INSTRUÇÃO NORMATIVA Nº 62, DE 26 DE AGOSTO DE 2003 - MAPA, Esquemas de Gestão da Qualidade

Baixe INSTRUÇÃO NORMATIVA Nº 62, DE 26 DE AGOSTO DE 2003 - MAPA e outras Esquemas em PDF para Gestão da Qualidade, somente na Docsity! MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO. SECRETARIA DE DEFESA AGROPECUÁRIA. INSTRUÇÃO NORMATIVA Nº 62, DE 26 DE AGOSTO DE 2003. Oficializar os Métodos Analíticos Oficiais para Análises Microbiológicas para Controle de Produtos de Origem Animal e Água O SECRETÁRIO DE DEFESA AGROPECUÁRIA, DO MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO, no uso da atribuição que lhe confere o art. 83, inciso IV, do Regimento Interno da Secretaria, aprovado pela Portaria Ministerial nº 574, de 8 de dezembro de 1998, resolve: Art. 1º Oficializar os Métodos Analíticos Oficiais para Análises Microbiológicas para Controle de Produtos de Origem Animal e Água, com seus respectivos capítulos e anexos, em conformidade com o anexo desta Instrução Normativa, determinando que sejam utilizados no Sistema de Laboratório Animal do Departamento de Defesa Animal. Parágrafo único. A metodologia de que trata este artigo será atualizada, sempre que a inovação tecnológica assim recomendar, por meio de ato do Diretor do Departamento de Defesa Animal. Art. 2º Esta Instrução Normativa entra em vigor na data da sua publicação. MAÇAO TADANO ANEXO MÉTODOS ANALÍTICOS OFICIAIS PARA ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS PARA CONTROLE DE PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL E ÁGUA CAPÍTULO I - CONTAGEM PADRÃO DE MICRORGANISMOS MESÓFILOS AERÓBIOS ESTRITOS E FACULTATIVOS VIÁVEIS 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a contagem padrão de microrganismos mesófilos aeróbios estritos e facultativos viáveis. Aplica-se a amostras de matérias-primas, água e alimentos. 2. FUNDAMENTOS Baseia-se na semeadura da amostra ou de suas diluições em ágar padrão para contagem seguida de incubação em temperatura de 36 ± 1ºC por 48 horas. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos; Agar padrão para contagem (PCA); Solução salina peptonada 0,1%. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos. 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 ± 0,2 g ou pipetar 25 ± 0,2 mL da amostra, de acordo com as instruções contidas no Anexo V, “Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras”, deste Manual. Adicionar 225 mL de solução salina peptonada 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em “stomacher”. Esta é a diluição 10-1. 5.2 Inoculação em placas: A partir da diluição inicial (10-1), efetuar as demais diluições desejadas em solução salina peptonada 0,1%, de acordo com as instruções contidas no Anexo II, “Diluições e soluções”, deste Manual. Semear 1 mL de cada diluição selecionada em placas de Petri estéreis. Adicionar cerca de 15 a 20 mL de PCA fundido e mantido em banho-maria a 46-48ºC. Homogeneizar adequadamente o ágar com o inóculo. Deixar solidificar em superfície plana. 5.3 Incubação: Incubar as placas invertidas a 36 ± 1°C por 48 horas. 5.4 Leitura: Segundo o tipo de amostra em análise, realizar a leitura selecionando as placas de acordo com o seguinte critério, contando todas as colônias presentes: Produtos em geral: Placas que contenham entre 25 e 250 colônias; CONTAGEM DE MICRORGANISMOS MESÓFILOS AERÓBIOS VIÁVEIS CAPAZES DE CAUSAR ALTERAÇÃO EM PRODUTOS LÁCTEOS LÍQUIDOS UHT 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a contagem de microrganismos mesófilos aeróbios viáveis em produtos UHT, com exclusão daqueles comprovadamente não patogênicos e não causadores de alterações físicas, químicas e organolépticas do produto. Detectar a presença de Bacillus sporothermodurans para diferenciá-lo dos demais microrganismos mesófilos aeróbios viáveis. Aplica-se a amostras de produtos lácteos líquidos, tratados pelo processo UHT. