Trascrizione del DNA e regolazione della trascrizione, Appunti di Biologia Molecolare

Scarica Trascrizione del DNA e regolazione della trascrizione e più Appunti in PDF di Biologia Molecolare solo su Docsity! TRASCRIZIONE E REGOLAZIONE NEGLI EUCARIOTI I procarioti hanno una sola RNA-polimerasi a dopo. Negli eucarioti invece esistono almeno tre differenti RNA polimerasi. Ognuna delle tre RNA polimerasi funzione specifici che riconoscono elementi in cis sul DNA nella regione del promotore. Infatti nei batteri la polimerasi si lega al promotore e riconoscendo brevi sequenze consenso che si trovano molto vicine al sito d'inizio della trascrizione. Negli eucarioti invece, la RNA polimerasi non è praticamente in grado di legarsi da sola al promotore e il ruolo dei fattori di trascrizione è essenziale per il suo reclutamento. Un'altra differenza fondamentale tra eucarioti e procarioti è che mentre nei batteri i geni sono organizzati operoni e trascritti come mRNA policistronici, negli eucarioti ogni gene è regolato e trascritto singolarmente. TRE SISTEMI DI TRASCRIZIONE NEL NUCLEO Le varie RNA polimerasi eucariotiche sono specializzate nel trascrivere classi diverse di geni. RNA polimerasi 1 trascrive i geni per l'rRNA ed è localizzata principalmente nel nucleolo. Le rene a polimerasi 2 trascrivi i precursori degli mRNA e i piccoli RNA implicati nella regolazione post trascrizionale. Questa è localizzata nel nucleoplasma. La RNA polimerasi 3 trascrive i geni per rRNA 5S, per i tRNA e per piccoli RNA coinvolti nella formazione di molecole di mRNA maturo. Anche questa è localizzata nel nucleoplasma. Nelle piante esistono altre due RNA polimerasi non essenziali per la vita delle cellule, PolIVa e PolIVb, che hanno ruolo importante in diversi aspetti del controllo del silenziamento dei geni. Via della polimerasi orario distinguibili sperimentalmente sulla base della loro sensibilità all' alfa-amanitina, una potente tossina prodotta dal fungo Amanita phalloides. La RNA polimerasi più sensibile è Pol2, resistente Pol1. Le polimerasi eucariotiche sono costituite da circa 12 su che formano un complesso proteico con una dimensione superiore ai 500 kDa. Ma tu sei tra queste subunità ne distinguiamo alcune che sono omologhe alle subunità beta 1, beta, alfa 1, alfa 2 e omega dell'enzima procariotico. Si tratta quindi di subunità presenti in tutte le RNA polimerasi. I tre enzimi eucariotici hanno inoltre in comune alcune subunità che mancano invece nella polimerasi procariotica. Infine virgola certo numero di altre subunità sono specifiche per ciascuno dei tre enzimi eucariotici. Una caratteristica che contraddistingue la RNA polimerasi II rispetto alle altre polimerasi è la presenza del CTD (C-terminal domain virgola C-terminale) della subunità rpb1. Questo CTD consiste di una lunga coda C terminale non strutturata costituita da ripetizioni della sequenza Tyr-Ser- Pro-Thr-Ser-Pro-Ser. Il CTD ha un ruolo fondamentale nella formazione del complesso di inizio di trascrizione e del distacco dell'anima dal produttore. Il numero di ripetizioni di questa sequenza è importante: Infatti mutazioni che fanno perdere più della metà di queste sequenze sono letali in vari sistemi biologici. La somiglianza strutturale delle diverse RNA polimerasi eucariotiche fa pensare che questi enzimi siano originati da geni codificanti per subunità ancestrali che si sono poi specializzate nelle funzioni di ciascun enzima. RNA polimerasi II deve essere in grado di trascrivere un numero elevato di geni diversi, RNA polimerasi I deve produrre in quantità abbondante una sola specie di trascritto, infine la RNA polimerasi III deve produrre molte copie dei tRNA e del 5S RNA. Tuttavia, la funzione catalitica di tutti questi enzimi, cioè l'aggiunta progressiva di nucleotidi a catene crescenti di RNA, è meccanismo molto conservato deducibile dal grado di conservazione e somiglianza del sito attivo di tutte le RNA polimerasi sia procariotiche che eucariotiche. Le RNA polimerasi eucariotiche non sono in grado da sole di riconoscere e