—C—NHRs Ò Urea ADSORBIMENTO: semplice, economico; perdita di enzima per eluizione, legame non specifico INTRAPPOLAMENTO: flessibilità dell'enzima; perdita di enzima per eluizione, scarse pro- prietà meccaniche (fragilità), problemi di diffusione se il substrato è grosso COVALENTE: legame specifico semplice, scarsa eluizione, ampia scelta di carrier; costoso, complicato da realizzare