Traduzione negli eucarioti e nei procarioti con relativo processo di regolazione, Appunti di Biologia Molecolare

Scarica Traduzione negli eucarioti e nei procarioti con relativo processo di regolazione e più Appunti in PDF di Biologia Molecolare solo su Docsity! DI DARIO SANTULLI Traduzione Il dogma centrale della biologia molecolare stabilisce che il flusso dell’informazione genetica è monodirezionale, perché passa dal DNA all’RNA che, tradotto, è utile alla sintesi di un determinato prodotto proteico. La traduzione, meglio nota come sintesi proteica, è quel processo biochimico durante il quale l'informazione genetica contenuta all’interno dalla molecola di acido ribonucleico (mRNA) è riconvertita in una sequenza polipeptidica funzionale. La riconversione dell’informazione genetica contenuta nell’RNA messaggero è guidata da un insieme di specifiche e severe regole, che nel loro insieme costituiscono il codice genetico. Il codice genetico è rappresentato, all'atto pratico, dall'insieme di tutti i possibili codoni, quindi di tutte le possibili combinazioni di base azotate, che nel loro insieme concorrono all'annessione di specifici aminoacidi alla catena polipeptidica. Una prerogativa primaria del codice genetico è la non ridondanza, cioè quella proprietà per la quale un solo un codone può codificare per un solo specifico aminoacido: coerentemente con questa proprietà, i codoni non possono essere delle sequenze mononucleotidiche, cioè a singola base azotata; se gli amminoacidi sono 20 e la basi 4, questo presupporrebbe che ogni base possa codificare per 5 amminoacidi, ma questo non è possibile. Stesso dicasi per sequenze a doppio nucleotide, cioè con due basi azotate, poiché le combinazioni totali (16) non sarebbero sufficienti per codificare 20 amminoacidi. Questo spiega il perché ogni codone debba essere necessariamente rappresentato da un trinucleotide o tripletta. Le modalità di lettura del codice genetico riferiscono che questo debba essere letto in maniera non sovrapposta, cioè di tripletta in tripletta, quindi di codone in codone. Il codice genetico infatti non può essere letto in maniera sovrapponibile, modalità secondo la quale, ad esempio, l’ultima base del primo codone coincide con la prima del secondo codone; data la sequenza originaria AGCAUCGCC: Lettura non sovrapposta: AGC AUC GCC Lettura sovrapposta: AGC GCA CAU ecc. A riprova di questo sono stati effettuati degli studi su delle mutazioni puntiformi che provocano patologie come l’anemia falciforme. La patogenesi molecolare dell’anemia falciforme consiste nella sostituzione del glutammato idrofilo con una valida idrofobica. Se il codice genetico fosse stato letto in maniera sovrapposta, allora la mutazione puntiforme non avrebbe coinvolto solamente un codone, bensì tre, quindi tra aminoacidi e non uno solo. Solamente nel 1961 l’esperimento di Nirenberg e Mattheai (il secondo premio Nobel per la medicina nel 1968) mise in luce la relazione tra singoli codoni e specifici amminoacidi codificati. L’esperimento anzitutto consistette nella preparazione di poliribonucleotidi artificiali di tipo Poli-U, Poli-A, Poli-C e Poli-G. Sfruttando il macchinario sintetico batterico di E. Coli, trattato però con delle DNasi, l’obiettivo era quello di osservare le caratteristiche della catena polipeptidica prodotta per derivare delle conclusioni efficaci: 1. Poli-U: UUU Fenilalanina 2. Poli-A: AAA Lisina 3. Poli-C: CCC Prolina 4. Poli-G: GGG Glicina L’esperimento di Nirenberg e Leder, che prevedeva l’impiego di tRNA e non di mRNA, consentì di identificare tutte le altre 60 possibili combinazioni. Il codice genetico ha le seguenti proprietà: 1. Il codice genetico è degenerato: un amminoacido, tranne che per metionina (AUG) e triptofano (UGG), può essere codificato contemporaneamente da più codoni. Considerati 16 gruppi, ognuno dei quali individua quattro codoni accomunati dalle prime due basi azotate, nel 50% dei raggruppanti, nonostante cambi la terza base azotata in U, C, A o G, i codoni codificano per lo stesso amminoacido. Nel restante 50% dei gruppi, cioè in 8 gruppi su 16, questo principio non è valido: in un gruppo simile due codoni codificano per l’aa. generico X e altri due per l’aa. generico Y. 2. Il codice genetico non è ridondante: se è vero un amminoacido può essere codificato da più codoni, è altrettanto vero che un cordono può codificare solo ed esclusivamente per uno specifico amminoacido. 