legare i loro promotori. Hanno bisogno di fattori addizionali che permettono il riconoscimento degli elementi in cis del promotore e il successivo reclutamento dei rispettivi enzimi. Questo è valido per tutte e tre le RNA polimerasi: esistono quindi fattori specifici per ciascuna di esse. RNA POLIMERASI I La RNA polimerasi I trascrive esclusivamente i geni per gli RNA ribosomiali. Negli eucarioti questi geni sono presenti in copie multiple e sono separati da spaziatori che contengono, ciascuno, il promotore del gene a valle. A partire da questo promotore viene trascritta una molecola di RNA precursore che contiene i grandi e piccoli rRNA che sono successivamente separati tra di loro. Il promotore è costituito da due regioni: Contratto che si sovrappone al sito di inizio della trascrizione TSS che costituisce il nucleo del promotore è un elemento più a monte, chiamato elemento UPE o UCE. Il cuore è ricco di basi G-C nella regione tra - 40 e -20, mentre intorno alla regione di inizio e ricco di basi A-T. Anche l'elemento UPE ricco di basi G-C. La formazione del complesso di inizio richiede almeno due fattori trascrizionali ausiliari, chiamati Upstream Binding Factor (UBF) e SL1. UBF è una proteina che si lega al DNA condomini multipli e interagisce direttamente con il core del promotore e con l'elemento UCI. La regione C terminale di UBS è necessaria attivazione della trascrizione ed è ampiamente fosforilata. SL1 è un complesso multiproteico che comprende la TATA Binding Protein (TBP) e altri fattori associati specifici per Pol I. SL1 non si lega al DNA riconoscendo una sequenza specifica, ma il suo reclutamento sul promotore è immediato da interazioni specifiche con UBS. Una volta posizionato sul promotore, sL1 contatta direttamente il DNA e promuove la trascrizione, reclutando Pol I. Un dimero di UBF si lega sia a UCE che al core del promotore, promuovendo la formazione di un Ansa sul DNA. A questo punto interviene SL1 che richiama Pol I sul promotore e la sintesi del rRNA puoi iniziare. RNA POLIMERASI III La RNA polimerasi III trascrive i geni per i tRNA e per l'rRNA 5S utilizzando promotori interni(che si sovrappongono cioè alle regioni trascritte) e che contengono degli elementi di controllo(box). Esiste anche un terzo tipo di promotore per l'RNA polimerasi 3 che promuove la trascrizione dei piccoli RNA nucleari(snRNA) e che contiene elementi di controllo tra cui un tipico elemento TATA. Oltre a questa sequenza, permette il legame specifico di TBP, può contenere anche gli elementi Oct e PSE che aumentano l'efficienza della trascrizione. Come funzionano i promotori che si trovano a valle del sito di inizio della trascrizione? Nel caso dei tRNA il fattore TFIIIC si lega agli elementi interni denominati box a box B. Questo legame richiama sul promotore TFIIIB composto da diverse subunità tra le quali TPB. La formazione di questo complesso richiama la RNA polimerasi 3 sul TSS. Nel caso del gene per l'rRNA 5S, il fattore specifico TFIIIA si lega specificamente alla box A. TFIIIA permette il posizionamento di TFIIIB sul sito d'inizio della trascrizione. TFIIIC e TFIIIA sono dei fattori assemblaggio il cui compito è di posizionare in modo corretto TFIIIB sul TSS. La funzione di TBP, che fa parte di TFIIIB, e di reclutare la RNA polimerasi 3 sul sito di inizio.TBP si lega al DNA e lo piega di 80 gradi. Nel caso dei promotori conseguenze di controllo a monte del sito di inizio TFIIIB è in grado di legarsi da solo, quanto riconosce l'elemento TATA, vicino il sito d'inizio della trascrizione. RNA POLIMERASI II struttura promotore: La situazione per la RNA polimerasi II è molto più complessa. Il promotore è in genere molto più lungo il numero di fattori di trascrizione richiesti è molto più elevato. Vengono identificati essenzialmente due gruppi di fattori di trascrizione. Il primo gruppo, costituito da una serie di proteine chiamate fattori basali o generali è richiesto per reclutare la RNA polimerasi su tutti i promotori di Pol II informare il complesso di inizio. La Feria polimerasi 2 