Fermentação de produtos alimentares, Trabalhos de Ciência e Tecnologia de Alimentos

Baixe Fermentação de produtos alimentares e outras Trabalhos em PDF para Ciência e Tecnologia de Alimentos, somente na Docsity! BRASÍLIA 2017 Universidade de Brasília – UnB Faculdade de Ciências da Saúde Curso de Farmácia Trabalho de Conclusão de Curso Andressa Ândria Martins Ribeiro Avaliação da atividade antioxidante de diferentes marcas de chá de Hibiscus sabdariffa L. BRASÍLIA 2017 Universidade de Brasília – UnB Faculdade de Ciências da Saúde Curso de Farmácia Andressa Ândria Martins Ribeiro. Avaliação da atividade antioxidante de diferentes marcas de chá de Hibiscus sabdariffa L. Trabalho de Conclusão de Curso apresentado como requisito para aprovação em Bacharel no curso de Farmácia da Universidade de Brasília. Orientadora: Profª. Dra. Yris Maria Fonseca-Bazzo Co-Orientadora: Prof. Dra Pérola de Oliveira Magalhães Martins Ribeiro., Andressa Ândria Avaliação da atividade antioxidante de diferentes marcas de chá de Hibiscus sabdariíffa L. / Andressa Ândria Martins Ribeiro.; orientador Prof?. Dra. Yris Maria Fonseca-Bazzo; co-orientador Prof. Dra Pérola de Oliveira Magalhães. — Brasília, 2007. 53 p. Monografia (Graduação - Farmácia) — Universidade de Brasília, 2007. 1. Hibiscus sabdariffa L., . 2. chá. 3. atividade antioxidade. 4. medicinal. I. Fonseca-Bazro, Profº. Dra. Yris Maria , orient. IJ. de Oliveira Magalhães, Prof. Dra Pérola , co-orient. III. Título. BRASÍLIA 2017 BRASÍLIA 2017 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus por tudo. A toda a minha família em especial a minha mãe Maria de Jesus Martins Pereira que sempre me apoiou, ao meu pai João Ribeiro, minhas irmãs Ana Paula e Amanda, ao meu afilhado Marcos Antônio e ao meu namorado Iuri, por sempre compreenderem com amor minhas ausências durante o processo, torcendo sempre pela minha realização. Aos meus amigos que me acompanharam por toda a graduação nos momentos felizes e nos mais difíceis, em especial ao Nélio, Gislaine, Thais e Nayra nos quais compartilhamos risos e desesperos. Aos meus amigos que me acompanham desde de sempre e que mesmo não entendendo nada do assunto, sempre me escutaram. A todos do Laboratório de Controle da Qualidade de Medicamentos e Produtos Naturais, que com paciência sempre me ajudaram. Em especial ao Diegue Henrique Nascimento Martins pela ajuda e paciência ao esclarecer minhas dúvidas e me ajudar no processamento de dados. A professora Dra. Yris Maria Fonseca-Bazzo, por acreditar no meu potencial durante o trabalho de iniciação científica, sempre com dedicação, paciência e atenção me abrindo as portas para o mundo da pesquisa. A professora Pérola de Oliveira Magalhães Dias Batista, pelo acompanhamento e disposição para a realização do trabalho. BRASÍLIA 2017 LISTA DE TABELAS Tabela 1- Atividade antioxidante avaliada pelo método de inibição da formação do complexo de fosfomolibdênio dos chás preparados a partir das flores de Hibiscus sabdariffa L. e padrão quercetina. Tabela 2- Atividade antioxidante avaliada pelo método de inibição da formação do complexo de fosfomolibdênio dos chás preparados a partir das flores de Hibiscus sabdariffa e padrão ácido ascórbico. Tabela 3- Atividade antioxidante avaliada por ensaio ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) dos chás preparados a partir das flores de Hibiscus sabdariffa L. e do padrão AA (Ácido Ascórbico). Tabela 4- Tabela Atividade antioxidante avaliada por peroxidação lipídica dos chás preparados a partir das flores de Hibiscus sabdariffa L. e do padrão BHT (hidroxitolueno butilado). BRASÍLIA 2017 RESUMO O chá de Hibiscus sabdariffa L. é cultivado e consumido pelas suas características de aroma, sabor e propriedades medicinais em mais de 160 países. A planta em si tem como característica ser um arbusto perene de ciclo anual chegando a medir até 3 metros de altura, seu cálice possui formato de taça vermelha, com caule arroxeado e folhas alternadas, possuindo ainda flores solitárias de cor amarela ou brancas nos quais possuem duração de dois dias. Sua origem é incerta sendo relatada casos na Índia e na Arábia Saudita. Seu crescimento ocorre em climas tropicais e subtropicais, sendo tolerados em solos pobres. Sua utilização é realizada através da bebida preparada através da infusão de raízes, folhas e flores. Devido a versatilidade, o consumo desse chá no Brasil vem crescendo nos últimos anos, atualmente encontram-se em destaque no mercado nacional. O presente trabalho avaliou a atividade antioxidante do chá de Hibiscus sabdariffa L., através de três testes distintos: Orac (Oxygen Radical Absorbance Capacity), peroxidação lipídica e inibição da formação do complexo fosfomolibdênio. Como resultado podemos observar que o chá de Hibiscus sabdariffa L apresentou resultados satisfatórios, apresentou atividade antioxidante, mesmo após 12 horas do seu preparo. Desta maneira, o chá se torna uma boa opção nas terapias preventivas de danos oxidativos. Palavras chave: Hibiscus sabdariffa L., chá, atividade antioxidade, medicinal. BRASÍLIA 2017 BRASÍLIA 2017 SUMÁRIO Sumário 1 Introdução ...............................................................................................................13 1.1 Hibiscus sabdariffa L. ............................................................................................ 