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Pré-incubação: Baseia-se na incubação das amostras em estufa a 36 ± 1ºC por 7 dias e posterior verificação da ocorrência de alterações das características do produto. 2.2 Contagem em placa: Baseia-se na semeadura da amostra e suas diluições em ágar cérebro-coração e em ágar nutriente isento de extrato de levedura, seguida de incubação a 30 ± 1ºC por 72 horas, e posterior identificação dos microrganismos presentes. 2.3 Limitações do Método: Devido à opacidade produzida pela homogeneização do meio de cultura com alguns tipos de amostras, pode haver dificuldade para a contagem de colônias na diluição 100. Nesses casos, o resultado final deve ser obtido nas diluições subseqüentes, o que pode resultar em dados finais estimados. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos; Ágar cérebro-coração (ABHI); Ágar nutriente isento de extrato de levedura; Ágar esculina; Caldo cérebro-coração nitrato (BHI-NO3); Caldo vermelho de fenol com glicose; Solução salina peptonada 0,1%; Ágar uréia; Reativo para oxidase (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de para-amino- dimetilanilina) ou tiras para teste de oxidase (comercialmente disponíveis); Peróxido de hidrogênio 3%; Alfa-naftilamina 0,5%; Ácido sulfanílico 0,8%; Corantes para coloração de Gram; Zinco em pó; Etanol 70% ou Etanol 70º GL; Reagentes para coloração de Gram. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos. 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Preparo da amostra: Após a pré-incubação, as amostras visualmente inalteradas devem ser agitadas por 25 vezes. Antes da abertura, desinfetar externamente as embalagens com solução desinfetante e após com etanol 70% ou etanol 70º GL. Deixar secar. Com auxílio de tesouras ou bisturis previamente esterilizados, abrir a embalagem. Caso se observe alteração evidente (coagulação, floculação, dessoração, odor não característico ou outros), interromper a análise e reportar como “produto alterado após incubação a 36 ± 1ºC por 7 dias”. As amostras que apresentarem qualquer alteração não devem ser analisadas. Reportar o resultado como “amostra alterada”, incluindo informações sobre o tipo de alteração observada. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle específicos estabelecidos pelo laboratório. 5.3 Contagem em placas: Diluir a amostra em tubos contendo 9 mL de solução salina peptonada 0,1% até 10-2. Pipetar 1mL diretamente da amostra (100) e 1 mL de cada uma das diluições preparadas (10-1 e 10-2), transferindo-as para placas de Petri estéreis, em duplicata. Adicionar cerca de 20 mL de ágar cérebro-coração (ABHI) a uma das placas de cada diluição. Nas demais, adicionar cerca de 20mL de ágar nutriente isento de extrato de levedura. Homogeneizar adequadamente os meios com os inóculos. Deixar solidificar. Inverter as placas. 5.4 Incubação: Incubar as placas a 30 ± 1ºC por 72 horas. 5.5 Leitura: Verificar a presença de colônias nas placas, contando cada uma e observando suas características. Selecionar placas que contenham entre 25 e 250 colônias para a realização da contagem. Se os resultados de contagem obtidos em ambos os meios forem coerentes entre si, proceder conforme Anexo IV, “Procedimentos para contagem de colônias”, deste Manual. Se os resultados forem discrepantes entre si, considerar o resultado obtido nas placas de ABHI. Quando o crescimento bacteriano é devido à presença de esporos de Bacillus sporothermodurans na amostra em análise, será observado nas placas de ABHI um abundante crescimento de colônias lisas, de forma regular, com coloração entre branco e bege, com diâmetro máximo de 3 mm, facilmente identificáveis. No ágar nutriente isento de extrato de