associata a questi fattori costituisce l'apparato basale. Il secondo gruppo di fattori è costituito da proteine che sono responsabili della regolazione della trascrizione, come attivatori che come repressori. La struttura dei promotori di Pol II comprende varie importanti sequenze che operano in cis. Il promotore minimo(core promoter) di PolII è costituito dal tratto di DNA indispensabile per permettere ai fattori basali di fare iniziare la trascrizione. Tale promotore video copiare l'elemento chiamato iniziatore o INR da cui parte la trascrizione iniziando su un nucleotide, generalmente A, che viene detto TSS. Un altro elemento molto importante una sequenza posizionata a circa meno 26 dal sito di inizio e chiamata TATA box(TATAAA). tale sequenza è preceduta da un altro elemento chiamato BRE che permette il legame del fattore basale TFIIB. a valle del TSS vi possono essere altri elementi che caratterizzano un promotore. Un elemento chiamato DPE è tipicamente presente in quei promotori che non contengono la TATA box, chiamati TATA-less. Invece l'elemento DCE può essere presente in più copie dei promotori contenenti la TATA box. Altri elementi che sono presenti nel promotore sono le isole CpG. Oltre agli elementi che costituiscono il promotore minimo la RNA polimerasi II contiene elementi localizzati fino a 200 pb a monte del sito di inizio (elementi prossimali) ed elementi più distali chiamati enhancer, che possono essere posizionati fino a 10 kpb dal sito di inizio. inaccessibili o disponibili sequenze di DNA con cui interagiscono le RNA polimerasi e le proteine regolative che ne influenzano l'attività. Meccanismi che regolano la trascrizione della RNA polimerasi II: Tale regolazione si realizza attraverso l'integrazione dei ruoli di numerose proteine, generalmente chiamate fattori di regolazione, che, controllando sia positivamente che negativamente la trascrizione di geni specifici, sovrintendono al normale funziona della cellula, al differenziamento dei vari tessuti, allo sviluppo di un organismo. La funzione di molti regolatori è, a sua volta, influenzata da stimoli esterni, permettendo così all'organismo di reagire a specifici segnali. Questo complesso apparato di attivatori, coattivatori e repressori permette il controllo della trascrizione della maggior parte degli mRNA, sia stimolando e aumentando il livello basale di trascrizione, che modificando lo stato della cromatina, cosicché le regioni di controllo di specifici geni diventino accessibili all'apparato trascrizionale solo in determinati momenti della vita della cellula e dell'organismo. REGOLAZIONE GENICA A LIVELLO TRASCRIZIONALE. La regolazione genica a livello trascrizionale avviene attraverso il legame di fattori proteici a sequenze nucleotidiche di regolazione. I fattori proteici impegnati a regolare l'espressione genica agiscono in trans legandosi alle sequenze che sono in prossimità del genere (in cis). Regolazione della trascrizione genica: 1) Il macchinario generale (basale) della trascrizione, costituito dai diversi componenti delle complesse macchine multiproteiche delle RNA pol, necessari per il riconoscimento del promotore e la catalisi della sintesi di RNA 2)I fattori di trascrizione (TF), proteine che legano specifiche sequenze di DNA mediando l’attivazione o la repressione della loro trascrizione 3)I coattivatori ed i corepressori trascrizionali, proteine che fanno aumentare o diminuire l’attività trascrizionale attraverso interazioni proteina-­proteina, senza legarsi direttamente al DNA Struttura modulare dei promotori eucariotici: Un promotore di PolII costituito da vari elementi che si possono suddividere in due gruppi distinti: Quelli prossimali al sito della inizio della trascrizione, qui si legano i fattori basali di trascrizione, la polimerasi e alcuni attivatori, e quelli di stadi ai quali si legano i fattori di regolazione della trascrizione. Anche nella regione prossimale del promotore visuale elementi sul DNA che legano attivatori e recettori negli eucarioti multicellulari il promotore e ricco