14 1.2 Radicais Livres; ..................................................................................................... 17 1.3 Capacidade Antioxidante. ...................................................................................... 18 2 Objetivos .................................................................................................................20 2.1 Objetivo geral ........................................................................................................ 20 2.2 Objetivos específicos ............................................................................................. 20 3 Metodologia ............................................................................................................21 3.1 Coleta da Amostra ................................................................................................. 21 3.2 Determinação da atividade antioxidante pelo método de inibição da formação do complexo de fosfomolibdênio; .......................................................................................... 22 3.2.1 Solução Reagente ...........................................................................................22 3.2.2 Curva padrão quercetina. .................................................................................22 3.3 Ensaio ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity);......................................... 24 3.3.1 Solução Reagente: ..........................................................................................24 3.4 Peroxidação Lipídica; ............................................................................................ 26 3.4.1 Soluções reagentes .........................................................................................26 3.5 Análise estatística .................................................................................................. 29 4 Resultados e Discussão .........................................................................................30 4.1 Determinação da atividade antioxidante pelo método do fosfomolibdênio ............. 30 4.1.1 Curva padrão quercetina. .................................................................................30 4.1.2 Padrão Ácido Ascórbico (C6H8O6). ...................................................................34 4.2 Ensaio ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) ......................................... 37 4.3 Peroxidação Lipídica; ............................................................................................ 42 5 Conclusão ...............................................................................................................48 6 Referência bibliográfica .........................................................................................49 15 BRASÍLIA 2017 de ser sensível ao fotoperíodo (ROCHA et al, 2004; ROSA, 2013; YAMAMOTO et al, 2007). Devido a uma colheita ideal, a H. sabdariffa se desenvolve de maneira fácil em vários tipos de ecossistema. Na China, foi notado o uso do óleo para fins medicinais, no oeste da África a folha pulverizada é usada na suplementação das refeições (ROCHA et al, 2014). Suas folhas, cálices, sementes e fibras são utilizados na alimentação de animais, na indústria de tecido, papel e no preparo de bebidas com fins culinários e medicinais (RAMOS et al, 2011). Suas preparações comerciais de concentrados de H. sabdariffa são comumente encontradas como fluido ou pó para a preparação de bebidas instantâneas ou infusões. O tratamento térmico dos seus cálices desidratados, produzirem uma bebida rica em compostos fenólicos com propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias e antidiabéticas (ROCHA, 2014). Além disso, seu uso generalizado como tratamento à base de ervas na medicina popular tem levado a um elevado grau de aceitação pela população em geral (GUARDIOLA et al, 2014). Desse modo, a H. sabdariffa no decorrer dos tempos tem chamado a atenção da indústria farmacêutica (FREITAS et al, 2013). Na medicina antiga seu extrato é efetivo em vários tratamentos (IYARE et al, 2010). No campo cientifico a planta apresenta vários efeitos terapêuticos, como hepatoprotetor, mostrando alterações bioquímicas e histológicas em ratos que possuíam diabetes mellitus (ADEYEMI et al, 2014); melhora a diminuição da acumulação lipídica induzida pelo fígado, na obesidade (HUANG et al, 2015); atividade antioxidante, anticolesterol (RAMOS et al, 2011); anti-hipertensivo agindo como vaso dilatador no musculo liso vascular (MICUCCI et al, 2015); antibacteriano (ROCHA et al, 2014); Droga promissora para o combate do vírus influenza (BAATARTSOGT et al, 2016); além de ter grande potencial em células anti-tumorais (ASN et al, 2015). Culturalmente é utilizado como diurético, para o tratamento de desordem intestinal e antipirético (ROSA, 2013). Tendo ainda melhora no ganho de peso saudável em gestantes, o que também pode ser usado na melhora de alguns casos de anorexia (IYARE et al, 2010). Estudos realizados