levedura, o Bacillus sporothermodurans comumente não forma colônias visíveis, porém poderão se desenvolver colônias puntiformes, de coloração entre branco e bege. Esta diferenciação é necessária porque as colônias de B.sporothermodurans não devem ser contabilizadas no cálculo de mesófilos aeróbios viáveis capazes de causar alteração no produto. Quando for observado crescimento em ambos os meios, realizar a contagem nas placas de ABHI, registrando em separado o número de colônias suspeitas de serem Bacillus sporothermodurans, que deverão ser confirmadas de acordo com o que segue: Repicar 3 a 5 colônias suspeitas para tubos com ABHI inclinado. Incubar a 36 ± 1ºC por até 72h. Realizar os testes confirmatórios. 5.6 Coloração de Gram Preparar esfregaço e corar pelo método de Gram, conforme instruções constantes do Anexo VII, “Procedimentos de coloração”, deste Manual. Quando forem observados bastonetes Gram positivos, realizar a prova da catalase conforme item 5.7. Quando forem observados microrganismos com morfologia e características diferentes de bastonetes Gram positivos, reportar o número encontrado como a contagem total de microrganismos aeróbios mesófilos. 5.7 Catalase: Com auxílio de alça de platina, palito de madeira, bastão de vidro ou Pipeta de Pasteur, estéreis, transferir a cultura para uma lâmina ou placa de vidro contendo uma gota de peróxido de hidrogênio 3%. Misturar o inóculo ao peróxido e observar a reação. A não formação de borbulhas indica prova negativa para catalase. A formação de borbulhas indica prova positiva para catalase. A maioria dos membros do gênero Bacillus apresentam reação de catalase positiva. Quando a coloração de Gram demonstrar a presença de bastonetes Gram positivos e a prova da catalase for positiva para a cultura em teste, confirmar a presença de Bacillus sporothermodurans por meio das provas da oxidase, crescimento em anaerobiose, hidrólise da esculina, fermentação da glicose, redução do nitrato e produção de urease, conforme abaixo descrito. 5.8 Oxidase: Usando alça de platina, Pipeta de Pasteur, palitos de madeira ou de plástico, descartáveis e estéreis, realizar a prova de oxidase, espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase ou sobre tiras para teste de oxidase. Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Após esse tempo, reações falso positivas podem ocorrer. O aparecimento de cor azul (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina) ou vermelho intenso (oxalato de para-amino-dimetilanilina) é indicativo de uma reação positiva. Não utilizar alças de níquel-cromo ou alças de aço inoxidável para realizar a prova de oxidase, pois traços de óxido de ferro na superfície flambada pode produzir reação falso positiva. O Bacillus sporothermodurans apresenta reação de oxidase positiva. 5.9 Crescimento em anaerobiose: Inocular a cultura em tubos de ABHI inclinados e incubar em jarra de anaerobiose a 36 ± 1ºC por 72h. O Bacillus sporothermodurans não cresce em anaerobiose. 5.10 Hidrólise da esculina: Inocular a cultura, com agulha, em tubos contendo ágar esculina inclinado. Incubar a 36 ± 1ºC por 72h. A hidrólise da esculina é evidenciada pelo enegrecimento do meio. O Bacillus sporothermodurans hidrolisa a esculina. Meio leite com ferro; Meio lactose-gelatina; Caldo vermelho de fenol-base; Solução de rafinose 10% ; Caldo de carne cozida (opcional caldo Tarozzi); Meio tioglicolato; Alfa naftilamina 0,5%; Ácido sulfanílico 0,8%; Solução de cicloserina 5%; Polimixina B; Kanamicina; Vaspar ou óleo mineral ou parafina líquida; Gerador de anaerobiose; Reagentes para coloração de Gram. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos. 