di sequenze regolatrici costituite da parecchi elementi prossimali. Queste sequenze di DNA sono state individuate attraverso esperimenti di mutagenesi sito- specifica nella regione del promotore usando un gene reporter per saggiare l'attività trascrizionale. Un promotore eucariotico viene posizionato a monte del gene che codifica per la GFP (proteina fluorescente verde) è il plasmide che contiene questo costrutto è trasferito in cellule eucariotiche in coltura. Una serie di mutazioni che coprono la regione prossimale permette di individuare le sequenze del promotore su cui si legano i fattori basali e di regolazione essenziali per la sua trascrizione. I segni di riconoscimento prossimali nel promotore sono formati da sequenze nucleotidiche che si presentano a blocchi (box). Per esempio la CAAT box e la GC box. Alla CAAT box si lega il fattore trascrizionale CBF (CAAT binding protein). la CAAT box può funzionare in entrambi gli orientamenti e si ritiene che influenze l'efficienza di un promotore. Alla GC box si lega il fattore SP1 presenti in molti organismi compreso l'uomo e che è coinvolto in l'espressione di molti geni necessari le cellule, definiti housekeeping. Un'altra frequente sequenza di risposta è l'ottamero (Oct) costituito da 8 pb. A questo elemento si lega la proteina Oct-1 che è un attivatore che agisce su molti promotori, come quelli per l'attivazione del gene per listone H2B. Gli elementi distali che si chiamano Enhancer (significatori entesi contengono molti elementi o sequenze di riconoscimento alle quali si legano i fattori di trascrizione perlopiù con funzione attivatrice. Gli attivatori legati a un Enhancer formano un complesso denominato Enhanceosoma. Questo complesso proteico entra in comunicazione con le Regioni prossimali del promotore, attraverso la formazione di un Ansa sul DNA, allorché gli attivatori legati all'enhancer interagiscono con il mediatore, che a sua volta richiama la RNA polimerasi II e ne facilita il legame ai fattori basali di trascrizione. Questi elementi CIS-agenti sono di solito posizionati a 700-1000 pb dal sito di inizio della trascrizione, hanno una lunghezza intorno alle 500 pb e contengono in media 10-12 siti di legame per fattori di trascrizione diversi. Alcune caratteristiche degli Enhancer sono: I. Possono funzionare in entrambi gli orientamenti rispetto alla direzione della trascrizione. II. Possono trovarsi sia a monte che a valle del gene che controllano. III. Possono essere localizzati negli introni e dello stesso gene che viene controllato. La specificità della trascrizione può quindi essere controllata sia dalla regione del promotore che dal Enhancer. In alcuni casi, la specificità trascrizionale è data dalla regolazione a livello del promotore e l'enhancer è usato per aumentare il livello del Messaggero prodotto. In altri casi, il promotore del gene è attivato solo se l'enhancer che lo controlla è a sua volta attivato. Oltre agli enhancer esistono elementi definiti silencer che funzionano in modo simile legando, invece che attivatori, repressori della trascrizione. Come gli Enhancer possono trovarsi a valle oa monte dei geni che controllano. Possono agire in modi diversi: Possono mascherare la regione di attivazione ha gli attivatori ho competere con il legame sul mediatore. Un altro gruppo di elementi di controllo che agiscono in cis sul DNA è rappresentato dagli isolatori. Gli elementi sono posizionati in modo da influenza relazione degli Enhancer contigui. Sono utilizzati per isolare in una direzione l'azione di un Enhancer che potrebbe influenzare due promotori diversi. Gli isolatori hanno una doppia funzione: Agiscono impedendo l'attivazione o la repressione di un gene da parte di un Enhancer o di un silenzio; agiscono come marcatori di confine tra una zona di eterocromatina è una zona di eucromatina. Il quadro generale della distribuzione degli elementi in cis sul DNA e del legame a tali sequenze regolatori trascrizionali sia nelle regioni prossimali che distali dei promotori, mette in evidenza la natura combinatoria