apontam que a H. sabdariffa possui alto teor de ácido ascórbico, vitamina A, licopeno (ROSA, 2013), íons de sódio e de Ferro (IYARE et al, 2010); polissacarídeos, pectinas mucilaginosas (BORRÁS-LINARES et al, 2015); 16 BRASÍLIA 2017 polifénois como: ácidos orgânicos, ácidos protocateicos (Figura 02-3), taninos e compostos fenólicos. Os compostos fenólicos encontrados são as antocianinas: delfinidina 3-xilosilglucosídio, cianidina 3-xilosilglucosídio (Figura 02-2), cianidina 3- glicosídeo e a delfinidina 3-glicosídeo (Figura 02-1) (VIZZOTTO et al, 2008), elas são detectadas em quantidades elevadas nos cálices, sendo responsáveis pela cor vermelha (BORRÁS-LINARES et al, 2015), também estão presentes flavonóides como quercetina, luteolina, a hibiscetina (Figura 02-4), sabdaretina, gossipetina (Figura 02-5). Essas substâncias são consideradas constituintes bioativos importantes no processo de ação antioxidante (VIZZOTTO et al, 2008). Estes componentes são influenciados por fatores géneticos, por uma adubação na qual abranga nutrientes essenciais que em conjunto com as condições ambientais e com a maturação formam uma planta que contenha altas concentrações de bioativos (ROSA, 2013). Esses fatores podem ser obtidos por meio da produção de mudas de boa qualidade, que iram atuar na composição do substrato. Figura 02: Estruturas químicas de alguns constituintes principais da droga vegetal Hibiscus sabdariffa L. Os compostos presentes são: (1) delfinidina 3-glicosídeo,(2) cianidina 3-xilosilglucosídio,(3) ácidos protocateicos,(4) hibiscetina e (5) gossipetina. Fonte: (ALI et al, 2005, p.2) O chá de H. sabdariffa é produzido com a secagem dos cálices após a sua colheita, a capsula é retirada a uma temperatura menor que 43 ºC, a secagem tem 17 BRASÍLIA 2017 como produção a escala 10:1, sendo assim, para cada 100 Kg de cálice fresco, 1 Kg de cálices secos são produzidos, para ser passados por um processo de trituração e assim poderem ser comercializados (CASTRO, 2003). O chá possui um aroma característico e gosto amargo (MARÍN et al, 2015). O seu alto teor de polifenóis pode explicar a capacidade antioxidante do chá à base de H. sabdariffa. Desse modo, o seu chá pode ser considerado uma bebida protetora contra radicais livres (PRENESTI et al, 2007). O chá obtido a partir do cálice da flor contém polissacarídeos em boas quantidades, açúcares redutores, como a glicose e a frutose, além de ser rico em cálcio, magnésio, niacina, riboflavina, ferro e vitaminas A e C, ácidos como o tartárico, succínico, málico, oxálico, cítrico e hibíscico, possuindo uma quantidade significativa de fibras alimentares (VIZZOTTO et al, 2008). Logo, como a sua infusão é capaz de preservar os polifenóis, as bebidas à base de H. sabdariffa poderão ser alternativas no uso de bebidas como vinho tinto para crianças e pessoas que não utilizam álcool (PRENESTI et al, 2007). Entretanto, o uso do chá indiscriminadamente, deve ser um fator a se observar devido ao fato de que estudos toxicológicos conduzidos em ratos, demostraram que doses elevadas podem ocasionar problemas no fígado e no sistema reprodutor masculino, reduzindo a fertilidade (VIZZOTTO et al, 2009). Logo o uso dor chá por 7 dias incluindo períodos de interrupção, trata-se de um cuidado para evitar o aparecimento de problemas renais e hepáticos. Outro ponto a ser observado é a interação com drogas que podem ser usadas em conjunto com o chá, no parâmetro farmacocinético temos divergências sobre o potencial de interação do extrato aquoso da H. sabdariffan, segundo o estudo de 2006, no qual foi demostrado que a atividade não modulou a atividade do cytocromo P450 (Prommetta et al,2006). Porém outro estudo realizado em 2013, foi elucidado que o extrato etanolico possui inibição de nove isorformas da CYP, logo o extrato aquoso poderá ter interação, mesmo sendo em menor intensidade, inferindo ainda que a co- administração pode trazer inibição do fármaco pelo mecanismo de primeira passagem (JOHNSON et al., 2013), outros estudos demostraram que o chá possui interação com o medicamento diclofenaco tendo interferência significativa no seu metabolismo, reduzindo sua excreção, o que pode levar a um alto ou decaimento da faixa terapêutica ideal (FAKEYE et al., 2007). Em contra partida com o drogas que usam o metabolismo via cloroquina e com a droga paracetamol não teve interação significativo. Entretanto são necessários novos estudos para outros fármacos (ALI et al, 2005). 1.2 Radicais Livres; Os radicais livres vêm obtendo grande destaque no ambiente de pesquisa devido ao advento de trabalhos nas quais demostram o efeito destes e outros agentes oxidantes no organismo (RAMOS et al, 2011). Radicais livres são espécies químicas com um ou dois elétrons na sua camada mais externa (TCHOUYA et al, 2016), o que os tornam espécies com átomos instáveis (VICTOR et al, 2014). 20 BRASÍLIA 2017 2 Objetivos 2.1 Objetivo geral Avaliar o potencial antioxidante de diferentes marcas do chá de Hibiscus sabdariffa L. 2.2 Objetivos específicos  Avaliar a capacidade antioxidante com a utilização de três métodos in vitro, nos quais possuem diferentes mecanismos, como o de fosfomolibdênio, ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) e peroxidação lipídica.  