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 ± 0,2 g da amostra de acordo com as instruções contidas no Anexo V, “Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras”, deste Manual. Adicionar 225 mL de solução salina peptonada 0,1% e homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em “stomacher”. Essa é a diluição 10-1. 5.2 Procedimentos de controle Aplicar os procedimentos de controle específicos estabelecidos pelo laboratório. 5.3 Inoculação em Placas A partir da diluição inicial 10-1, efetuar as diluições desejadas de acordo com o Anexo II, “Diluições e soluções”, deste Manual. A partir das diluições escolhidas, semear alíquotas de 1 mL em placas estéreis e adicionar cerca de 15 mL de ágar TSC ou SFP em temperatura de 46 - 48ºC. Homogeneizar cuidadosamente e deixar solidificar em superfície plana. Após, adicionar uma segunda camada de cerca de 10 mL do mesmo meio. Deixar solidificar em superfície plana. 5.4 Incubação: Imediatamente após a solidificação do ágar, incubar as placas (sem inverter), em jarra de anaerobiose a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas. 5.5 Seleção e Isolamento: As colônias típicas de Clostridium sulfito redutores são negras e de tamanho variável de 1 a 3 mm no ágar TSC e no ágar SFP. Selecionar placas que contenham entre 20 e 200 colônias típicas. Contar todas as colônias negras presentes. Anotar o resultado. Esse resultado, multiplicado pela diluição usada, corresponde ao número de Clostridium sulfito redutores presentes por grama da amostra em análise. Escolher 5 colônias negras e repicar para tubos com ágar estoque. Incubar em anaerobiose a 36 ± 1ºC por no mínimo 24 horas. Paralelamente, repicar para meio tioglicolato ou caldo de carne cozida (com selo estéril de vaspar ou vaselina ou parafina líquida ou óleo mineral). 5.6 Testes confirmativos para Clostridium perfringens 5.6.1 Coloração de Gram: A partir de cultura pura em ágar estoque ou dos meios usados paralelamente, preparar esfregaço e corar pelo método de Gram. Quando for verificada a presença de bastonetes retos com extremidades arredondadas, Gram-positivos, realizar a prova de fermentação tempestuosa. 5.6.2 Fermentação tempestuosa (storm test): Transferir 1 mL da cultura fresca obtida no meio tioglicolato ou no caldo de carne cozida para um tubo contendo meio leite com ferro. Adicionar o selo estéril e incubar a 46 ± 1ºC em banho-maria por 6 horas (reincubar por maior tempo (12 a 18 h) quando o controle positivo não apresentar reação claramente positiva). Alternativamente, pode ser utilizada uma suspensão da cultura em teste, obtida pela lavagem da superfície do ágar estoque com solução salina peptonada 0,1%, transferindo 1 mL desta para o meio leite com ferro. O Clostridium perfringens geralmente coagula o leite em até 6 horas a 46ºC, com formação de coágulo firme e grande quantidade de gás (“fermentação tempestuosa”). A partir das culturas que se apresentaram como C.perfringens na coloração de Gram e ofereceram resultado positivo na prova de fermentação tempestuosa, realizar as seguintes provas: 5.6.3 Prova da motilidade Inocular a cultura, com agulha, em ágar motilidade-nitrato tamponado. Incubar em anaerobiose a 36 ± 1ºC por 24 horas. O Clostridium perfringens é imóvel, com crescimento apenas ao longo da linha de inoculação. 5.6.4 Prova da redução do nitrato: Após a leitura da motilidade, acrescentar ao ágar 0,5 a 1 mL de solução de alfa-naftilamina 0,5% e 0,5 a 1 mL de ácido sulfanílico 0,8%. O aparecimento de coloração vermelha indicará a redução do nitrato a nitrito. Para confirmação do resultado negativo, acrescentar alguns miligramas de pó de zinco. O aparecimento de uma cor rosa será indicativo da não redução do nitrato, enquanto que a não alteração de cor será indicativa de reação positiva para redução do nitrato. O Clostridium perfringens reduz nitrato a nitrito. 