virus, ricomninazione omologa, trasduzione batterica, trasform. batterica, interruzz. gene, Appunti di Scienze e tecnologie applicate

Scarica virus, ricomninazione omologa, trasduzione batterica, trasform. batterica, interruzz. gene e più Appunti in PDF di Scienze e tecnologie applicate solo su Docsity! DINAMICITÀ DEL GENOMA: i genomi sono una sorta di collage genetico, dove lo scambio di materiale genetico tra organismi è definito flusso genetico orizzontale. - Flusso genico verticale: da cellula madre a cellula figlia - Flusso genico orizzontale: mediato da elementi genetici mobili, che spostano orizzontalmente l’informazione genetica da una cellula all’altra. Esistono diversi tipi di flusso genico orizzontale: - Virus - Plasmidi - Trasposoni CARATTERISTICHE BIOLOGICHE DEI VIRUS: i virus sono parassiti endocellulari obbligati, ovvero dipendono dal metabolismo della cellula ospite per potersi riprodurre. - No struttura cellulare - Capside (involucro proteico) - Genoma (all’interno) - Envelope (può esserci e avvolge il capside) - Glicoproteine (legame tra virus e recettori) - Dimensioni estremamente piccole; i più grandi sono della misura dei batteri più piccoli - Genoma molto piccolo; numero limitato di geni, perché il resto è offerto dalla cellula infettata - No traduzione di proteine e no produzione di energia Due grandi gruppi: virus a DNA e virus a RNA (a seconda dell’acido nucleico) CICLO VITALE DEI VIRUS: 1. Adesione alla cellula ospite attraverso i recettori 2. Penetrazione del virus nella cellula ospite 3. Espressione di geni virali e replicazione del genoma 4. Assemblaggio dei capsidi 5. Rilascio di nuove particelle virali - Ciclo litico: fase di produzione di nuove particelle virali - Ciclo lisogeno: il genoma virale rimane nella cellula ospite senza produrre nuovi virus (tipico di Herpes simplex o HIV) Queste due fasi possono alternarsi dando vita a cicli vitali ancora più complessi. Questo accade nei batteriofagi, virus che infettano le cellule batteriche. SARS-CoV-2: - Il virus SARS-CoV-2 appartiene al genere dei coronavirus, un gruppo di virus a RNA. - Il recettore si chiama ACE2 e il suo ruolo nell’essere umano è quello di regolare la pressione sanguigna; è quindi presente in moltissime cellule umane, soprattutto in quelle delle vie respiratorie. - Sull’envelope virale è presente la glicoproteina Spike o proteina S, che lega il virus al recettore delle cellule umane. Questo legame dà il via al ciclo vitale del SARS-CoV-2, che si svolge solo nel citoplasma della cellula ospite. - Inoltre, come tutti i virus a RNA tende ad avere molte mutazioni a causa della bassa fedeltà della RNA polimerasi virale. (varianti virali più diffuse: delta e omicron). - Il SARS-CoV-2 si trasmette principalmente per via aerea, cioè attraverso colpi di tosse e starnuti, che spargono goccioline (droplet) che veicolano il virus. - La malattia causata da questo tipo di coronavirus è detta COVID-19. Quattro fasi della malattia: 1. SARS-CoV-2 penetra nelle vie respiratorie 2. il virus scende lungo le vie respiratorie. Sintomi lievi (80% dei pazienti) 3. il virus infetta le cellule che rivestono gli alveoli polmonari. Sintomi gravi (20% dei pazienti) 4. tempesta di citochine; danni gravi o fatali. VIRUS HIV: - Il virus HIV è responsabile della pandemia di AIDS, la sindrome da immunodeficienza acquisita. - Virus a RNA appartenente alla famiglia dei retrovirus - Retrotrascrizione: capacita di convertire un genoma a singolo filamento di RNA a polarità positiva in DNA a doppia elica - Il recettore della cellula bersaglio si chiama CD4. - Sull’envelope virale è presente la glicoproteina gp120, che lega il virus al recettore della cellula bersaglio. Viene rilasciato il genoma virale legato a due proteine virali: la trascrittasi inversa e l’integrasi. Trascrittasi inversa: fa la retrotrascrizione. Il DNA creato si chiama provirus, che viene trasportato al nucleo. Integrasi: si inserisce nei cromosomi della cellula infetta e diventa parte stabile del suo patrimonio genetico. Una cellula infetta su mille continua il suo normale ciclo vitale portando l’informazione genetica di HIV. Per questo è impossibile eliminare del tutto il virus, in quanto il sistema immunitario riconosce queste cellule come sane e quindi non le elimina. - La principale causa dei sintomi della sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) è la distruzione dei linfociti T CD4 da parte del virus. Tre fasi della malattia: 1. fase acuta: sintomi lievi che si risolvono in pochi giorni. 