della regolazione della trascrizione negli eucarioti. la funzione di regolatori tessuto-specifici o di risposta a stimoli si integra con quella di attivatori generali e fattori basali nel controllare con precisione e senza ambiguità la trascrizione di un determinato gene. Questo meccanismo combinatorio è il risultato dell'esame estremamente specifico sulla DNA degli attivatori trans- agenti. (*) enhanceosome dell’interferone beta (stampa slide in inglese di flavia e vedi dopo) Fattori di trascrizione (trans- attivatori): Gli attivatori della trascrizione degli eucarioti sono proteine modulari in cui domini con funzioni diverse vengono assemblati per formare molecole funzionali. I principali domini sono tre: Dominio di legame al DNA, dominio di trans attivazione, dominio di dimerizzazione che permette agli attivatori di legarsi al DNA come dimeri. Inoltre possono essere presenti ulteriori domini: Dominio di localizzazione nucleare (NLS), dominio di esportazione nucleare (NES), dominio di legame a ligandi che è presente se l'attivatore funziona in risposta a degli stimoli. Questo dominio permette al attivatore di legare il ligando specifico per l'attivazione del gene che è sotto il controllo dello stimolo. Uno degli attivatori trascrizionali eucariotici più studiati, e che ha servito come modello a tutti gli altri, e la proteina Gal4 che richiesta per attivare la trascrizione dei geni per l'utilizzo dello zucchero galattosio nel lievito S. Cerevisiae, legandosi al promotore del gene GAL1. Gal4 si lega a 4 siti che contengono ciascuno una sequenza di 17 nt e che fanno parte della regione UAS, situata a circa -270 pB a monte del sito d'inizio della trascrizione del gene GAL1. In presenza di Gal4 la trascrizione di tale gene aumenta di circa 1000 volte. Due esperimenti hanno chiarito il funzionamento di Gal4 mi hanno definito la natura generale degli attivatori della trascrizione negli eucarioti. Usando come reporter il gene batterico per la beta-galattosidasi (lac Z) è stato possibile analizzare gli effetti di diverse proteine artificiali che avevano come base la proteina Gal4. Gal4 wild type si lega al suo sito specifico e attiva la trascrizione del gene lac Z. Ciò è facilmente visibile perché le cellule delle colonie di lievito in cui sono presenti i vettori che contengono il gene reporter e le varianti di Gal4 da studiare diventano di colore blu se il gel e Lac Z viene espresso. Se si elimina la regione che contiene il dominio di attivazione trascrizionale, Gal4 si lega al DNA, ma non è in grado di attivare la trascrizione. Con questo esperimento è stato individuato il dominio di attivazione trascrizionale di Gal4. Un secondo esperimento ha permesso di dimostrare che il dominio di legame al DNA è il dominio di attivazione di un fattore trascrizionale sono distinti e funzionalmente intercambiabili. Davanti al gene reporter LacZ è stata posta la sequenza di DNA riconosciuta dal repressore batterico LexA. Una proteina artificiale in cui il dominio di legame al DNA di Gal4 è stato sostituito dal dominio di legame al DNA di LexA può legarsi alla sequenza di DNA riconosciuta da LexA, ma non può attivare la trascrizione in quanto priva del dominio di attivazione trascrizionale. Se però si riesce a produrre una proteina ibrida contenente il dominio di legame al DNA di LexA fuso al dominio di attivazione trascrizionale di Gal4, la trascrizione viene attivata normalmente. In questo esperimento un repressore batterico è stato trasformato in un attivatore eucariotico e dimostra che gli attivatori della trascrizione sono composti da due domini separati. Esperimenti di "domain swap" mostrano che i domini sono intercambiabili. Si può fondere il dominio di legame al DNA (DBD) di un fattore di trascrizione con il dominio attivatore (AD) di un altro fattore. (Nell'esperimento è stato usato DBA di LexA e AD di Gal4). In questo modo un gene bersaglio viene posto sotto il controllo del sito di legame al DNA del primo fattore. Gli attivatori della trascrizione agiscono aumentando la velocità è il numero