Trascrizione dell'RNA: differenze con replicazione DNA e ruolo RNA polimerasi, Dispense di Biologia Animale

Scarica Trascrizione dell'RNA: differenze con replicazione DNA e ruolo RNA polimerasi e più Dispense in PDF di Biologia Animale solo su Docsity! TRASCRIZIONE La trascrizione è la prima tappa dell'espressione del genoma. Durante la trascrizione sì genera una molecola di RNA che funziona da stampo per il processo della traduzione. Concetto fondamentale della trascrizione è che, a differenza della replicazione del DNA che interessa tutto il genoma della cellula (quantitativamente) e qualsiasi regione genica, codificante o non, (qualitativamente), gli apparati della trascrizione stessa, e in particolare la RNA polimerasi, devono compiere delle scelte, perché non tutto il genoma della cellula è trascritto. Viene trascritta solo la parte codificante del genoma (20% circa), quindi già la RNA polimerasi deve fare la differenza tra questo 20% e 80%; inoltre, non essendo tutto il DNA della cellula disponibile nella cellula perché ci sta l'eterocromatina (che è quello indisponibile) e l'eucromatina (che è quello disponibile), o succede qualcosa a livello delle regioni eterocromitiniche affinchè siano disponibilio la RNA polimerasi trascrive solo l'eucromatina a disposizione (in realtà succedono tutte e due le cose in una cellula). Per esempio, la telomerasi non è espressa nelle cellule somatiche, eppure il gene c'è, questo vuol dire che il gene fa parte di una regione dietero cromatina e non può essere espresso. Ma immaginate il passaggio della cellula dal momento che esprimeva tale gene subito al momento in cui non lo esprime più: il gene è diventato da eucromatina e etero cromatina, questo vuole dire che c'è un'regolazione dell'espressione. Questa regolazione è in alcuni casi Sì/No, in altri casi è Poco/Molto. Quindi se un gene è altamente espresso vuol dire che la cellula ha bisogno di molta proteina codificata da quel gene, al contrario se un gene è poco espresso vuol dire che la cellula non ha bisogno della proteina espressa da quel gene. Alcuni geni possono essere espressi sempre a livelli bassi ma a un certo punto bisogna che vengano espressi in maggiore misura e viceversa. Tutto questo per dire che il processo della trascrizione è un processo molto regolato. | prodotti della trascrizione sono molecole di RNA: innanzitutto sono molecole a singolo filamento, che contengono | ribonucleosidi trifosfato, cioè quelli che la DNA polimerasi scartava a priori e non faceva proprio entrare nel suo sito attivo; questi ribonucleosidi trifosfato sono ATP, CTP, GTP e UTP; mentre lo scheletro fosfodiesterico è esattamente lo stesso delle molecole di DNA, fatta eccezione per l'ossidrile 2° sullo zucchero (ribosio): ma quello che cambiano sono le basi, cioè se troviamo U è certo che quella è una molecola di RNA, d'altra parte se troviamo U su una molecola di DNA sappiamo che quello è pericoloso perché può risultare da una deamminazione di C, quindi l'evoluzione ha confinato la U all'RNA. Queste basi esposte possono formare delle strutture, possono appaiarsi. E' vero che le molecole di RNA sono a singolo filamento, ma quello che certamente succede su queste molecole è che queste trovano degli attaccamenti in modo da formare strutture locali di alpha elica, ma sono strutture limitate: mentre il DNA è monotono, sempre la stessa elica destrorsa a doppio filamento, una molecola di RNA si può ripiegare nello spazio e quindi attraverso terminazioni con strutte a doppio filamento, tratti più o meno esposti a singolo filamento, dei loop che sormontano degli steli a doppio filamento, allora si possono generare numerosissimi motivi strutturali sulle molecole di RNA. D'altra parte, mentre la molecola di DNA c'ha sempre la stessa struttura perché una cosa deve fare, deve mantenere l'informazione genetica e la deve propagare, la molecola di RNA (spesso c'hanno