3. Esistono 61 codoni senso e 3 codoni non senso: 61 codoni codificano per 20 diversi aminoacidi. Fra questi è compreso il codone di inizio AUG, codificante la metionina. I restanti tre codoni, UAA, UAG e UGA sono codoni non senso o codoni di stop. DI DARIO SANTULLI LA TRADUZIONE - RNA TRANSFER Una volta che la molecola di mRNA ha completato sia il processo di maturazione chimica (aggiunta della 7- metilguanosina all’estremità N-terminale e poliadenilazione all’estremità C-terminale) che quello relativo allo splicing e/o in combinazione con l’editing sporadico, essa può trasmigrare nell’ambiente citoplasmatico, attraversando i pori nucleari. La prima molecola fondamentale è rappresentata dall'RNA transfer, una tipologia di acido ribonucleico che media la riconversione delle informazioni contenute all'interno della sequenza multi-codonica in una specifica sequenza poliamminoacidica. Affinché la traduzione avvenga correttamente è necessario che: 1. La molecola di tRNA deve associarsi specificatamente ad un determinato amminoacido. 2. Il tRNA deve poter trasportare l’aa al ribosoma, struttura tradizionale alla quale il tRNA deve associarsi. 3. Deve avvenire correttamente l’appaiamento complementare e transitorio tra codone e anticodone. Maturazione del tRNA Affinché la molecola di RNA transfer possa eseguire correttamente il proprio lavoro, è necessario che dopo la sua sintesi (catalizzata dall'enzima RNA-Polimerasi III), la molecola stessa vado incontro a un processo di maturazione funzionale e strutturale. 1. Taglio bilaterale: un pre-tRNA presenta due estremità particolarmente allungate. Una ribonucleasi-P (un ribozima) esegue un taglio all’estremità 5’ mentre la tRNA-3’-endonucleasi rimuove del filamento in eccesso in corrispondenza della regione opposta, la regione 3’. 2. Aggiunta di una tripletta nucleotidica all’estremità 3’: una tRNA-nucleotidil-transferasi aggiunge la tripletta ACC all’estremità 3’, subito dopo il taglio eseguito dalla tRNA-3’-endonucleasi. 3. Splicing: le endonucleasi di splicing intervengono per rimuovere le sequenze introniche e annettere gli esoni in corrispondenza del dominio di tRNA contenente l’anticodone. Lo splicing consente di aumentare la variabilità molecolare dei tRNA, consentendo loro di riconoscere più combinazioni di basi, quindi più triplette. Lo splicing consente al tRNA, in pochissimi casi, di riconoscere delle triplette anomale per via di modificazioni chimiche della sua struttura. Esiste almeno un tRNA per ognuno degli amminoacidi. Struttura del tRNA La molecola di RNA transfer consiste in un acido ribonucleico la cui lunghezza media varia dai 70 fino agli 80 nucleotidi, con una buona approssimazione. L’RNA transfer presenta quattro regioni funzionali o bracci a doppia catena: l’ansa dell’anticodone, il braccio D a sinistra, quello T a destra ed un braccio terminale superiore nel quale convegno l’estremità 5’ e 3’ della catena. I quattro bracci a doppia catena si organizzano in una struttura a trifoglio o a pseudo-croce latina, mantenuta in asse grazie alla presenza di legami ad idrogeno fra le basi complementari. In corrispondenza del braccio terminale, in particolare in prossimità dell’estremità 3’ dell’RNA transfer, è presente il sito di legame (covalente) con l’aa specifico. La controparte inferiore, il dominio in basso, presenta l’anticodone, che in base alla propria sequenza è in grado di appaiarsi ai codoni dell’mRNA. DI DARIO SANTULLI FASI DELLA TRADUZIONE - FASE DI ALLUNGAMENTO 1. Riconoscimento del codone 2. Formazione del legame peptidico 3. Traslocazione Riconoscimento del codone Prima che la subunità maggiore si unisca, eIF2 ed eIF3 si dissociano solo quando è correttamente avvenuto il legame con AUG. Successivamente, il legame della subunità maggiore alla minore induce