2. fase di latenza clinica: il virus continua a replicarsi e si instaura un equilibrio tra il virus e il sistema immunitario. Può durare anni e il soggetto è inconsapevole e può trasmettere la malattia. 3. fase sintomatica (AIDS): i linfociti T CD4 diminuiscono e l’organismo e sempre più colpito da infezioni causate da virus, funghi e batteri. - Farmaci antiretrovirali: bloccano la replicazione del virus, ma non possono eliminare i serbatori di latenza. LA RICOMBINAZIONE OMOLOGA: La ricombinazione omologa avviene quando un segmento di DNA viene incorporato all’interno di un frammento di DNA più grande. Perché questo avvenga è necessario che le due molecole di DNA abbiano tratti di sequenza molto simili o omologhi. La ricombinazione avviene quando sequenze omologhe si appaiano e formano una struttura a X saltano da un sito genomico all’altro. I trasposoni possono alterare la struttura dei cromosomi in due modi: l’interruzione genetica e la ricombinazione omologa. L’INTERRUZIONE GENETICA: si verifica quando un trasposone causa uno di questi effetti: - Va ad inserirsi all’interno di un gene, interrompendone la sequenza e causandone l’inattivazione - si inserisce all’interno di una sequenza di DNA con funzioni regolatorie (promotore o terminatore), alterandone la funzione 1. il trasposasi (un enzima del trasposone) induce dei tagli causali e sfasati nella sequenza di DNA o nel gene. 2. il trasposone si inserisce 3. DNA polimerasi della cellula crea un riempimento delle interruzioni. - Quando il trasposone salta ad un altro sito cromosomico, le informazioni che erano state interrotte vengono ripristinate. LA RICOMBINAZIONE OMOLOGA DEGLI ELEMENTI MOBILI: La presenza di numerosi trasposoni sui cromosomi crea molte regioni di omologia, ovvero zone con la stessa sequenza di DNA. Qui può avvenire la ricombinazione omologa. Si verifica uno scambio di regioni cromosomiche comprese tra due copie dello stesso trasposone. LE BIOTECNOLOGIE: Le biotecnologie sono applicazioni tecnologiche che utilizzano organismi viventi o loro derivati per realizzare prodotti e processi per usi specifici. Le biotecnologie si dividono in alcune aree principali tra cui le green biotechnologies (tipo ambientale), white biotechnologies (chimico-farmaceutiche), red biotechnologies (biomediche) e blu biotechnologies (organismi acquatici). In totale ci sono 10 campi di applicazione principali. Possibili applicazioni: - Usare cellule come bioreattori per l’industria - Generare piante transgeniche - Correggere i difetti genetici con la terapia genica - Individuare le terapie più efficaci. Con la farmacogenomica - Fare l’identikit genetico con le biotecnologie forensi - Produrre nuove forme di energia con i biocombustibili LE ORIGINI DELLE BIOTECNOLOGIE: Le biotecnologie hanno origine migliaia di milioni di anni fa, quando l’uomo ha iniziato a domesticare piante e animali, modificandone la struttura genetica. Altri esempi risalgono a migliaia di anni fa, con il processo della panificazione (per formare il pane) o della fermentazione (birra e vino). Le specie o i prodotti ottenuti per incrocio o selezione tradizionale, sono quindi a tutti gli effetti degli organismi geneticamente modificati. I VANTAGGI DELLE BIOTECNOLOGIE MODERNE: Rispetto alle biotecnologie tradizionali, le biotecnologie moderne hanno numerosi vantaggi perché sono più efficaci, più versatili e più mirate. Infatti, - Le tecniche basate sull’ingegneria genetica sono più efficaci perché consentono di trasferire sono i geni desiderati. - I geni trasferiti possono provenire da specie anche molto distanti dal punto di vista evolutivo rispetto alla specie ricevente: si generano così varietà che sarebbe impossibile generare da incroci tradizionali (differenza tra biotecnologie moderne e tradizionali). - Le b. moderne agiscono in modo mirato e permettono di ottenere le caratteristiche desiderate con un’alterazione genetica minima, spesso limitata ad un solo gene. IL CLONAGGIO GENICO: La tecnica alla base delle biotecnologie moderne è il clonaggio genico. Ma come si clona un gene? 1. il gene di interesse viene separato dagli altri geni presenti nell’organismo di partenza. 2. il gene va inserito all’interno di una molecola di DNA plasmidico modificata, detta vettore di clonaggio. 3. il risultato è un DNA ricombinante, ovvero una molecola di DNA costituita da porzioni provenienti da individui diversi. 4. il DNA ricombinante creato può essere inserito in una cellula ospite con il processo di trasformazione. 5. I batteri trasformati sono deposti su piastre di terreno agar ben distanziati (così formano colonie diverse). 