delle funzioni di genoma, come nei retrovirus) ha la funzione di formare queste strutture (impalcatura strutturale), su cui poi si assemblano delle proteine per generare organelli (ribosoma, splicesoma). Quindi la funzione dell'RNA non è solo quella di fare il messaggero, ma ha anche funzioni strutturali e infatti genera livelli di struttura secondaria. Il processo che genera RNA da DNA si chiama trascrizione. Un'altra differenza tra replicazione di DNA e trascrizione di RNA risiede anche in un'ulteriore scelta, quindi sono soltanto scegliere il tratto da trascrivere, ma poi si deve scegliere pure il filamento da trascrivere: il prodotto della trascrizione sarà una molecola a singolo filamento, quindi l'RNA dovrà anche andarsi a scegliere il filamento da copiare. Questo filamento prodotto assomiglia al filamento di sopra del DNA, che però è un filamento passivo nel corso della trascrizione di RNA, perché non è copiato; invece il filamento copiato è quello di sotto. Quindi |'RNA polimerasi per il principio della complementarietà va a aggiungere ribonucleosidi trifosfato. Il filamento di sotto crea verrà chiamato filamento stampo oppure templato oppure antisenso, Invece il filamento di sopra è il filamento senso, perché è quello che dà senso alla sequenza di RNA (53°). La sintesi ditrascrizione dell'RNA la fa la RNA polimerasi. Differenze tra la RNA polimerasi e la DNA polimerasi 1. L'RNA si deve scegliere il gene da trascrivere, si deve scegliere il filamento. 2.E' un enzima altamente processivo, perché quando si lega siamo sicuri che resta fino alla fine (non senza delle pause) 3. E' un enzima che fa tutto da solo: l'RNA polimerasi non ha bisogno di una elicasi per esporre il filamento stampo, fa tutto da sola nel corso di allungamento. (Per cominciare a trascrivere si fornirà di numerosi fattori). 4. L'RNA polimerasi pur essendo un enzima molto processivo essendo incastonato nella bolla di trascrizione, è un enzima poco veloce rispetto alle DNA polimerasi (per gli eucarioti la RNA polimerasi va avanti di 30-40 nucleotidi al secondo). 5. La RNA polimerasi ha una struttura chiusa Questa regione di DNA denaturato si chiama bolla di trascrizione, ed è denaturato dalla RNA polimerasi, che DD 0, natia volta incastonatosi in questa bolla si sposta e man mano che avanza questa RNA polimerasi (sempre in direzione 5‘-3‘) vuol dire che si denatura il DNA in avanti ma si rinatura indietro: questo dal punto di vista topologico è estremamente importante perché in avanti si creano superavvolgimenti positivi, all'indietro di creano superavvolgimenti negativi; quindi le DNA topo isomerasi di tipo | vanno a normalizzare questo stato topologico del DNA all'indietro, introducendo superavvolgimenti positivi, mentre quelle ditipo Il neutralizzano in avanti. In una bolla 1. Il filamento senso (quella che dà senso al trascritto, cioè quello che non fa da stampo, ma la cui sequenza corrisponde alla sequenza del trascritto) 2.11 filamento antisenso (templare) 3, Trascritto Il passaggio dalla fase di inizio (in cui si forma il complesso aperto, cioè la bolla di trascrizione denaturata = fase per niente facile da raggiungere; prima che si sia formato il complesso aperto vi è il complesso chiuso) a quella di allungamento (quando prevale la RNA polimerasi dal vincolo con sigma = liberazione plilance ?? ) è una fase complicata. Il fattore sigma fa il “tira e molla”, ovvero con una parte è legato e con l'altra no, non riesce a staccarsi del tutto e finché non si stacca non può cominciare la fase successiva di allungamento. Il fattore sigma si attacca e si stacca, e quindi la RNA polimerasi, che è una molecola massiccia e flessibile, si accartoccia come un bruco mentre si muove (nel tentativo di sintetizzare RNA) e sigma lo “tira” indietro, facendo ritornare la polimerasi nella sua posizione iniziale (questo meccanismo si chiama movimento del bruco della RNA