il rilascio degli ultimi fattori eIF1A ed eIF5B. Il tRNA si appaia completamente con il suo anticodone al codone AUG, in prossimità del sito P. Contemporaneamente il sito P è pronto ad accogliere nuovi tRNA, dopo l’iniziatore. L’appaiamento tra codone e anticodone crea un miniduplex transitorio nel quale i legami a idrogeni solitamente rispettano la complementarietà. L’interazione è regolare per quanto riguarda le prime due basi dell’anticodone (A con U e viceversa; G con C e viceversa), ma questo è certe volte irregolare in corrispondenza dell’ultimo nucleotide, che, deregolando, può appaiarsi a basi non complementari. Questo è il fenomeno di vacillamento o wobbling. Il legame più stabile è quello del nucleotide centrale, il medio è quello del primo ed il più debole è quello dell’ultimo. I nuovi tRNA successivi all’iniziatore non vengono più trasportati da un fattore di inizio, quale eIF2, ma da eEF1-alfa, sempre legato ad una molecola di GTP. Una volta trasportato il tRNA, il fattore di allungamento si complessa con del GDP nella forma eEF1-alfa + GDP. La fosforilazione di GDP per ritornare ad essere funzionante è mediata da eEF1-beta-gamma. Formazione del legame peptidico L’rRNA della subunità maggiore, nel ruolo di peptidil transferasi (ribozima), favorisce la formazione del legame peptidico tra amminoacidi presso il sito peptidilico. Il legame peptidico si forma con la condensazione della funzione amminica dell’amminoacido presente nel sito P con la funzione carbossilica dell’amminoacido entrante, quindi nel sito A. Una volta privato del proprio amminoacido, il tRNA prima presente nel sito P, poiché scarico, si dissocia, passando per il sito E, grazie alla traslocazione ribosomiale. Il precedente tRNA ora occupa il sito P, sempre per traslocazione ribosomiale, e la traduzione prosegue. Traslocazione ribosomiale a cricchetto Allude a quel processo durante il quale il macchinario ribosomiale si muove lungo l’mRNA in direzione 3’. L’energia richiesta per eseguire questo movimento proviene dall’idrolisi della molecola di GTP annessa al fattore eEF1-alfa responsabile del trasporto dei nuovi tRNA (!!! nel tRNA iniziatore il fattore è un fattore di inizio non di allungamento: eIF2 !!!) nel sito A, il sito amminoacidico della subunità maggiore. La traslocazione è a cricchetto dal momento che l’energia derivante dall’idrolisi del GTP, inducendo un cambiamento conformazionale transitorio, favorisce una rotazione di -6° della subunità minore su quella maggiore, e subito dopo riacquista la propria conformazione. Nei procarioti Nei procarioti l’allungamento è consentito dalla continua migrazione dei tRNA nel sito A, con le stesse modalità. La differenza è che il trasporto del tRNA è mediato non dal fattore eEF1-alfa, ma da EF-Tu legato a GTP FASI DELLA TRADUZIONE - FASE DI TERMINAZIONE L’associazione dei codoni di stop, UAA/UAG/UGA, con dei fattori di rilascio noti come RF (Release Factors), consente la terminazione della traduzione. eRF per gli eucarioti. 1. Fattori di rilascio di classe I: sono tutti quei fattori che stimolano il rilascio della catena polipeptidica dal complesso ribosomiale, dopo aver riconosciuto i codoni di stop. Intervengono tramite l’idrolisi del legame covalente tra l’ultimo aa con il suo tRNA. Negli eucarioti esiste solo eRF1 che riconosce tutte e tre le triplette, mentre nei procarioti si hanno RF1 (UAA e UAG) e RF2 (UAA e UGA). 2. Fattore di rilascio di classe II: è quel fattore (RF3 o eRF3 per gli eucarioti) che stimola il disassemblaggio del ribosoma, tramite la dissociazione dei fattori eRF1 per eucarioti o RF1 e RF2 per i procarioti. Segue il riciclaggio del ribosoma per una nuova traduzione. DI DARIO SANTULLI REGOLAZIONE DELLA TRADUZIONE 1. Stabilizzazione della molecola di mRNA: regolazione di tutti i processi che concorrono a variazioni di carattere chimico-strutturale di cui l'mRNA è il diretto interessato. Inoltre, dopo la traduzione l’mRNA può avere un’emivita più o meno protratta, a seconda della proteina per cui codifica. 