Biochemia, testy witalności komórek, Ćwiczenia z Biochemia medyczna

Pobierz Biochemia, testy witalności komórek i więcej Ćwiczenia w PDF z Biochemia medyczna tylko na Docsity! BIOLOGIA KOMÓRKI Testy witalności komórek TESTY WITALNOŚCI KOMÓREK Biochemia 2 Biochemia WSTĘP Każda komórka jest układem termodynamicznie otwartym wymieniającym ze swym otoczeniem materię i energię. Wymiana ta odbywa się poprzez błonę komórkową, której właściwości w dużej mierze decydują o kontrolowaniu przez komórkę swego środowiska, co jest niezbędnym warunkiem korelacji wewnątrzkomórkowych procesów metabolicznych. Wszystkie trwałe uszkodzenia błony komórkowej prowadzą do śmierci komórki. Testy żywotności (witalności) pozwalają na określenie naturalnego stanu błony komórkowej lub mierzą stan metaboliczny komórki i wskazują na potencjalną zdolność komórki do wzrostu i podziału i prawidłowej aktywności metabolicznej. Można je podzielić na pewne grupy: I. Testy, które wykorzystują naturalną właściwość błony komórkowej jako bariery dla związków, które w fizjologicznym pH są anionami. Związki takie (barwniki) nie wnikają do żywych komórek ze względu na ujemny ładunek błony, ale po śmierci komórki (gdy błona zostanie trwale uszkodzona), następuje zanik potencjału pomiędzy zewnętrzną a wewnętrzną stroną błony, przenikają do wnętrza komórki barwiąc cytoplazmę lub jądro. Powszechnie stosowanym barwnikiem z tej grupy jest błękit trypanu, który wybarwia komórki martwe na kolor niebieski. Innymi barwnikami z tej grupy są: zieleń lizaminowa, eozyna Y, erytrozyna B. II. Testy, które oparte są na przechodzeniu przez błonę komórki drobnocząsteczkowych związków, które mogą być gromadzone w żywej komórce powodując jej wybarwienie. Powszechnie stosowanym związkiem z tej grupy jest dwuoctan fluoresceiny, który szybko wnika do wnętrza komórki, gdzie pod wpływem esteraz uwalnia się zeń fluoresceina. Fluoresceina jest związkiem słabo rozpuszczalnym w wodzie w zakresie pH występującego w komórce, w związku z tym może dochodzić do jej znacznego nagromadzanie w komórce, co nie powoduje istotnej zmiany wartości osmotycznej wnętrza komórki. Utrzymywanie barwnika we wnętrzu komórki w dość wysokim stężeniu może zachodzić tylko w komórkach, które są zdolne do gromadzenia substancji w stężeniu wyższym niż występują one w środowisku, co w praktyce oznacza, że komórki takie mają nieuszkodzoną błonę i są żywe. Komórka, która nagromadziła w swym wnętrzu fluoreseinę jest widoczna w mikroskopie fluorescencyjnym, bo świeci na kolor zielony (fluorescencję wzbudza się światłem niebiesko-fioletowym). Uszkodzenie komórki pociąga za sobą natychmiastową dyfuzję fluoresceniny do otaczającego środowiska i komórka staje się niewidoczna. III. Barwniki z tej grupy często używane są w testach żywotności opartych na podwójnych barwieniach, które umożliwiają uwidocznienie równocześnie komórek żywych i martwych. Powszechnie stosowanym testem podwójnego barwienia jest test z dwuoctanem fluoresceiny (wybarwia komórki żywe) i bromkiem etydyny (wybarwia komórki martwe). Bromek etydyny, jodek propydyny, oranż akrydyny to związki (fluorochromy), które przechodzą przez uszkodzoną błonę i akumulują się w martwych komórkach dzięki specyficznemu wiązaniu się z kwasami nukleinowymi. Bromek etydyny wiąże się z DNA na zasadzie interkalacji, termin interkalacja (z łac. intercalare) oznacza „wsuwać się”, jest zarezerwowany dla specyficznego sposobu wiązania polegającego na wsuwaniu się płaskich heterocyklicznych, aromatycznych układów pomiędzy pary zasad w podwójnej helisie DNA.