polimerasi): quindi ci sta sigma che la trattiene. Ma ogni volta che la RNA polimerasi si accartoccia per staccarsi dal fattore e iniziare procedere liberamente nella fase di allungamento, effettivamente sintetizza 7-10 ribonucleotidi alla volta ma poi ritorna bruscamente indietro, questi 7-10 ribonucleotidi sintetizzati vanno via e si chiamano “trascritti abortivi". A un certo però vince la RNA polimerasi e finalmente si stacca da sigma: adesso può procedere nella sintesi processava (questa è una fase delicatissima della trascrizione). Si comincia a vedere il trascritto che esce dal poro; il trascritto si allunga e a un certo punto la RNA omincia la fase di TERMINAZIONE della trascritto. Il complesso della RNA polimerasi con la bolla di trascrizione è un complesso stabile, infatti abbiamo polimerasi si deve staccari detto che IPRNA polimerasi è un enzima altamente processivo, deve quindi succedere qualcosa che fa staccare |'RNA polimerasi. Verso la fine del trascritto, il trascritto stesso genera una struttura secondaria, assume una struttura ad “ansa-e-stelo” (stem-and-root), cioè una struttura a forcina. Questa struttura a stelo si va a formare perché sulla stessa molecola di mRNA ci stanno dei ribonucleotidi che si possono appaiare fra di loro e formare questo stelo che una regione di RNA a doppia elica piccola ma sufficientemente stabile; ci sta un'altra regione che forma l'ansa e un'altra che si appaia. Un altro punto importante del trascritto è quello che ci sta subito dopo la forcina: una regione composta da diversi residui di U, questo vuol dire che sullo stampo ci sono una serie di A. Questo vuol dire che nell'ultimo tratto di MRNA-DNA stampo ci sta una serie di legami deboli U-A; nel frattempo quando la struttura a forcina si forma, l'RNA polimerasi capisce di essere arrivata alla fine del processo e rallenta la trascrizione, la sua attivit n una fase di stallo, nessuno va da nessuna parte. Però I'RNA polimerasi deve risolvere la situazione: lo stampo e il trascritto sono associate in maniera labile ed è quindi favorita la dissociazione tra I'mRNA e il DNA stampo: quando questi due si dissociano, si dissocia tutto il complesso della RNA polimerasi.: quindi questo mRNA va via, la RNA polimerasi di disassembla e sarà pronta a cominciare la trascrizione su un altro genoma (quest'ultimo sempre grazie alla attività di sigma). Quindi a livello del terminatore (una sequenza nucleotidica che è fatta proprio per formare la struttura a forcina seguita dalle basi U) si rallenta l'attività della RNA polimerasi e infine si stacca. (ATTENZIONE: | terminatori sono le sequenze di DNA che fanno da stampo alla sequenza terminale del trascritto): questo meccanismo si chiama meccanismo di terminatore intrinseco. Finora abbiamo parlato ditrascrizione, del meccanismo della trascrizione nei procarioti, e abbiamo anche descritto un meccanismo di regolazione basato sia su un controllo positivo che negativo, con l'esempio dell'operone Lac per il lattosio. Ora passiamo agli eucarioti, iniziando da questo concetto: negli eucarioti, in particolare nelle cellule animali, abbiamo tre diverse attività RNA polimerasiche, che chiamiamo RNA polimerasi |, Il e III. Quindi è evidente che c'è una sorta di suddivisione dei compiti negli eucarioti per quello che riguarda la trascrizione diun genoma che è più complesso di quello dei procarioti, in cui c'è una sola RNA polimerasi sebbene questa RNA polimerasi possa associarsi a diverse subunità o (noi ne abbiamo vista una sola, quella pi generale). L'RNA polimerasi |, negli eucarioti, trascrive un singolo gene, che è però ripetuto alcune centinaia di volte nel genoma. Questo gene è quello che codifica per un precursore degli RNA ribosomali: questo gene si chiama 47S. Questo è un trascritto che ne contiene altri tre, quindi viene maturato e da cui vengono rimosse delle sequenze utili che corrispondono agli RNA ribosomali 