2. Eterogeneità citoplasmatica riferita al prodotto proteico: consiste nella regolazione della localizzazione di determinati mRNA a livello citoplasmatico; questo comporta che determinati prodotti proteici possano essere distribuiti nel citoplasma in maniera disomogenea. 3. Regolazione diretta della traduzione: rientrano in questa modalità di regolazione i fattori di crescita che monitorano l’ampliamento del proteoma cellulare, i repressori proteici traduzionali, il meccanismo autocrino di regolazione tramite RNA interference. 4. I nutrienti presenti nell'ambiente esterno e lo stato di stress cellulare, influenzano peraltro in maniera notevole il processo di traduzione. MODALITA’ 1 - Repressori proteici Solitamente i fattori della repressione sono delle proteine che intervengono a livello dell’estremità UTR-3’ della molecola di mRNA, di cui si vuole inibire l'espressione: in corrispondenza di tale estremità è presente la regione poliadeninica, in prossimità della quale normalmente vanno ad associarsi i fattori della promozione del processo traduzionale, primo fra tutti la Poly-A Binding Protein (PABP). Il legame del repressore ad UTR-Poly-A impedisce l’associazione di TABP con eIF4E, che (eIF4E) a sua volta, con altri fattori, permette la migrazione dell’mRNA in prossimità della subunità minore del ribosoma. Cellule come gli ovociti in pre e post fecondazione sfruttano questa modalità per variare il proteoma, come altre tipologie cellulari che hanno bisogno di esprimere un determinato prodotto genico solo in specifiche circostanze Inibizione del proteoma negli ovociti non fecondati con Maskin e CPEB Un esempio di fattore inibitorio è la proteina Maskin espressa dagli ovociti in corso di sviluppo, prima di essere fecondati. Il fattore Maskin lega al versante 5’ il fattore di inizio della traduzione eIF4E e al versante 3’ una proteina legante la sequenza poliadenilata di nome CPEB (Cytoplasmic Polyadenylation Element Binding protein - Proteina citoplasmatica legante l’elemento poliadenilico). Questo impedisce al fattore eIF4E di legare PABP e procedere con la traduzione. La fosforilazione di CPEB post fecondazione induce la dissociazione e lo spostamento di Maskin e la prosecuzione degli eventi tipici della traduzione, come la formazione del complesso eIF4 (A - B - E - G). Regolazione traduzionale del recettore per la transferrina e dell’mRNA per la ferritina Il ferro rappresenta un'importante specie chimica per il funzionamento dell’organismo, tuttavia, sebbene abbia una valenza positiva (vedi produzione emoproteine), è bene che la sua concentrazione non raggiunga livelli che il corpo non è capace di tollerare. Spesso un sovraccarico di ferro può ledere le funzionalità delle cellule endoteliali e danneggiarle, può stimolare l’aggregazione piastrinica e l’ossidazione dell’LDL con formazione di cellule schiumose (passaggio da monociti a macrofagi), promuovendo così un evento aterosclerotico. Il ferro può essere normalmente introdotto con la dieta, ma solo parte di questo entra nelle vie metaboliche, in quanto l’organismo ha elaborato un serie di depositi nei quali conservarlo in concentrazioni adeguate: un buon 60-70% nell’emoglobina, circa il 20-30% associato alla ferritina, meno del 10% conservato nella mioglobina ed una piccola parte legato alla transferrina. Così come viene introdotto, esso può essere espulso tramite feci e urine, ma anche con flusso ematico mestruale e desquamazione di cellule senescenti. Il trasporto del ferro nei tessuti del corpo è mediato dalla transferrina, la quale consente, previo legame con specifico recettori, di distribuire la specie chimica alle cellule che ne hanno più bisogno, soprattutto quelle ad elevata attività proliferativa. Il recettore della transferrina può andare incontro a proteolisi, immettendo nel torrente ematico il recettore solubile della transferrina, un biomarcatore utile a monitorare lo stato di salute del soggetto. Un eccesso di rettore solubile indica bassi livelli di ferro, mentre una sua carenza indica concentrazioni elevate. DI DARIO SANTULLI La regolazione dell’espressione dell’mRNA codificante per il recettore della transferrina avviene grazie alla presenza di proteine