Avaliar se existe diferença da atividade antioxidante entre as diferentes marcas.  Avaliar se existe diferença da atividade antioxidante em diferentes tempos posterior ao preparo do chá. 21 BRASÍLIA 2017 3 Metodologia 3.1 Coleta da Amostra A droga vegetal de H. sabdariffa foi adquirida em pontos diferentes do comércio local do DF, em três marcas diferentes (A, B e C). Todas as marcas têm como característica o extrato seco do cálice da espécie vegetal. Não sendo identificado na embalagem o processo de liofilização. (Figura 03). As embalagens vieram em um saco plástico, com descrição de modo de preparo, o nome da espécie, lote, data de validade, informações sobre o distribuidor, entretanto em apenas uma das marcas foi observado as informações nutricionais sobre o produto. Figura 03: Amostra de chá de Hibiscus sabdariffa L. Para a realização dos ensaios foram preparados os chás seguindo o modo do uso da embalagem, na qual específica a preparação de modo padronizado em todas elas; feita com uma xícara de chá (150 mL) de água fervente sobre uma colher de sobremesa (2 g) do produto. Realizando assim, o processo de infusão por 15 minutos, com uma concentração de 13,3 mg/mL. 22 BRASÍLIA 2017 Após o preparo, os chás foram transferidos para garrafas de plástico de material opaco sob temperatura ambiente, no qual foram armazenadas. Após 1 hora de preparo e depois de 12 horas de preparo os ensaios foram realizados. 3.2 Determinação da atividade antioxidante pelo método de inibição da formação do complexo de fosfomolibdênio; O objetivo desse ensaio foi avaliar a atividade antioxidante pelo método de inibição da formação do complexo de fosfomolibdênio, que determina de modo quantitativo a redução de molibdênio VI para molibdênio V que pôde ser observado com a formação da coloração verde (fosfato/ molibdênio V) em pH ácido (PRIETO et al, 1999). 3.2.1 Solução Reagente A solução reagente foi preparada a partir de três substâncias: 1,199 g de fosfato de sódio tribásico (Na2PO4·12H2O – 0,1 M), 3,0896 g de molibdato de amônio [(NH4)6Mo7O24)]– 0,025 M, 12,645 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) – 2,4 M. Cada substância foi dissolvida e diluída em quantidade suficiente para 100 mL de água destilada em balão volumétrico. Para o dia do ensaio foi preparado a solução reagente de 40 mL misturando- se: 11,2 mL de fosfato de sódio monobásico anidro (NaH2PO4) com concentração final de 28 nM, 10 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) com concentração final de 0,6 M e 6,4 ML de molibdato de amônio [[(NH4)6Mo7O24)], com concentração final 4 nM. Após a mistura de cada componente, completou-se para 40 mL com água destilada. 3.2.2 Curva padrão quercetina. A solução mãe de quercetina 1 mg/mL foi preparada com 10 mg da quercetina e adição de 10 mL de etanol. Acondicionou-se ao abrigo da luz. A partir da solução mãe realizou-se a diluição em sete tubos de ensaios em concentrações gradativas (0,025; 0,05; 0,075; 0,1; 0,125; 0,15; 0,2 mg/mL) com 25 BRASÍLIA 2017 Na qual foi verificado o pH da solução de 7,4. Essa solução tampão foi armazenada sob refrigeração (EMBRAPA,2009). . 3.3.1.2 Preparo de solução de fluoresceína em tampão fosfato pH 7,4. A solução de fluoresceína (16,371.10-8mol/L) foi preparada em tampão fosfato 10 mg de fluoresceína em 50 mL de tampão, solução na qual foi armazenada sobre refrigeração. Para o ensaio foi realizada a solução de 15,4 µL da solução mãe em 50 mL de tampão fosfato (EMBRAPA,2009). 3.3.1.3 Solução de AAPH (2,2’-Azobis(2-methypropionamidine) em tampão fosfato pH 7,4 Solução AAPH em tampão com concentração 178 mmol/L foi realizada inserindo 241,3 mg AAPH em 5 mL de tampão (EMBRAPA,2009). 3.3.2. Padrão ácido ascórbico (C6H8O6). A solução mãe de ácido ascórbico 1 mg/mL foi preparada com 10 mg de ácido ascórbico e adição de 10 mL de tampão fosfato. Acondicionou-se ao abrigo de luz. A partir da solução mãe realizou-se a diluição em setes tubos de ensaios em concentrações gradativas (0,5; 1; 2; 4; 6; 8 µg/mL) em triplicatas diluídas em tampão fosfato. Em Tubos de ensaio a parte foram adicionados 0,750 mL de ácido ascórbico para cada concentração, sendo também adicionadas alíquotas de 1,5 mL de fluoresceína . No controle positivo e negativo foi adicionado 0,750 mL de tampão e 1,5 mL de fluoresceína que foram submetidos ao banho maria por 5 minutos á 37°C. Após os 5 minutos foram adicionados 0,750 mL de AAPH, com diferença de 1 minuto para cada tubo de ensaio. Entretendo, para o controle negativo foi adicionado o tampão fosfato no lugar do AAPH. O produto da reação foi analisado em fluorímetro, com excitação 485 nm e emissão de 520nm. 26 BRASÍLIA 2017 3.3.3 Chás de Hibiscus sabdariff L. As amostras de chás de Hibiscus sabdariffa L. a 1 mg/mL foram diluídas em seis distintas concentrações. A partir da solução mãe analisou-se a diluição em setes tubos de ensaios em concentrações gradativas (0,5; 1; 2; 4; 6; 8 µg/mL) com triplicatas diluídas em tampão fosfato. Para cada concentração gradativa de H. sabdariffa L. realizou-se triplicatas de reação em tubos de ensaio com 0,750 mL de cada concentração de amostra e adicionou-se 1,5 mL da fluoresceína em cada triplicada, nos controles positivos e negativos foram adicionados 0,750 mL de tampão e 1,5 ml de fluoresceína que foram levados em banho maria por 5 minutos á 37°C. Após os 5 minutos foram adicionados 0,750 mL de AAPH, com diferença de 1 minuto para cada tubo de ensaio. Para o controle negativo foi adicionado o tampão fosfato. As amostras foram analisadas em fluorímetro, com excitação de 485 nm e emissão de 520nm. A determinação da atividade antioxidante seguiu o cálculo do índice antioxidante da amostra em percentual (%) utilizando a fórmula: IA%= (A/C) x 100, onde A é a média aritmética das absorbâncias da amostra e C é a medida das absorbâncias do controle positivo (PRIOR et al, 2015). 