28S, 18S e 5,85, ma riprenderemo più avanti questo concetto quando parleremo dei ribosomi. Poi c'è un'altra polimerasi, la RNA polimerasi III, che trascrive un'altra serie di geni ripetuti, che sono i geni del tRNA, del 55 RNA ribosomale, che è quello che manca per andare a costituire un ribosoma completo, e poi altri piccoligeni, come i Small Nuclear RNA, che sono quelli che compongono lo spliceosoma. L'RNA polimerasi su cui ci concentreremo maggiormente è I'RNA polimerasi Il, perché è un modello migliore. Perché dico questo? Perché noi possiamo considerare le attività delle RNA polimerasi | e Ill come abbastanza specializzate per trascrivere gran parte di geni da cui non deriveranno proteine, bensì gli rRNA, tRNA, snRNA per lo splicing e così via. Però questo è un numero abbastanza limitato di geni; invece la maggior parte dei geni codificanti nel nostro genoma sono geni che codificano per proteine, e sono numerosi: noi abbiamo circa 25-30 mila geni espressi e la maggior parte non costituisce sequenze ripetute, ma sono diversi l'uno dall'altro. E questo vuol dire che l'attività della RNA polimerasi Il è quella che si deve adattare a molteplici situazioni diverse. Quindi RNA polimerasi e III svolgono attività alquanto monotone, molto regolate, perché quelli sono tutti trascritti di cui la cellula ha enorme bisogno, invece l'RNA polimerasi Il deve “capire” se di un trascritto in una cellula ce ne vuole molto o ce ne vuole poco, oppure non ce ne vuole affatto. L'ÌRNA polimerasi Il si presta molto bene a descrivere i fenomeni della regolazione trascrizionale. Vediamo dunque come avviene la trascrizione negli eucarioti. Noi abbiamo già detto che nei procarioti esistono due regioni importanti per la trascrizione: una, che è praticamente fissa e si trova in prossimità del sito di inizio della trascrizione, ed è proprio quel sito che consente il posizionamento della RNA polimerasi. Ricordiamo che I'RNA polimerasi fa delle scelte perché deve potersi legare laddove comincia la trascrizione, e questa regione è praticamente il promotore del gene, che è vero che riesce a reclutare la RNA polimerasi (che da sola non potrebbe legarsi in questa regione), ma da solo non sarebbe sufficiente a garantire il corretto livello di espressione del gene, al massimo può promuovere qualche copia del trascritto. E allora ci vuole qualcosa che supporti l'attività di questo promotore basale, e questo qualcosa è una serie di elementi in cis che si trovano sparsi, alcuni possono trovarsi anche vicini al sito di inizio della trascrizione ma non staremmo commettendo un'eresia se affermassimo che questi elementi si possono trovare anche a notevole distanza rispetto al promotore, anche a 100mila coppie di basi di distanza. Potrete pensare che questa sia una distanza enorme, ma non se consideriamo che nel nucleo il DNA non è una molecola lineare, ma è organizzato in cromatina, e quindi 100mila coppie di basi potrebbe essere che nella struttura cromatinica stanno proprio vicino al promotore, e se non fosse proprio così ci sono dei meccanismi che avvicinano questi elementi che determinano la vera e propria attivazione della trascrizione apparentemente così distanti al promotore basale. Non ci sorprenderemmo se scoprissimo questi elementi anche a valle del promotore, o che si trovano al di fuori del gene, ma questo non è un problema, sempre perché la struttura cromatinica negli eucarioti è determinante nei processi della trascrizione. Finora abbiamo parlato di elementi, ovvero di sequenze di DNA, ma come funzionano questi elementi in cis? Affinché loro possano funzionare serve l'elemento in trans, ovvero fattori, proteine. Ora, ci sono diverse categorie di proteine che contribuiscono al processo della trascrizione; vedremo oggi che al promotore basale si legano una serie di fattori che si chiamano fattori generali della trascrizione oppure fattori basali, detti così perché senza di loro la trascrizione certamente non avverrebbe perché se non venisse reclutata l'RNA polimerasi la trascrizione non potrebbe mai avvenire, quindi questi fattori generali garantiscono il reclutamento della RNA polimerasi. Poi c'è un'altra categoria di fattori che legano siti, vicini o lontani, che sono diversi dal promotore generale, quindi sono altri elementi in cis che possono essere dispersi o raggruppati (di solito si presenta la seconda ipotesi), e questi raggruppamenti definiscono gli enhancer.