di trascritti prodotti da un determinato. Gli attivatori possono: - stimolare il reclutamento dei fattori basali della trascrizione di Pol II per formare il complesso di preinizio. - modificare i fattori di trascrizione sia a livello estetico che mediante modificazioni post traduzionali. - interagire con il promotore del gene che deve essere trascritto e richiamare i complessi di rimodellamento e modificazione della cromatina, per liberare la regione del promotore dei nucleosomi e permettere la formazione del complesso di inizio. Queste funzioni realizzano tramite interazioni proteina- proteina tra gli attivatori e i loro specifici interattori, quali proteine che fanno parte del complesso del mediatore, la polimerasi stessa o altri fattori trascrizionali. Gli attivatori inoltre rispondono a stimoli esterni che possono provocare modificazioni conformazionali nella proteina rendendo così disponibile il dominio di attivazione. DOMINI FUNZIONALI DEI TRANSATTIVATORI: DOMINI DILEGAME AL DNA Vediamo le strutture proteiche più frequentemente identificate nei domini di legame al DNA degli attivatori trascrizionali. Questi domini sono costituiti, nella maggior parte dei casi, la struttura ad Alfa elica che riconoscono la sequenza specifica di DNA interagendo con il solco maggiore della doppia elica. Tale solco avendo più atomi in grado di ricevere o donare legami idrogeno, ha un linguaggio più ricco del solco minore per formare legami ad alta affinità con i residui amminoacidici che si affacciano sul Alfa elica. Le interazioni specifiche tra DNA e proteine sono dovute principalmente legami idrogeno e a interazioni idrofobiche che la proteina forma con la sequenza di DNA. È stato osservato che il riconoscimento involge in genere sequenze di 3/7 PB sul DNA, mentre, per poter essere unica nel genoma umano una sequenza nucleotidica di riconoscimento dovrebbe essere lunga almeno 16 pb. In effetti la specificità di legame è aumentata dal fatto che gli attivatori dimerizzano e quindi le sequenze di riconoscimento sono costituite da elementi doppi sul DNA. La cristallografia a raggi X ha risolto negli ultimi vent'anni un numero molto grande di strutture di proteine che legano il DNA e confrontando questi domini gli attivatori sono stati raggruppati in diverse categorie. Elica- giro - elica e omeodominio: Il motivo elica giro elica (HTH) è stato uno dei primi a essere individuato negli studi tu i repressori batterci. La struttura genetica del motivo HTH è costituita da 3 Alfa eliche ripiegate in cui l'elica 3, chiamata anche elica R (di riconoscimento), si posiziona nel solco maggiore del DNA. I residui amminoacidici dell'elica R che si affacciano sul DNA interagiscono specificamente con le basi della sequenza di riconoscimento e la sostituzione di una di queste basi abbassa notevolmente l'affinità della proteina per quella sequenza. Esistono numerosissime varianti della struttura HTH. Una di queste è l'omeodominio (HD). Questo dominio è costituito da circa 60 amminoacidi ed è caratteristico dei regolatori dei geni omeotici che controllano lo sviluppo dell'intero organismo. È costituito da 3 Alfa eliche strutturate del nucleosoma è in grado quindi di legare proteine. Dottore specifico recluta sulla regione una istone acetiltransferasi (HAT) che, acetilando le code degli istoni continui, promuove l'apertura di tutta la regione del promotore, dove si può così formare il complesso di preinizio. Alternativamente il fattore specifico recluta sulla regione un complesso di rimodellamento della cromatina, o rimodellatore, che rende la zona del promotore accessibile al complesso di trascrizione. Analogamente a quanto accade per gli attivatori, esistono una serie di fattori che agiscono da repressori. Questi possono funzionare in vari modi: - possono competere per i siti di legame al DNA di un attivatore; - mascherare il dominio di attivazione attraverso interazioni proteina - proteina; - interagire con il mediatore e bloccare il complesso sul promotore; - reclutare delle deacetilasi rendendo più compatta