3.4 Peroxidação Lipídica; A peroxidação lipídica constitui a principal causa da decomposição dos corpos graxos, logo sua inibição é uma atividade característica dos antioxidantes. O método avalia a atividade antioxidante de modo quantitativo por meio da reação do ácido tiobarbitúrico (TBA) com os produtos de decomposição dos hidroperóxidos. Um dos produtos dessa reação é o malonaldeído que reage com o TBA formando o complexo de cor vermelha. A reação acontece em meio ácido e em altas temperaturas para aumentar a velocidade e sensibilidade do teste (BORGES, 2011). 3.4.1 Soluções reagentes 27 BRASÍLIA 2017 3.4.1.1 Solução ácido acético 20%  Foi inserido 40,12 mL de ácido acético, diluído em 200 mL (qsp) de água destilada; 3.4.1.2 Solução de TBA em SDS 1,1 %  Solução de SDS 1,1 %- Foi diluído 2,2 g em 200 mL (qsp) de água destilada;  Solução de TBA em SDS 1,1% – 1,6 g diluído em 200 mL da solução de SDS preparada anteriormente. A solução foi levada ao ultrassom por 50 minutos; 3.4.1.3 Solução de Cloreto de Potássio 1,5%;  3g diluídos em 200 mL de água destilada (qsp); 3.4.1.4 Solução de gema de Ovo (10%);  200 mg da gema do ovo em 20 mL de KCl 1,5%; Recomenda-se que essa mistura seja levada ao ultrassom por 5 minutos (MIGUEL et al, 2004). 3.4.1.5 Solução Tampão fosfato pH: 7,4; Solução tampão inserida no método de ORAC. 3.4.1.6 Solução AAPH (2,2’-Azobis(2-methypropionamidine) em tampão; A solução com concentração 6,33 mg/ mL Foi diluída 95mg em 15 mL de Tampão Fosfato. 3.4.2 Solução padrão de BHT (hidroxitolueno butilado); A solução mãe de BHT 1 mg/mL foi preparada com 10 mg de BHT e adição de 10 mL de etanol. Acondicionou-se ao abrigo de luz. A partir da solução mãe realizou-se a diluição em oito tubos tipo Falcon em concentrações gradativas (2,0; 1,8; 1,6; 1,4; 1,2; 1,0; 0,8; 0,6 µg/mL) com triplicatas diluídas em etanol. Para cada concentração gradativa de BHT analisou-se triplicatas de reação em tubos tipo Falcons com 100 µL de cada concentração de BHT e adicionou-se, 500 µL da solução de gema de ovo 1:10, 400 µL de água destilada, 50 µL de AAPH, 1,5 mL de 30 BRASÍLIA 2017 4 Resultados e Discussão 4.1 Determinação da atividade antioxidante pelo método do fosfomolibdênio O método de avaliação da atividade antioxidante determina de modo quantitativo a redução de molibdênio VI para molibdênio V que poderá ser observado com a formação da coloração verde (PRIETO et al, 1999). Na análise em questão podemos observar que houve uma evidente correlação entre o poder de redução da espécie e a formação do complexo verde. Mostrando boa capacidade de atividade antioxidante. Os ensaios tiveram dois padrões de referência (ácido ascórbico e quercetina), os quais foram usados como padrões de equivalência para quantificar as amostras testadas. Foi observado pelo método de inibição da formação do complexo de fosfomolibdênio que as amostras de chá mostraram ter atividade antioxidante por terem inibido a formação de complexo. A quantificação foi realizada pela substituição das absorbâncias obtidas na equação da reta obtida por regressão linear da curva analítica dos padrões utilizados. Não foi observado diferenças significativas na atividade antioxidante das marcas avaliadas no Distrito Federal. 4.1.1 Curva padrão quercetina. A partir da regressão linear obteve-se a curva analítica do padrão quercetina (y = 1,457x + 0,1687, r = 0,9950) (figura 4). 31 BRASÍLIA 2017 C o n c o n t r a ç ã o (m g /m L ) A b s o r b â n c ia 0 .0 0 0 .0 5 0 .1 0 0 .1 5 0 .2 0 0 .2 5 0 .0 0 .1 0 .2 0 .3 0 .4 0 .5 y = 1 ,4 5 7 x + 0 ,1 6 8 7 r = 0 ,9 9 5 0 Figura 04: Curva padrão da atividade antioxidante de quercetina pelo método de inibição do complexo fosfomolibdênio. A partir da equação, podemos correlacionar o quanto a amostra é equivalente ao padrão (Tabela 1) e a partir dos valores obtidos foi aplicado o teste de comparação Kruskal- Wallis -Dunn’s (Figura 05). Além disso, foi observado que as marcas entre si demostraram diferenças significativas apenas após as 12 horas entre as marcas B2 e C2 (Figura6). Tabela 1 - Atividade antioxidante avaliada pelo método de inibição da formação do complexo de fosfomolibdênio dos chás preparados a partir das flores de Hibiscus sabdariffa L. do padr ão. Os dado s repre senta m a médi a das triplicatas dos valores de equivalência ± desvio padrão da quantidade equivalente do padrão de quercetina (QE) de 3,9 µg das flores. As letras A, B e C representam lote/marca dos produtos adquiridos