5.6.5 Fermentação da lactose e liquefação da gelatina: Inocular a cultura, com agulha, em vários pontos do meio lactose-gelatina. Se o meio for utilizado 8 ou mais horas após a sua preparação, regenerá-lo por aquecimento a 50ºC por 2 horas em banhomaria, antes da inoculação. Incubar em anaerobiose a 36 ± 1ºC por 44 ± 2h. Após a incubação, manter os tubos em geladeira por 1 hora. Observar a fermentação da lactose pela produção de bolhas de gás e pela mudança da cor do meio de vermelho para amarelo e também a liquefação da gelatina por meio da permanência do estado líquido após o resfriamento por cerca de 1 hora em geladeira. O Clostridium perfringens fermenta a lactose e liquefaz a gelatina em 44 ± 2h a 36 ± 1ºC. 5.6.6 Fermentação da rafinose: Repicar a cultura para tubo contendo caldo para fermentação da rafinose. Após inoculação, adicionar 1 a 2 mL de selo estéril: vaspar ou vaselina ou parafina líquida ou óleo mineral. Incubar a 36 ± 1ºC por 72 ± 2h. Verificar a fermentação da rafinose pela viragem da cor do indicador vermelho de fenol para amarelo. As provas de liquefação da gelatina em 44 ± 2h horas e a fermentação da rafinose em 72 ± 2h tornam possível a diferenciação entre Clostridium perfringens e outros clostrídios imóveis e redutores de nitrato como o Clostridium celatum, Clostridium sardiniense e Clostridium paraperfringens. O Clostridium perfringens fermenta a rafinose dentro de 72 ± 2h. CARACTERÍSTICAS DIFERENCIAIS DE CLOSTRÍDIOS Meio motilidade nitrato Meio lactose-gelatina Espécies de Clostridium Motilidade Nitrato Ácido/ gás Liquefação.gelatina C. perfringens A - + AG/T + (48h) C.perfringens B - + AG/T + (48/72h) C. absonum + + AG/CS -* C. baratii - + AG/CS - C. celatum - + AG/CS - C. paraperfringens - + AG/CS - C. sardiniense ± ± AG/CS -* A = ácido; AG = ácido e gás; T = turbidez; CS = claro com sedimento celular; + = positiva; - = negativa; (+) = fraco; ± = motilidade fraca; * = hidrólise lenta da gelatina 6. RESULTADOS 6.1 Cálculo do número de Clostridium sulfito redutores presentes na amostra: Calcular o número de Clostridium sulfito redutores multiplicando o número de colônias negras contadas no ágar TSC ou no ágar SFP pelo fator de diluição usado, conforme recomendações constantes do Anexo IV, “Procedimentos para contagem de colônias”, deste Manual. 6.2 Cálculo do número de Clostridium perfringens: Considerar como Clostridium perfringens as colônias que se apresentarem, na coloração de Gram, como bastonetes Gram positivos, retos, com extremidades arredondadas, positivos para a prova de fermentação tempestuosa, imóveis, redutores de nitrato, fermentadores da lactose em 44 ± 2h, da rafinose em até 72 ± 2h e capazes de hidrolizar a gelatina em 44 ± 2h. A partir dos dados obtidos, calcular o número de microrganismos presentes, de acordo com o Anexo IV, “Procedimentos para a contagem de colônias”, deste Manual. Expressar o resultado em UFC/g. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA RHODEHAMEL, E.J.; HARMON, S.M. Clostridium perfringens. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponível em: http://www.cfsan.fda.gov. LABBE, R.G. Clostridium perfringens. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.325-330. apenas um dos halos. Registrar separadamente as contagens de colônias típicas e atípicas. Selecionar 3 a 5 colônias de cada tipo (T) e/ou (A) e semear cada colônia em tubos contendo BHI, para confirmação. Incubar a 36 ± 1ºC, por 24 horas. Observação: para a obtenção do número final de UFC/mL ou g, utilizar, de preferência, apenas uma diluição, pois, uma colônia atípica pode tornar-se típica na diluição subseqüente em função da maior disponibilidade de nutrientes e pela menor competição bacteriana. 