e inaccessibile la cromatina. I repressori rappresentano elemento molto importante della regolazione genica negli eucarioti. Infatti possono reprimere la trascrizione di un gene fino a quando uno stimolo esterno, per esempio in attivando il repressore, non dia via libera ai vari attivatori specifici per quel gene. Attivazione e segnali: La regolazione genica negli eucarioti è legata alla capacità delle cellule di reagire a una grande varietà di stimoli e segnali esterni. Le cellule rispondono alla presenza di ormoni, fattori di crescita, gradienti di concentrazione di ioni, luce, contatti con altri tipi cellulari e così via. Queste sollecitazioni dall'esterno vengono spesso sentite da recettori, trasmessi al nucleo attraverso vie di trasduzione del segnale dov'è il messaggio attiva i geni appropriati per la risposta cellulare. In questa catena di eventi i fattori di trascrizione sono il passaggio finale delle vie di trasduzione del segnale dall'esterno all'interno. Tre esempi di attivazione della trascrizione genica in risposta a stimoli esterni: I recettori degli ormoni steroidei: Questa famiglia di attivatori trascrizionali ha una sequenza aminoacidica molto conservata, con il dominio di legame al DNA che appartiene al motivo a dita di zinco. Hanno inoltre un dominio di attivazione e un dominio di legame al ormone specifico, un Dominio di dimerizzazione e un segnale di localizzazione nucleare. I leganti che attivano questi fattori passano facilmente la membrana cellulare in quanto liposolubili e si legano direttamente agli attivatori corrispondenti. Gli ormoni steroidei, l'ormone della tiroide, la vitamina D e i retinoidi si legano a membri specifici di questa famiglia di attivatori permettendo il loro legame ai siti specifici sul DNA, a monte dei geni che sono sotto il loro controllo. Si legano a sequenze che permettono al recettore di legarsi come dimmelo. Dato l'elevato grado di conservazione della loro sequenza amminoacidica, alcuni di questi attivatori possono legarsi come eterodimeri con membri della stessa famiglia. La capacità di formare eterodimeri è importante per la possibilità di accoppiare la risposta degli ormoni con altre vie del segnale. In assenza del ligando, l'attivatore- recettore si trova nel citoplasma legato alla proteina Hsp90, la quale maschera il suo segnale di localizzazione nucleare. Dopo il legame con l'ormone, la proteina cambia conformazione e Hsp90 si dissocia permettendo al recettore di entrare nel nucleo dove si lega al DNA e attiva il gene bersaglio. Fattore CREB: Il ligando induce dei cambiamenti strutturali nel recettore, il quale innesca una serie di eventi che portano a una variazione dell'attività di trascrizione all'interno del nucleo. Una delle modificazioni che avvengono in seguito all'attivazione di una via di trasduzione del segnale è la fosforilazione di un attivatore che diventa attivo dopo questa modificazione. Un recettore a 7 eliche membrana che si trova sulla superficie di una cellula può essere attivato da uno stimolo che induce un cambiamento conformazionale nel recettore, l'attivazione di una proteina G che, a sua volta, attiva l'enzima adenilato ciclasi che produce AMP ciclico. Questa molecola attiva una proteina chinasi che, migrando nel nucleo, fosforila il fattore trascrizionale CREB richiesto per l'attivazione di Parigiani bersaglio. Crepes si lega al DNA come dimero, facendo parte della famiglia dei fattori trascrizionali con il motivo a cerniera di leucina. I geni regolati da crepe includono molti neuropeptidi come la somatostatina, encefalina, il ormone di rilascio della corticotropina. Crepes ha un ruolo molto importante nella plasticità dei neuroni è nella formazione della memoria a lungo termine. Fattore trascrizionale NF-kB: Le proteine della famiglia NF-kB sono coinvolte nella trascrizione di geni espressi in vari tipi di cellule. Una di queste proteine è presente nell'enhanceosoma dell'interferone-beta. NF-kB rimane sequestrato nel citoplasma tramite il legame con l'inibitore noto come I-kB finché una via di