contendo a droga vegetal de H. sabdariffa. O número “1” posterior as letras A B e C refere- se aos chás avaliados depois de uma hora de preparo e o número “2” refere-se aos chás avaliados depois de doze horas de preparo. Amostra Concentração µg/ml Média ± desvio padrão (3,9 QE/µg); A1 400 0,233 ± 0,009 B1 400 0,246 ± 0,015 C1 400 0,138 ± 0,000 A2 400 0,140 ± 0,010 B2 400 0,116 ± 0,002 C2 400 0,068 ± 0,008 32 BRASÍLIA 2017 Figura 05: Atividade antioxidante avaliada pelo método de inibição da formação do complexo fosfomolibdênio dos chás preparados a partir das flores de Hibiscus sabdariffa L. Kruskal-Wallis – Dunn’s. Os dados representam mediana das triplicatas ± intervalo interquartis. Não foram detectadas diferenças significativas (p < 0,05) entre as amostras analisadas. As letras A, B e C representam lote/marca dos produtos adquiridos contendo a droga vegetal de H. sabdariffa. O número “1” posterior as letras A, B e C refere- se aos chás avaliados depois de uma hora de preparo e o número “2” refere-se aos chás avaliados depois de doze horas de preparo. E q u iv a lê n c ia d e q u e r c e ti n a ( µ g /m L ) A 1 B 1 C 1 0 .0 0 .1 0 .2 0 .3 A m o s tra s E q u iv a lê n c ia d e q u e r c e ti n a ( µ g /m L ) A 2 B 2 C 2 0 .0 0 0 .0 5 0 .1 0 0 .1 5 0 .2 0 A m o s tra s * Figura 06: Atividade antioxidante avaliada pelo método de inibição da formação do complexo de fosfomolibdênio dos chás preparados a partir das flores de Hibiscus sabdariffa L. Kruskal- Wallis – Dunn’s. Os dados representam a médiana das triplicatas ± intervalo interquartis. Foram detectadas diferenças significativas (p < 0,05) entres as amostras analisadas. *demostrou-se diferente de C2 entre as amostras analisadas. O número “1” posterior as letras A, B e C refere-se aos chás avaliados depois de uma hora de preparo e o número “2” refere-se aos chás avaliados depois de doze horas de preparo. Outro ponto observado é que ao decorrer do tempo de preparo, houve decréscimo da atividade antioxidante nos chás de 1 hora para 12 horas, na amostra A se obteve decréscimo de 39%, já na amostra B C o decréscimo foi de 50%, entretanto através do método de comparação por Wilcoxon, não houve diferenças significativas estatisticamente, logo o chá mesmo após 12 horas de preparo manteve 35 BRASÍLIA 2017 Os dados representam a média das triplicatas dos valores de equivalência ± desvio Padrão da quantidade equivalente do padrão ácido ascórbico (QE) de 3,9 µg das flores. As letras A, B e C representam lote/marca dos produtos adquiridos contendo a droga vegetal de H. sabdariffa. O número “1” posterior as letras A, B e C refere-se aos chás avaliados depois de uma hora de preparo e o número “2” refere-se aos chás avaliados depois de doze horas de preparo Figura 09: Atividade antioxidante avaliada pelo método de inibição do complexo de fosfomolibdênio dos chás preparados a partir das flores de Hibiscus sabdariffa L. Kruskal- Wallis – Dunn’s. As letras A, B e C representam lote/marca dos produtos adquiridos contendo a droga vegetal de H. sabdariffa. Os dados representam médiana das triplicatas ± intervalo interquartis. Não foram detectadas diferenças significativas (p < 0,05) entre as amostras analisadas. O número “1” posterior as letras A,B e C refere-se aos chás avaliados depois de uma hora de preparo e o número “2” refere-se aos chás avaliados depois de doze horas de preparo. Amostra Concentração µg/ml Média ± desvio padrão (3,9QE/µg); A1 400 0,123 ± 0,003 B1 400 0,127 ± 0,005 C1 400 0,090 ± 0,000 A2 400 0,091 ± 0,003 B2 400 0,083 ± 0,000 C2 400 0,082 ± 0,028 36 BRASÍLIA 2017 E q u iv a lê n c ia d e á c id o a s c ó r b ic o ( µ g /m L ) A 1 B 1 C 1 0 .1 0 0 .1 5 0 .2 0 A m o s tra s E q u iv a lê n c ia d e á c id o a s c ó r b ic o ( µ g /m L ) A 2 B 2 C 2 0 .0 0 0 .0 5 0 .1 0 0 .1 5 A m o s tra s Figura 10: Atividade antioxidante avaliada pelo método de inibição da formação do complexo fosfomolibdênio dos chás preparados a partir das flores de Hibiscus sabdariffa L. Kruskal- Wallis – Dunn’s. Os dados representam médiana das triplicatas ± intervalo interquartis. Não foram detectadas diferenças significativas (p < 0,05) entres as amostras analisadas. As letras A, B e C representam lote/marca distintos dos produtos adquiridos contendo a droga vegetal de H. sabdariffa. O número “1” posterior as letras referem-se aos chás avaliados depois de uma hora de preparo e o número “2” refere-se aos chás avaliados depois de doze horas de preparo. Outro ponto a ser verificado é que ao decorrer do tempo de preparo, houve decrescimento da atividade antioxidante nos chás de 1 hora para 12 horas, na amostra A se obteve decréscimo (26%), já na amostra B um decréscimo (35%) e na amostra C o menor acréscimo (10%), entretanto através do método de comparação por Wilcoxon, não houve diferenças significativas estatisticamente, logo o chá mesmo após 12 horas de preparo é observado atividade antioxidante (Figura 11). Esses resultados são de grande ajuda para elucidar, como o chá se comporta no decorrer do preparo até a hora de consumo, os valores de equivalência em comparação ao padrão ácido ascórbico demostrados na tabela 2, se mostraram satisfatórios. Através desses resultados, pode de inferir que o usuário que faz o uso do chá no decorrer do dia, consegue adquirir as propriedades antioxidantes. 