6. bisogna isolare le cellule che hanno inglobato il plasmide rispetto a quelle che non l’hanno fatto. Questo è possibile grazie a un marcatore di selezione, ovvero un gene che dà resistenza rispetto ad un antibiotico; il terreno è arricchito con dell’antibiotico. Questo fa si che sono le cellule con il plasmide, e quindi con il marcatore, sopravvivano. 7. Nella cellula trasformata, il vettore si replica grazie al sito di origine della replicazione del plasmide. Si formano molte copie. 8. Quando il batterio si divide (origine della replicazione), le copie si ripartiscono tra le cellule madri e le cellule figlie; da ogni cellula si genera una colonia di cellule identiche, o cloni. 9. il gene è stato clonato. TAGLIARE IL DNA CON GLI ENZIMI DI RESTRIZIONE: Approfondimento sul primo passaggio. Per separare il gene dalla molecola di DNA si usa una particolare classe di enzimi, le endonucleasi di restrizione, che idrolizzano il legame fosfodiestere tra due nucleotidi adiacenti all’interno di una doppia elica di DNA. Questi enzimi sono ideali peer il clonaggio perché tagliano entrambi i filamenti del DNA in corrispondenza di una sequenza bersaglio. Gli enzimi endonucleasi (come EcoRI) producono delle estremità coesive (chiamate sticky ends) che sono molto utili per il clonaggio. Esistono centinaia di enzimi di restrizione capaci di individuare ognuno una determinata sequenza di nucleotidi sul DNA. I frammenti che si ottengono dalla restrizione sono visualizzati grazie ad una tecnica chiamata elettroforesi su gel. SALDARE IL DNA CON LA DNA LIGASI: Approfondimento sul terzo passaggio. Dopo aver ottenuto il frammento di DNA da clonare, bisogna saldarlo per ottenere il DNA ricombinante. Questo si fa attraverso la DNA ligasi. La DNA ligasi è in grado di ricostruire il legame fosfodiestere tra due nucleotidi adiacenti utilizzando come cofattore l’ATP (oppure il NAD+). Dopo che gli enzimi di restrizione tagliano il DNA e costituiscono quindi alle estremità le sticky ends, i due filamenti di DNA posso unirsi attraverso legami a idrogeno. Questo però non basta, in quanto i legami non sono stabili e forti. Serve quindi aggiungere la DNA ligasi e l’ATP. Questo crea dei legami forti e stabili. I VETTORI DI CLONAGGIO: I vettori di clonaggio più usati sono i plasmidici, molecole di DNA circolare a doppia elica lunghi alcune migliaia di nucleotidi ottenuti da plasmidi batterici naturali tramite manipolazioni genetiche. Tutti vettori hanno degli elementi essenziali: - Un’origine di replicazione per consentire la replicazione del plasmide a ogni divisione cellulare - Uno o più geni per la resistenza ad antibiotici, che agiscono come marcatori per selezionare le cellule che hanno incorporato il vettore - Un sito multiplo di clonaggio o polylinker, in cui sono presenti enzimi di restrizione (questa è la regione in cui viene inserito il frammento di DNA da clonare) COME INSERIRE I PLASMIDI NELLE CELLULE: La tecnica più usata è la trasformazione batterica. Tuttavia, non tutte le cellule possono farlo facilmente. Nelle cellule animali per esempio, il DNA può essere iniettato direttamente al loro interno mediante una procedura chiamata microiniezione. Nelle cellule vegetali invece si una più frequentemente la tecnica biolistica o gene gun, che consente di sparare il DNA nelle cellule dopo averlo caricato su microproiettili di materiali come l’oro. LA CLONAZIONE: si parla di clonazione quando ad essere clonati sono degli interi organismi. (invece che clonaggio) Il primo mammifero ad essere clonato è stato la pecora Dolly nel 1996. La tecnica utilizzata è basata sul trasferimento nucleare. 1. si preleva una cellula adulta da una pecora e si aspira il nucleo 2. si preleva una cellula adulta da una seconda pecora e si elimina il nucleo, mantenendo intatti membrana e citoplasma 3. si trasferisce il nucleo della cellula 1 nella cellula 2 4. viene generato un embrione in provetta dall’unione 5. l’embrione viene impiantato nell’utero di una terza pecora (madre surrogata) 6. l’individuo che nascerà è geneticamente identico, ovvero un clone, della prima pecora LE LIBRERIE GENOMICHE: Le librerie genomiche o genoteche sono collezioni di cloni batterici ciascuno contenente un diverso frammento di DNA. Con questo sistema si può costruire una serie di cloni che nel loro insieme racchiudono tutto il genoma di un organismo da cui si può poi estrarre il frammento di DNA che interessa. I frammenti contenuti nelle librerie contengono sia le sequenze codificanti (esoni), sia quelle codificate (introni). campioni di DNA sono della stessa persona. Si usa per: - Identificare a chi appartiene il DNA sulla scena del crimine - Accertamenti