| fattori che vi si legano, non sono i fattori generali, ma le proteine attivatrici del gene. Le proteine attivatrici legano dunque il DNA, ma poi attraverso un'altra porzione della proteina legano dei fatto. intermedi, che in generale si chiamano coattivatori, che sono delle proteine di natura diversa, che stanno in mezzo tra i fattori generali e le proteine attivatrici. Un coattivatore molto famoso ed emblematico è un complesso molecolare enorme fatto da 30 proteine diverse presente nelle nostre cellule e sichiama mediatore. Coattivatore e mediatore ci fanno pensare che queste proteine collegano in maniera strutturale, perché formano un tutt'uno, e funzionale, perché se non ci fosse questo tramite la trascrizione non potrebbe avvenire. Quindi ricapitolando, le categorie di fattori sono le seguenti: *Fattori generali; *Proteine attivatrici; *Coattivatori Però manca ancora qualcosa: quando deve avvenire la trascrizione di un gene la cromatina deve essere rilassata. E allora, affinché la cromatina si apra intervengono una serie di attività che vanno ad agire sugli istoni, modificandone il codice istonico, e poi ci sono delle proteine che fanno parte dei cosiddetti complessi di rimodellamento. Queste sono due attività diverse, ma entrambe possono contribuire ad aprire o a chiudere la cromatina, perché l'identità cellulare non è solo dovuta ai geni che quella cellula esprime, ma anche da quelli che non vengono espressi. Quindi non solo è importante l’attivazione nella trascrizione, ma anche la repressione, e sono due aspetti importanti nella regolazione. | siti a distanza possono stare vicini o lontani dal sito del promotore perché c'è un'interruzione, si possono trovare a monte, ma si possono trovare anche a valle. Genericamente chiameremo questi siti enhancer, anche se su questo termine potremmo fare delle precisazioni. Come funzionano questi siti? Vi si legano delle proteine. Vediamo nel dettaglio quali sono le proteine che si legano agli enhancer: abbiamo già detto che possiamo definirle come proteine attivatrici del gene (o fattori trascrizionali più in generale), e come tutte le proteine anch'esse possono essere fatte da domini, quindi porzioni indipendenti nella struttura che però fanno il gioco del fattore che le contiene. | domini tipici di una proteina attivatrice sono il dominio di legame al DNA, che garantisce alla proteina di riconoscere sequenze specifiche; un altro dominio è il cosiddetto dominio di attivazione: ricordate che per far avvenire la trascrizione serve quello che succede sul promotore basale e quello che succede sul sito a distanza, ma poi ci vuole qualcosa in mezzo, e questo qualcosa sono proprio le proteine coattivatrici che vengono reclutate sul punto specifico grazie a Interazionitra proteine. Tutto questo comporta una stabilizzazione maggiore dell'interazione tra TFIID e il DNA e quindi un posizionamento efficace per lPRNA polimerasi: se questo enzima deve compiere una trascrizione sostenuta di un determinato gene, necessariamente un’altra RNA polimerasi dovrà cominciare la trascrizione, altrimenti la trascrizione avrà tempi troppo lunghi. Inoltre, le officine per la trascrizione nella cellula per un determinato gene sono le due copie presenti nel nucleo, e da queste due copie devono potersi generare migliaia di molecole di mRNA per produrre milioni di molecole di proteine. E quindi queste due officine