5.6 Prova da coagulase: Transferir 0,3 mL de cada tubo de cultivo em BHI para tubos estéreis contendo 0,3 mL de plasma de coelho. Incubar a 36 ± 1ºC por 6 horas. Verificar a presença de coágulos, considerando os critérios a seguir: Reação negativa: não formação de coágulo; Reação 1+ : coágulo pequeno e desorganizado; Reação 2+ : coágulo pequeno e organizado; Reação 3+ : coágulo grande e organizado; Reação 4+: coagulação de todo o conteúdo do tubo, que não se desprenderá quando o tubo for invertido; Quando a reação de coagulação for do tipo 3+ e 4+, considerar a prova positiva para Staphylococcus aureus; Quando a reação de coagulação for negativa, considerar a prova negativa para Staphylococcus aureus. Quando a reação for duvidosa do tipo 1+ e 2+, repicar do mesmo caldo de cultura para um tubo contendo ágar estoque ou outro contendo caldo BHI. Incubar a 36 ± 1ºC por 24 horas, para a realização dos testes complementares. 5.7 Testes complementares: A partir da cultura pura em BHI ou ágar estoque, realizar as seguintes provas confirmativas: 5.7.1 Coloração de Gram: Preparar esfregaço e corar pelo método de Gram. A ausência de cocos Gram positivos indica teste negativo para Staphylococcus aureus. A presença de cocos Gram positivos indica a necessidade da realização de testes complementares. 5.7.2 Pesquisa de termonuclease: Fazer orifícios eqüidistantes com cerca de 2 mm de diâmetro no ágar para ensaio de termonuclease ou no ágar azul de toluidina - DNA, em placas previamente preparadas. Colocar os tubos das culturas, mantidos em caldo BHI, em banho-maria fervente por 15 minutos. Deixar esfriar e preencher completamente um orifício para cada cultivo a ser analisado. Incubar a 36 ± 1ºC por 4 horas ou a 50 ± 2ºC por 2 horas. O aparecimento, ao redor dos orifícios, de um halo rosa no ágar azul de toluidina ou de um halo de clarificação no agar para ensaio de DNAse com verde de metila, será indicativo de reação positiva para termonuclease. Considerar como positivas as culturas que apresentarem halo de diâmetro superior a 1 mm. O Staphylococcus aureus é termonuclease positiva. 5.7.3 Prova da catalase: Com auxílio de alça de platina, bastão de vidro, palito de madeira ou Pipeta de Pasteur, estéreis, retirar uma alíquota do cultivo em ágar estoque e transferir para uma lâmina ou placa de vidro contendo uma gota de peróxido de hidrogênio a 3%. Misturar o inóculo ao peróxido e observar a reação. A não formação de borbulhas indica prova negativa para catalase. A formação de borbulhas indica prova positiva para catalase. O Staphylococcus aureus é catalase positiva. 6. RESULTADOS Quando o número de colônias confirmadas for igual ao número de colônias selecionadas e repicadas, o resultado será igual à contagem inicial, levando-se em consideração a diluição utilizada. Quando o número de colônias confirmadas for diferente do número de colônias selecionadas e repicadas, calcular a proporção de colônias positivas de acordo com o Anexo IV, “Procedimentos para contagem de colônias”, deste Manual. O resultado final será a soma dos resultados de colônias típicas e atípicas confirmadas. Expressar o resultado como: Contagem de Staphylococcus aureus: X x 10y UFC/ g ou mL ou Contagem de Staphylococcus coagulase positiva: X x10y UFC/ g ou mL. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA BENNETT, R.W.; LANCETTE, G.A. Staphylococcus aureus. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponivel em: http://www.cfsan.fda.gov BRASIL. Ministério da Agricultura e do Abastecimento. Regulamentos técnicos de identidade e qualidade de leite e produtos lácteos. Ministério da Agricultura e do Abastecimento/ Secretaria de Defesa Animal/ Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal/ Divisão de Normas Técnicas. Brasília, D.F. Série Regulamentação Técnica de Identidade e Qualidade de Produtos de Origem Animal; n.2. 1997, 77p. GUNN, B.A.Culture Media, Tests, and Reagents in Bacteriology. In: Clinical and Pathogenic Microbiology, Howard, B.J.; Keiser, J.F.; Smith, T.F. et all(Eds.). 