di paternità IL SEQUENZIAMENTO DEL DNA: il sequenziamento genico permette di ricostruire l’ordine in cui i nucleotidi si susseguono lungo il filamento di DNA. La tecnica messa a punto da Sanger nel 1977 è basata sull’utilizzo di nucleotidi modificati detti dideossinucleotidi che una volta incorporati nella catena di DNA nascente, ne bloccano l’allungamento. Vengono chiamati infatti terminatori di catena. Per sequenziare si sfrutta sempre la capacità della DNA polimerasi di generare un filamento complementare rispetto ad un filamento stampo. - estrazione genoma e enzimi di restrizione - i frammenti di DNA vengono fatti reagire con primer, DNA polimerasi e deossinucleotidi - miscela divisa in 4 provette - si formano frammenti di lunghezze diverse a seconda di dove è stato interrotto l’allungamento - il DNA da sequenziare è amplificato in una reazione di PCR in presenza dei dideossinucleotidi a cui è attaccato un marcatore fluorescente con colore diverso per ogni base. I prodotti sono separati in base alla loro dimensione. LE NUOVE TECNICHE DI SEQUENZIAMENTO: Le nuove tecniche di sequenziamento (NGS, next generation sequencing), che stanno rivoluzionando la ricerca genomica, permettono di leggere interi genomi lunghi milioni o miliardi di nucleotidi, come quello umano. La genomica si divide in 3 aree diverse: - Genomica funzionale: determina i geni e le loro funzioni in un organismo - Genomica comparativa: confronta i genomi per stabilire parentele evolutive tra specie - Metagenomica: studia la variabilità genetica naturale delle specie in un determinato ambiente GLI OGM: sono organismi geneticamente modificati, cioè che contengono ed esprimono un gene proveniente da un’altra specie. IL PHARMING: questo termine deriva dall’unione di pharmaceuticals e farming. Indica l’uso di animali modificati geneticamente per produrre la molecola di interesse. Alcuni esempi sono delle mucche il cui latte è simile a quello umano, oppure pecore il cui latte contiene alte quantità dell’ormone della crescita per curare dei bambini affetti da patologie riguardanti il ritardo della crescita. Si pratica attraverso la modificazione degli embrioni degli animali. I TOPI TRANSGENICI E I TOPI KNOCK-OUT: I topi transgenici sono topi che sono stati modificati geneticamente inserendo un gene normalmente assente nel genoma del topo. Si utilizza il topo perché condivide con l’uomo il 97,5% dei geni e anche gli apparati biochimici alla base del metabolismo sono molto simili. - Agendo sulle cellule embrionali, si può trasferire nel topo un gene che causa una malattia nell’uomo e così la malattia si produce anche nel topo. In questo modo è più facile studiarne gli effetti e le possibili cure. I topi knock-out o topi KO sono topi che sono stati modificati geneticamente inattivando uno specifico gene. Per esempio, è grazie ai topi knock-out che sappiamo che l’obesità può anche avere origini genetiche. In assenza di un determinato gene infatti (leptina) non si prova sazietà e si sviluppa quindi obesità e diabete. LA TERAPIA GENICA: Grazie alle biotecnologie, oggi è possibile non solo disattivare un gene in un intero organismo (come nel caso dei topi knock-out), ma si può anche sostituire un gene non funzionale con la sua copia corretta. Le tecniche che permettono di correggere un gene non funzionale sono alla base della terapia genica e stanno rivoluzionando la cura di gravi malattie genetiche umane. Diverse patologie sono causate da proteine che non funzionano correttamente. - In alcuni casi le proteine sono difettose per la presenza di una o più mutazioni nel gene che le codifica - In altri casi l’inattivazione di un gene determina la mancanza totale della corrispndente proteina Il deficit di enzima ADA 1. estrazione delle cellule non funzionanti 2. retrovirus viene munito della copia corretta del gene ADA 3. il vettore retrovirale infetta la cellula malata e inserisce la copia funzionante del gene ADA 4. le cellule “guarite” sono reintrodotte nel paziente APPLICAZIONI DELLE BIOTECNOLOGIE: La produzione biotecnologica di farmaci È possibile inserire il gene per una proteina in cellule facili da coltivare, come i batteri (bioreattori); l’apparato metabolico cellulare permette poi di sintetizzarla a costi minori e con un impatto ambientale più ridotto. Talvolta si usano piante o animali, che hanno un apparato per la sintesi e la modificazione post traduzionale delle proteine molto più simile a quello umano rispetto ai batteri. Alcuni farmaci ottenuti con le biotecnologie sono: - insulina e altri ormoni - fattori per la coagulazione - anticorpi e vaccini