devono lavorare senza sosta, quindi va garantito che una volta che si aperta la struttura cromatinica, l'RNA polimerasi possa essere reclutata efficacemente, in maniera continua e a questo contribuisce la stabilizzazione dei fattori generali sul promotore. Quindi ci sono due motivi di stabilizzazione: *Interazione tra gli elementi che si legano alla TATA BOX; *Riconoscimento da parte dei bromodomini sugli istoni acetilati in prossimità del promotore. Adesso vediamo in che modo possiamo avere meccanismi di attivazione trascrizionale. Quindi, consideriamo un promotore basale e un enhancer, ovvero il sito di legame per l'attivatore, che sono legati dalle rispettive proteine: sul primo si legano i fattori generali, sul secondo la proteina attivatrice. Vediamo che questa proteina attivatrice stabilizza i fattori generali della trascrizione; pure prima abbiamo visto una stabilizzazione dei fattori generali, mediata dalla capacità di TFIID, e della sua subunità TAF 1, di riconoscere le lisine acetilate. C'è un'altra possibilità che garantisce la stabilizzazione di queste proteine: in alcuni promotori le stesse proteine attivatrici riescono a trattenere | fattori generali; ma in altri promotori ci vogliono altre proteine, che sono proprio i coattivatori, che trattengono i fattori generali al loro posto. Il mediatore poi funzione anche con un'altra modalità, perché può legare la RNA polimerasi e portarla proprio lui stesso, ponendosi come alternativa al fattore generale TFIIF. Come vedete quindi non esiste un unico meccanismo, ma ce ne sono diversi che devono adattarsi almeno a 20 000 geni diversi. AI di là del meccanismo considerato, bisogna sempre garantire: la corretta esposizione della struttura cromatinica, la stabilizzazione dei fattori generali sul promotore, in modo da poter richiamare la RNA polimerasi; se necessario un'attivazione sostenuta della trascrizione di questo gene, questi fattori devono essere opportunamente stabilizzati. A monte di tutto questo possiamo dire che nella trascrizione servono sia dinamiche che si verificano sul promotore basale, sia dinamiche che si verificano a distanza, considerando che comunque tra i due siti c'è Interazione. Facciamo un esempio specifico che per primo ha descritto l’interpretazione del codice istonico. Il modello che fu studiato intorno al 2001 era il gene dell'interferone fi. Gli interferoni sono delle citochine (piccoli peptidi) che intervengono nei meccanismi dell'immunità primaria. Quando una cellula viene infettata da un virus si attiva il pathway che produce l’interferone. Ci sono tanti tipi di interferoni, ma quello che è prodotto da tutte le cellule è proprio quello ditipo f. Ciò che praticamente fa l'interferone } è ammazzare le cellule. PARADOSSO: la cellula è infettata dal virus, produce interferone fi, ammazza se stessa e siccome l'interferone f esce al di fuori della cellula, ammazza anche le cellule adiacenti. Questo meccanismo però fa bene, perché evita che il virus possa propagarsi in altre cellule. Nell'economia generale del tessuto, la morte della singola cellula è spesso necessaria più della sua stessa vita. Il gene dell'interferone f viene attivato quando avviene l'infezione, quindi è tenuto molto nascosto nella struttura compatta della cromatina. Vediamo com'è fatta la regione di controllo del gene: l'enhancer si trova a brevissima distanza rispetto al sito di inizio della trascrizione, quindi tutto si gioca in questa regione di un centinaio di basi dove si verificano sia i meccanismi basali che quelli di attivazione della trascrizione. In una posizione strategica c'è un nucleosoma, che nasconde il sito di inizio della trascrizione del gene, quindi l'iniziatore si trova a contatto col nucleosoma, e in questa conformazione il gene è inaccessibile, dunque represso, perché non c'è il sito di inizio della trascrizione. Quando c'è un'infezione virale, ci sono dei fattori che