2 ed. Mosby. St. Louis, 1994, p. 863-912. HOWARD. B. J.; KLOOS, W.E. Staphylococci. In: Clinical and Pathogenic Microbiology, Howard, B.J.; Keiser, J.F.; Smith, T.F. et all (Eds.). 2 ed. Mosby. St. Louis, 1994, p.243-256. LANCETTE, G. A.; TATINI, S.R. Staphylococcus aureus. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. P.387-403. MAC FADDIN, J.F. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clinica. Buenos Aires: Editorial Médica Panamericana S.A. 1980, p. 39-49 e 50-60. MAC FADDIN, J.F. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. Lippincott Williams& Wilkins, Baltimore, USA, 2000. 912p. PAHO. Organización Panamericana de la Salud. Contaminación microbiana de los alimentos vendidos en la vía pública en ciudades de América Latina y características socio- economicas de sus vendedores y consumidores. Almeida, C.R.; Schuch, D.M.T.; Gelli, D.S. et al. (Eds.). 1996, 176p. SALYERS, A.A; WHITT, D.D. Disease Without Colonization; Food-Borne Toxinoses caused by Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus, and Clostridium perfringens. In: Bacterial Pathogenesis: A Molecular Approach. Washington: ASM, 1994, p. 130-140. VARNAM, A.H.; EVANS, M.G. Foodborne Pathogens – Na illustrated text. London: Wolf Publishing Ltd, 1991.p. 235-265. CAPÍTULO VI CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES TERMOTOLERANTES EM ALIMENTOS 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a contagem de coliformes totais e coliformes termotolerantes em alimentos. Aplica-se a amostras de matérias-primas, alimentos e rações, devendo ser utilizada quando o limite máximo tolerado for igual ou superior a 100 UFC/g ou mL. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Prova presuntiva: Baseia-se na inoculação das diluições desejadas das amostras sob teste em ágar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA) e posterior contagem das colônias suspeitas. O ágar cristal violeta vermelho neutro bile apresenta em sua composição sais biliares e cristal violeta, responsáveis pela inibição de microrganismos Gram positivos e vermelho neutro, um indicador de pH que revela a fermentação da lactose pelos microrganismos presentes. A adição de sobrecamada visa a prevenção do crescimento e do espraiamento de colônias na superfície do ágar. 2.2 Prova confirmativa para coliformes totais; A confirmação da presença de coliformes totais é feita por meio da inoculação das colônias suspeitas em caldo verde brilhante bile 2% lactose e posterior incubação a 36 ± 1ºC. A presença de gás nos tubos de Durhan evidencia a fermentação da lactose presente no meio. O caldo verde brilhante bile 2% lactose apresenta em sua composição bile bovina e um corante derivado do trifenilmetano (verde brilhante) responsáveis pela inibição de microrganismos Gram positivos. 2.3 Prova confirmativa para coliformes termotolerantes: A confirmação da presença de coliformes termotolerantes é feita por meio da inoculação das colônias suspeitas em caldo EC e posterior incubação em temperatura seletiva de 45 ± 0,2ºC, em banho-maria com agitação ou circulação de água. A presença de gás nos tubos de Durhan evidencia a fermentação da lactose presente no meio. O caldo EC apresenta em sua composição uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante impedindo a sua acidificação. A seletividade é devido a presença de sais biliares responsáveis pela inibição de microrganismos Gram positivos. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidrarias e demais insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos; Ágar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA); Ágar estoque; Ágar Columbia sangue de carneiro desfibrinado; Ágar tirosina; Ágar motilidade - nitrato; