Tecniche di immobilizzazione con supporto degli enzimi, Appunti di Farmacia

Scarica Tecniche di immobilizzazione con supporto degli enzimi e più Appunti in PDF di Farmacia solo su Docsity! 1. IMMOBILIZZAZIONE NON COVALENTE (PER ASSORBIMENTO). 2. ASSORBIMENTO IDROFOBICO DELLE LIPASI 3. IMMOBILIZZAZIONE IONICA Un’interazione ionica è un’interazione che può instaurarsi tra due gruppi aventi carica opposta. Questa può avvenire ad esempio tra uno ione carbossilato e uno ione ammonio, quindi un’interazione che avviene tra due gruppi che hanno carica opposta. Il legame ionico è un legame più forte rispetto a quello idrofobico, ma non è stabile come il legame covalente, per cui è un’interazione che fa sì che l’enzima una volta immobilizzato possa andare incontro al rilascio della proteina. È un protocollo di immobilizzazione semplice, che avviene in condizioni abbastanza neutre. Lo svantaggio principale è il rilascio della proteina, ma questo svantaggio può essere superato mediante una tecnica che stabilizzi l’enzima sul supporto. In questa immagine si vede che il supporto (sfera), che può essere ad esempio agarosio, può essere funzionalizzato con DEAE (D-etil-ammino etanolo), un reagente che viene usato per funzionalizzare l’agarosio. A pH basici la DEAE ha un gruppo amminico con carica positiva che viene usata per l’interazione con la proteina: proteina interagisce con i gruppi acidi (come acido aspartico o glutammico) e si istaura un’interazione ionica. Nel caso dell’interazione ionica il supporto può essere sia agarosio che Eupergit, a seconda della natura della reazione da catalizzare. 4. IMMOBILIZZAZIONE COVALENTE È quella che interessa di più dal punto di vista industriale perché porta a un legame stabile e irreversibile tra la proteina e il supporto. Questo tipo di immobilizzazione prevede l’uso di un supporto (che può essere agarosio o Eupergit), il quale, prima di essere usato nell’immobilizzazione dell’enzima deve essere attivato con dei gruppi funzionali. I gruppi funzionali del supporto devono reagire con le proteine e i loro residui amminoacidi. Generalmente i residui più utilizzati per l’immobilizzazione covalente sono le lisine, perché gli enzimi posseggono un elevato numero di lisine, quindi si è abbastanza sicuri che gli enzimi presentano questi amminoacidi, inoltre le lisine essendo amminoacidi polari, sono di solito disposte sulla superficie della proteina, quindi si è certi che questo tipo di amminoacidi non è coinvolto nel sito catalitico e che l’immobilizzazione avvenga tra i gruppi amminici delle lisine e i gruppi funzionali presenti sul supporto. Per quanto riguarda l’agarosio, questo è un polimero naturale con dei gruppi funzionali -OH. Il gruppo -OH è poco reattivo, per cui per poter reagire deve essere attivato. I gruppi ossidrilici possono reagire con il glicidolo, un composto caratterizzato da un gruppo epossidico. Il glicidolo permette la formazione sul supporto di gruppi diolici. A questo punto i gruppi diolici vengono ossidati con periodato di sodio (IO4) per formare dei gruppi aldeidici. Questo supporto così funzionalizzato si chiama gliosil-agarosio. Il supporto Eupergit/Separbeat presenta come gruppo funzionale l’epossido. Questo gruppo è reattivo e può reagire direttamente con le lisine della proteina, però potrebbe essere funzionalizzato. Il gruppo epossidico può essere funzionalizzato a gruppo aldeidico mediante idrolisi acida del gruppo epossidico e formazione dei gruppi diolici che vengono poi ossidati per formare dei gruppi aldeidici. Questo supporto così funzionalizzato si chiama gliosil-eupergit. L’agarosio è idrofilico, mentre l’eupergit è idrofobico. Immobilizzazione ad un supporto con gruppi aldeidici (sia agarosio che Eupergit)  il gruppo aldeidico supporto + gruppi amminici delle lisine, formando come intermedio una base di Shiff (o doppio legame imminico). Il doppio legame C=N è un legame reversibile e non stabile, quindi per stabilizzarlo deve essere ridotto da doppio legame a legame singolo C-N, stabile e irreversibile. Immobilizzazione ad un supporto con gruppi epossidici  il supporto epossidico può legarsi direttamente al gruppo amminico delle proteine, formando un legame covalente C-N in un solo step di reazione. APPLICAZIONE DELL’IMMOBILIZZAZIONE COVALENTE SULLA PENICILLINA G ACILASI (PGA) In questo caso sono stati utilizzati diversi derivati enzimatici in cui la PGA è stata immobilizzata su gliosil agarosio, su supporto epossidico tal quale e su supporto epossidico attivato con un gruppo aldeidico.  Enzima in forma libera: rapporto Vs/Vh1 è 9.6 e la % di sintesi di antibiotico è del 91%.  Enzima su glicosil agarosio: uguale.  Enzima su supporto epossidico tal quale: rapporto Vs/Vh1 cala drasticamente, diventa 3.3 e la % di sintesi diventa del 77%. In questo caso si è cercato di capire come mai. La prima ipotesi che è stata fatta ha previsto uno studio per valutare l’orientamento della proteina sul supporto, perché era stato ipotizzato che magari la PGA fosse immobilizzata sull’agarosio con il sito attivo rivolto verso l’ambiente esterno (verso la reazione), quindi avesse il sito attivo disponibile per il substrato. Nel caso del Eupergit si è pensato avesse il sito attivo rivolto verso il supporto, precludendo l’ingresso del substrato sul sito attivo. Quindi si è valutato l’orientamento di PGA su agarosio ed Eupergit. È un lavoro importante, commissionato da un’azienda che aveva bisogno di un enzima immobilizzato ma su supporto idrofobico. Gli obiettivi erano due: 1. capire l’orientamento della proteina sul supporto, ovvero come era immobilizzato l’enzima 2. migliorare le performance dell’enzima immobilizzato su Eupergit. Per studiare l’orientamento i ricercatori hanno cercato di capire in primo luogo com’era la disposizione delle lisine sull’enzima. Si vede che queste sono distribuite in maniera omogenea sulla superficie. Una volta immobilizzato l’enzima su supporto di agarosio e su supporto epossidico sono stati sottoposti i due derivati a digestione triptica con la tripsina. …Rompendo i legami peptidici si sono formati diversi peptidi, che sono stati separati in colonna cromatografica e analizzati mediante spettrometria di massa. Conoscendo la sequenza dell’enzima e analizzando i peptidi che si erano staccati dall’enzima si è capito quali lisine erano coinvolte nell’immobilizzazione con il supporto, perché essendo un’immobilizzazione covalente, la tripsina non rompeva il legame covalente, per cui parte dell’enzima rimaneva legato al supporto e in parte veniva rilasciato in peptidi. Dall’analisi dei peptidi rilasciato si è capito quali lisine erano implicate nel legame con il supporto. Nel grafico sono riportate in arancione le lisine dell’enzima immobilizzato su gliosil agarosio che sono state rilasciate nel processo di digestione triptica, in giallo le lisine idrolizzate dall’enzima immobilizzato su supporto ipossidico. A sinistra sono riportate le lisine sulla parte frontale e a destra le lisine sulla parte posteriore… L’enzima era orientato allo stesso modo in entrambi i supporti, cioè con il sito attivo rivolto verso il supporto. Quindi la proteina aveva lo stesso orientamento a prescindere dal supporto, per cui il problema era un altro.