si legano all’enhancer, ma non basta un solo fattore. Ancora una volta questo è un controllo stretto perché la trascrizione di questo gene non deve essere una cosa facile, altrimenti la cellula rischierebbe di morire inutilmente. Allora si parla di un controllo effettuato a più livelli. Queste proteine legate all'enhancer formano un complesso che si chiama enhanceosoma, dove sono esposti i vari domini di attivazione di questi fattori, che attirano una proteina, GCNS, che è una acetilasi dell'istone. Questa acetilasi può legarsi solo quando l'enhanceosoma è completamente assemblato, e il suo legame comporta sia l'acetilazione delle lisine sull’istone H3 (lisina 9) che sull’istone H4 (lisina 8), che sono presenti in duplice copia. C'è inoltre una chinasi che fosforila la serina 10 dell'istone H3 da una parte e dall'altra. Arriva un'altra acetilasi che modifica la lisina 14 dell’istone H3. Quindi in questo meccanismo avviene prima un riconoscimento del codice del DNA a cui segue la modificazione di un codice istonico mediante i writers. Ora servono i readers del codice. Per far formare l'enhanceosoma servono delle proteine, denominate fattori architetturali: HMG sono delle proteine attivatrici del gene la cui funzione simile a quella di TBP, ovvero ripiega il DNA. Qual è la logica di questa funzione? È che l'enhanceosoma si deve costruire ordinatamente e progressivamente, e se II DNA non si modifica, l'enhanceosoma non si stabilirebbe mai. Ricapitolando, stiamo integrando un codice di DNA, quindi il codice di riconoscimento di sequenze di DNA da parte di fattori proteici, e un codice di modifiche degli istoni. L'esito finale è che arriva TFIID, che possiede due bromodomini, e un complesso di rimodellamento della cromatina che fa scivolare in avanti il nucleosoma e quindi espone le sequenze che prima erano nascoste, tra cui c'è la TATA BOX. E quindi TFIID non solo può posizionare i bromodomini sulle lisine acetilate, ma può stabilizzarsi anche grazie al legame con la TATA BOX. D'altra parte anche il complesso di rimodellamento della cromatina possiede dei bromodomini per cui questa combinazione di acetilazioni viene riconosciuta dal complesso, che determina lo srotolamento e la possibilità per TFIID di legarsi pienamente. Una volta arrivata TFIID, richiama TFIIB, poi TFIIF con la RNA polimerasi, probabilmente il mediatore, e quindi la trascrizione può cominciare. Questo meccanismo è sufficientemente stretto quando non serve l'espressione del gene, ma quando serve, nel giro di alcune ore, si attiva per la trascrizione del gene. Questa una dinamica complessa che impiega circa 6 ore perché la cellula deve prendere una decisione cruciale, quindi c'è bisogno che arrivi una serie di segnalazioni tali che ne giustifichino il suicidio. Il segnale chimico dell'interferone f può essere riconosciuto dalla cellula stessa (meccanismo autocrino), ma anche dalle cellule adiacenti (meccanismo paracrino). Questo meccanismo infine ci fa capire come i controlli possano essere stretti, ma anche efficaci. Per far cominciare la trascrizione di un gene cosa deve funzionare per prima? Il meccanismo basale o quello a distanza? Quello a distanza. Per tanto tempo si è sempre creduto il contrario, perché si erano scoperti prima i meccanismi basali. Invece la dinamica oggettiva prevede che si verifichi prima qualcosa a distanza che poi vada sui promotori basali. Quindi a distanza una proteina attivatrice deve riconoscere l'enhancer e ci sono varie possibilità per queste proteine attivatrici di legarsi alle sequenze specifiche. Non detto che questa proteina attivatrice sia capace di legare il suo sito specifico nel modo diretto in cui essa è prodotta. C'è tutta un'altra serie di regolazioni che insiste proprio sulla proteina attivatrice. Ci sono diverse modalità di attivare gli attivatori. Innanzitutto una proteina attivatrice in una cellula potrebbe non esserci e ciò