trasduzione del segnale non porta alla fosforilazione dell'inibitore e alla sua degradazione da parte del proteasoma. Dopo il distacco dal inibitore NF-kB è libero di migrare nel nucleo e di attivare la trascrizione dei geni bersaglio. Regioni di controllo del locus (LCR) Le LCR sono sequenze di DNA che organizzano e mantengono un dominio funzionale di cromatina attiva e fanno aumentare la trascrizione dei geni a valle. Siti ipersensibili (HS) alla DNasi a monte del gruppo dei geni della beta-globina. Le LCR sono presenti in altri loci genici fra cui: i gruppi di geni che codificano le beta-globine, i pigmenti visivi, le proteine del complesso maggiore di istocompatibilità, gli ormoni della crescita umani, le serpine, le citochine delle cellule T helper di tipo 2. L’intero locus dei geni della beta-globina occupa 200 kb. La LCR è necessaria per la trascrizione ad alto livello di tutti i geni della famiglia della -globina. La regolazione della formazione di “anse” di cromatina è il meccanismo che controlla l’espressione durante lo sviluppo dei geni della beta-globina. La LCR interagisce con un solo promotore genico alla volta, così da garantire l’espressione differenziale dei diversi geni durante lo sviluppo LCR (locus control region) • Analoghi agli enhancers ma agiscono in maniera orientamentodipendente • Organizzano e mantengono i domini funzionali della cromatina e incrementano la trascrizione dei geni, siti ipersensibili alla DNasi I Nello studio dei processi di regolazione dei geni globinici si è scoperto che ciascun gene presenta elementi regolatori individuali, e che l’intero gruppo è soggetto a un controllo ‘acceso-spento’ che comporta cambiamenti globali nella struttura della cromatina. In alcuni individui affetti da una forma di talassemia, nella quale i geni della famiglia β sono silenti, è presente una delezione di una sequenza di DNA di alcune migliaia di basi a monte del gene per la g. (fig. 2). Tale regione, chiamata LCR (locus control region), è coinvolta nella modulazione dello stato di rilassamento e condensazione della cromatina. Si ipotizza che questo locus del DNA offra siti di riconoscimento alle proteine che promuovono la generale apertura dell’intera regione, rendendo possibile l’accesso alla RNA-polimerasi e ai fattori di trascrizione gene- specifici. La LCR influenza la trascrizione non solo del gene della globina β ma anche degli altri geni globinici della regione. Nella LCR è presente un tipo di cromatina a struttura particolare, eccezionalmente sensibile alla DNasi, enzima/">enzima che è in grado di tagliare il DNA soprattutto nei punti più accessibili, quando la conformazione è più aperta. È stato osservato che regioni geniche attive mostrano siti ipersensibili alla DNasi (DHS, DNA hypersensitive sites). Per es., negli individui normali, dopo la nascita, spariscono i DHS davanti all’emoglobina ε e γ, entrambe non trascritte nell’adulto. Si pensa pertanto che i DHS siano gli elementi attivi della regione di controllo del locus nei quali si verifica l’allentamento dello stato condensato della cromatina e l’attivazione della trascrizione attraverso un’azione sui promotori dei singoli geni. (La talessemia corrisponde all’espressione difettiva di uno o più geni globinici) Le LCR sono sequenze di DNA che organizzano e mantengono un dominio funzionale di cromatina attiva e potenziano la trascrizione dei geni a valle. Locus della famiglia dei geni della beta globina: Questo locus codifica la globin embrionale le due globine fetali e le globine adulte. La regione LCR che si trova a monte del gene della globina embrionale è costituita da 5 siti ipersensibili alla DNasi I. Modello del reclutamento del complesso di trascrizione: Il macchinario della trascrizione ed altre proteine regolatrici vengono reclutati dalla LCR per formare un olocomplesso. La cromatina sotto l'effetto dell'azione di alcuni fattori di trascrizione assume una conformazione ad ansa la quale fa sì che l'olocomplesso si avvicini ai siti di inizio della trascrizione facendone aumentare la velocità.