37 BRASÍLIA 2017 A m ostras E q u iv a lê n c ia d e á c id o a s c ó r b ic o ( µ g /m L ) A 1 A 2 0 .0 0 0 .0 5 0 .1 0 0 .1 5 A m ostras E q u iv a lê n c ia d e á c id o a s c ó r b ic o ( µ g /m L ) B 1 B 2 0 .0 0 0 .0 5 0 .1 0 0 .1 5 A m ostras E q u iv a lê n c ia d e á c id o a s c ó r b ic o ( µ g /m L ) C 1 C 2 0 .0 0 0 .0 5 0 .1 0 0 .1 5 Figura 11: Atividade antioxidante avaliado pelo método de inibição da formação do complexo fosfomolibdênio dos chás preparados a partir das flores de Hibiscus sabdariffa L. Comparando o tempo de preparo de cada chá por Wilcoxon. Os dados representam mediana das triplicatas ± intervalo interquartis. Não foram detectadas diferenças significativas (p < 0,05) entres as amostras analisadas. As letras A, B e C representam lote/marca dos produtos adquiridos contendo a droga vegetal de H. sabdariffa. O número “1” posterior as letras refere-se aos chás avaliados depois de uma hora de preparo e o número “2” aos chás avaliados depois de doze horas de preparo. 4.2 Ensaio ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) O método tem como mecanismo a degradação da mistura fluorescente misturada à radicais livres formando o radical peroxil (PRIOR et al, 2015). Os extratos demostram boa capacidade de absorção dos radicais livres, sendo capaz de proteger a molécula fluorescente. A análise foi realizada usando os valores de 40 BRASÍLIA 2017 chás avaliados depois de uma hora de preparo e o número “2” refere-se aos chás avaliados depois de doze horas de preparo. Outro ponto a ser observado foi a que ao decorrer do tempo de preparo, não houve decrescimento da atividade antioxidante aparente nos chás de 1 hora para 12 horas, para a análise, utilizando o teste de Wilcoxon, foi observado não haver diferenças significativas. Logo o chá mesmo após 12 horas de preparo mantem a atividade antioxidante (Figura 14). O resultado obtido pode ser comparado ao estudo de 2002, no qual o extrato aquoso se mostrou estável ao período de armazenamento (TSAI, P. et al,2002). Assim, atraves dos valores de IC50 (tabela 03) podemos confirmar que o chá possui estabilidade com até 12 horas de preparo. Entretanto, podemos observar que pelo método ORAC que algumas amostras de chá não tiveram atividade semelhante ao padrão utilizado, além de demostrar haver diferenças significativas na atividade antioxidante em duas marcas analisadas no Distrito Federal. 41 BRASÍLIA 2017 A m o s tra s IC 5 0 ( µ g /m L ) A 1 A 2 0 2 0 4 0 6 0 8 0 A m o s tra s IC 5 0 ( µ g /m L ) B 1 B 2 0 2 0 4 0 6 0 8 0 A m o s tra s IC 5 0 ( µ g /m L ) C 1 C 2 0 2 0 4 0 6 0 8 0 Figura 14: Atividade antioxidante avaliada por ensaio ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) dos chás preparados a partir das flores de Hibiscus sabdariffa L. Comparação da atividade antioxidante em relação ao tempo de preparo de cada chá por Wilcoxon test. Os dados representam a mediana das triplicatas ± intervalo interquartis. Não foram detectadas diferenças significativas (p < 0,05) entres as amostras analisadas. As letras A, B e C representam lote/marca distintos dos produtos adquiridos contendo a droga vegetal de H. sabdariffa. O número “1” posterior as letras refere-se aos chás avaliados depois de uma hora de preparo e o número “2” refere-se aos chás avaliados depois de doze horas de preparo. 42 BRASÍLIA 2017 4.3 Peroxidação Lipídica; O acúmulo dos produtos de degradação é uma das principais causas das disfunções celulares. No presente estudo, os lipídeos foram os alvos principais do ataque oxidativo, contribuindo para a produção de produtos de degradação. Os extratos demostram capacidade de neutralizar os radicais livres (SOTO et al., 2016). Chegamos a essa conclusão com a análise realizada usando os valores de inibição para calcular o IC50 (concentração inibitória de 50%), esses valores foram obtidos através de regressão linear e plotados graficamente no programa GraphPad Prism® Version 6.0. Por meio desses resultados observamos que o chá teve redução dos produtos de degradação com níveis baixos de IC50 (Tabela 4). Tabela 4- Atividade antioxidante avaliada por peroxidação lipídica dos chás preparados a partir das flores de Hibiscus sabdariffa L. e do padrão BHT (hidroxitolueno butilado). Os dados representam a média das triplicatas dos valores de IC50 ± desvio padrão (DP). As letras A, B e C representam lote/marca dos produtos adquiridos contendo a droga vegetal de H. sabdariffa. O número “1” posterior as letras A, B e C refere-se aos chás avaliados depois de uma hora de preparo e o número “2” refere-se aos chás avaliados depois de doze horas de preparo. O teste de comparação Kruskal- Wallis -Dunn’s, realizou a verificação de diferenças significativas com o Padrão BHT (IC50: 1,87 µg/mL), (hidroxitolueno butilado) (Figura 15), as marcas entre si demostraram diferenças significativas entre elas, a amostra B1 (IC50: 1,31 µg/mL), é diferente da C1 (IC50: 2,68 µg/mL), além da B2(IC50: 1,68 µg/mL), se mostrar diferente da C2 (IC50: 2,81 µg/mL). Dessa forma, analisando os dados observa-se diferenças