causerebbe la non attivazione del gene, perché non c'è nessuna proteina che si lega all'enhancer. Quindi questa proteina dev'essere prodotta. Ci sono delle proteine attivatriciche vengono prodotte soltanto quando è necessario. L'omeodominio che abbiamo precedentemente descritto è tipico di fattoritrascrizionali che sono fondamentali per lo sviluppo e quindi vengono attivati solo in questa specifica fase per poi essere silenziati. L'omeodominio è un concetto molto importante neitermini dello sviluppo ed è stata scoperta la sua importanza in Drosophila: avete mai sentito di questi moscerini che hanno le zampe al posto degli occhi? Queste sono mutazioni generate apposta per dimostrare che quel fattore serviva a formare le zampe in un determinato punto del corpo. E questi fattori sono codificati dai geni omeotici. Una proteina in conformazione inattiva presente nella cellula potrebbe cominciare a funzionare: *Quando c'è un ligando che la attiva cambiando la sua conformazione (caso molto frequente), gli ormoni sessuali funzionano proprio con questo meccanismo; *Mediante fosforilazione della conformazione inattiva; *Quando si forma un dimero, con l'aggiunta di una seconda subunità; *Mediante fosforilazione dell’inibitore che trattiene la proteina, rendendola inattiva (è il caso di NFKB, che è legata all'inibitore KB. Quando arriva lo stimolo, che può essere un'infezione virale o uno stress cellulare, vi è la fosforilazione dell'inibitore, che viene allontanato o addirittura degradato, e la proteina può attivarsi); *Trasporto mediato attraverso una barriera nucleare; “Rilascio mediante la membrana. Tutti questi sono meccanismi di regolazione dell'attività di fattori trascrizionali. Un esempio specifico è quello dei recettori degli ormoni steroidei. Questi recettori sono una particolare categoria di Zinc Finger, in cui ci sono due dita però fanno cose diverse: rispetto ai primi che abbiamo citato, qui ci sono 4 cisteine, e si dice C2C2 per distinguerli da C2H2. Qual è la funzione di questi domini? Quello N-terminale possiede una regione ad a-elica che si adagia sul solco maggiore. Però questi fattori funzionano come dimeri, e infatti lo Zinc Finger C-terminale genera un'interfaccia (1h 37min, non ho capito). La proteina può essere un omodimero o un eterodimero. Questi fattori hanno almeno tre domini diversi: c'è il DNA binding domain, dominio di attivazione, dominio dilegame al ligando. In caso di conformazione inattiva ci sono delle proteine cellulari, SP 90, che tengono sequestrato il fattore. Quando arriva l'ormone, diffonde per quello che può nel citoplasma e quando incontra il recettore lo può trasportare nel nucleo, dove trova i suoi elementi di risposta, che non sono altro che elementi in cis, e si attiva così la trascrizione dei geni interessati. Abbiamo detto che l'identità della cellula è determinata da geni che vengono espressi, ma anche da quelli che non vengono espressi. Così come c'è l'attivazione della trascrizione, c'è anche la sua repressione. Vediamo come si possono applicare questi meccanismi. Prima di tutto: i complessi di rimodellamento della cromatina non solo espongono le sequenze, ma le nascondono. Ci sono quindi complessi di rimodellamento che lavorano al contrario, attraverso simili modalità. In questo caso la proteina che promuove questo tipo di attività non è quella attivatrice, ma è il repressore trascrizionale. Un'altra modalità di reprimere la trascrizione, in cui si ritorna ad una condizione di partenza, sono le attività complementari alle acetilasi degli istoni che fanno ritornare quella regione di DNA silente agendo sugli istoni, in particolare deacetilandoli. Ricordate quando ho parlato di farmaci epigenetici? Non sono altro che inibitori di deacetilasie trovano applicazione in campo oncologico. I meccanismi che agiscono sulla cromatina, come quelli che abbiamo descritto finora, sono meccanismi epigenetici.