citoplasmatiche IRP (Iron Responsive Protein - proteine di risposta al ferro). La proteina IRP, legandosi alla sequenza IRE del trascritto primario, esibisce un effetto protettivo rispetto alle endoribonucleasi che tentano di degradarlo. - Quando i livelli di ferro sono bassi, IRP, perché non legato al ferro, lega IRE, impedendo agli enzimi di degradare l’mRNA, allungandone così l’emivita. Questo implica che saranno prodotti più recettori per la transferrina. - Quando i livelli di ferro sono alti invece, IRP, perché associato al ferro, non lega IRE, consentendo agli enzimi di degradare l’mRNA, riducendone l’emivita. Questo implica che saranno prodotti meno recettori per la transferrina. La concentrazione di ferro è inversamente proporzionale quindi al recettore per la transferrina, ma direttamente proporzionale a quella della ferritina. Per l’mRNA codificante la ferritina invece, IRP non è un promotore della traduzione, bensì un suo repressore. Infatti nel trascritto la sequenza IRE si trova qualche nucleotide a monte della sequenza di Kozak, quindi di AUG; questo implica che il legame di IRP ad IRE impedisce fisicamente l’associazione del complesso di inizio della traduzione. La ferritina, legandosi agli ioni ferro, impedisce loro di progredire nell’organismo, causando danno! - Quando i livelli di ferro sono bassi, IRP, perché non legato al ferro, lega IRE-ferritina, impedendo la traduzione dell’mRNA. Ne derivano bassi livelli di ferritina. - Quando i livelli di ferro sono adeguati o elevati, IRP, perché legato al ferro, non lega IRE-ferritina, consentendo la traduzione dell’mRNA. Ne derivano normali o alti livelli di ferritina. Regolazione traduzionale per la sintesi di emoglobina La promozione o l’inibizione del processo traduzionale che porta alla sintesi delle subunità di emoglobina è mediata da una chinasi, la chinasi HCL, che istituisce un rapporto di stretta dipendenza con i gruppi eme. Quando la concentrazione di eme è elevata, ognuno dei gruppi prostetici si associa ad una chinasi HCL, inattivandola. L’inattivazione di HCL fa sì che il fattore di inizio della traduzione eIF2, non fosforilato, possa promuovere l’avvio dell’espressione genica trasportando il tRNA iniziatore al complesso di pre-inizio. - Quando i livelli di eme sono elevati, i gruppi prostetici si legano alle chinasi HCL, inattivandole, e consentono l’espressione dei trascritti codificanti per le subunità emoglobiniche. Eme elevati corrispondono ad emoglobina alta. - Quando i livelli di eme sono bassi, i gruppi prostetici non si legano alle chinasi HCL, attivandole, e non consentono l’espressione dei trascritti codificanti per le subunità emoglobiniche. Eme bassi corrispondono ad emoglobina bassa. MODALITA’ 2 - Delocalizzazione dell’mRNA in Drosophila Per comprendere che cosa rappresenti all’atto pratico la delocalizzazione dell’mRNA, si considera lo sviluppo dell’asse antero-posteriore di Drosophila Melanogaster. Nell’ovocita che anticipa la formazione della larva, perché non ancora fecondato, accade che gli mRNA del gene Bicoid, responsabile della formazione di testa e torace, si concentrano nel polo anteriore, mentre gli mRNA del gene Oskar, responsabile del dorso e dell’intera parte posteriore, si ammassano al polo posteriore. Il citoscheletro ovocitario, simultaneamente all’informazione in 3’ UTR che controlla la localizzazione citoplasmatica, giocano un ruolo centrale. MODALITA’ 3 - Amplificazione della traduzione con polisoma Il polisoma definisce una circostanza nella quale un trascritto primario viene decodificato non da uno, bensì da una molteplicità di ribosomi, il cui numero varia al variare del grado di amplificazione della traduzione. L’organizzazione in successione dei ribosomi prevede che essi favoriscano il rilascio delle catene polipeptidice multiple nell’ambiente citoplasmatico, evitando che interagiscano a vicenda. In una circostanza simile è importante che i ribosomi assumano una determinata angolazione, per impedire che il prodotto proteico vada ad interagire con la struttura di un secondo polipeptide analogo, compromettendone la struttura.