significativas entre as marcas B e C (Figura 16), essa diferença pode ser devido a diferença de plantio da planta (MARÍN et al, 2015), como também o modo de que como é realizado o processo de Amostra IC50 µg/mL ± DP; BHT 1,87 ± 0,007 A1 1,84 ± 0,082 B1 1,31 ± 0,073 C1 2,68 ± 0,070 A2 1,83 ± 0,047 B2 1,68 ± 0,024 C2 2,81 ± 0,091 45 BRASÍLIA 2017 A m o s tra s IC 5 0 ( µ g /m L ) A 1 A 2 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5 2 .0 2 .5 A m o s tra s IC 5 0 ( µ g /m L ) B 1 B 2 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5 2 .0 A m o s tra s IC 5 0 ( µ g /m L ) C 1 C 2 0 1 2 3 4 Figura 17: Atividade antioxidante avaliada por peroxidação lipídica dos chás reparados a partir das flores de Hibiscus sabdariffa L. Comparação da atividade antioxidante em relação ao tempo de preparo de cada chá por Wilcoxon test. Os dados representam a mediana das triplicatas ± intervalo interquartis. Não foram detectadas diferenças significativas (p < 0,05) entres as amostras analisadas. As letras A, B e C representam lote/marca dos produtos adquiridos contendo a droga vegetal de H. sabdariffa. O número “1” posterior as letras referem-se aos chás avaliados depois de uma hora de preparo e o número “2” refere-se aos chás avaliados depois de doze horas de preparo. 46 BRASÍLIA 2017 Através desses resultados podemos observar nos três testes que o tempo de preparo de até 12 horas, não interfere na atividade antioxidante do chá, havendo semelhanças entre eles. As diferenças de resultados obtidos, sobre a semelhança das marcas estudadas, podem ser explicadas através da literatura na qual é observado que alimentos nas suas várias composições químicas, podem influenciar no estudo (YERDI et al, 2007), sendo necessário assim três testes distintos nos quais dois apresentaram diferença significantiva entre as marcas B e C. Logo, podemos inferir que há diferenças entre duas marcas de chá comercializadas, essas diferenças podem estar relacionadas aos níveis de substâncias, que variam de acordo com o tratamento dado ao plantio da planta de origem (MARÍN et al, 2015), como também o modo de que como é realizado o processo de desidratação da planta, o processo de embalagem e de como esse material é transportado até chegar ao consumidor. Outro fator importante a ser abordado é a venda irregular de chás que não possuem embalem própria, nem empresa com CNPJ disponível. Pondo em risco a saúde da população, que não consegue ter um produto que apresentam qualidade, segurança e efetividade. A comprovação da continuação da atividade oxidante em até 12 horas de preparo, apresenta a H. sabdariffan como fonte natural estável para a obtenção de nutrientes, sendo necessário mais estudo que permitam uma maior compreensão dos efeitos do chá e sua segurança em humanos (ANJOS et al, 2017), além de observar como o chá pode interagir com outros fármacos. Principalmente pelo fato de que o chá é visto na regulamentação como alimento, sendo encontrado principalmente em feiras, supermercados e lojas de suplementos alimentares o que causa uma falsa percepção de que fazer o uso do chá desenfreadamente não acarretará possíveis danos como o comprometimento da função hepatica e do sistema reprodutor masculino (CASTRO, 2003). Nesse quadro, podemos ver que se deve aprimorar os estudos nesse campo, visando a qualidade de vida da população. Devido ao fato de encontrarmos na literatura divergências sobre o potencial de interação do extrato aquoso da H. sabdariffan. Segundo o estudo de 2006, a atividade do extrato aquoso da planta não modulou a atividade do cytocromo P450 (Prommetta et al,2006). Entretanto outro 47 BRASÍLIA 2017 estudo realizado em 2013, demostra que o extrato etanolico possui inibição de nove isorformas do cytocromo P450 ,logo, o extrato aquoso poderá ter interação mesmo sendo em menor intensidade. Sua administração poderá acarretar então a inibição do fármaco pelo mecanismo de primeira passagem (JOHNSON et al., 2013). Assim sendo, o uso devido aos seus vários benefícios, pode ser interessante para o controle de doenças crônicas, entretanto o uso de múltiplos medicamentos em algumas patologias, como exemplo o efeito antioxidante envolvido em doenças cardiovasculares (SOTO et al, 2016). Poderá acarretar em uma administração erronea, podendo trazer interações aos medicamentos em uso. No caso douso da planta para o tratamento da aterosclerose (TCHOUYA et al, 2016), o consumidor deverá ter cuidado, devido ao fato de que o chá com demostrou interação com o diclofenaco A interação tem como característica a redução da excreção do fármaco, o que pode levar a um aumento ou decaimento da faixa terapêutica ideal (FAKEYE et al., 2007). Assim sendo, a inclusão do chá de H. sabdariffan como fitoterápico na legislação possibilitará mais estudos sobre o assunto, além permitir a inclusâo na RDC ° 26, de 13 de maio de 2014, que preconiza sobre o registro de medicamentos fitoterápicos e o registro e a notificação de produtos tradicionais fitoterápicos (BRASIL,2014). 50 BRASÍLIA 2017  BORGES.L.L,et al. Uma abordagem sobre métodos analíticos para determinação da atividade antioxidante em produtos naturais. 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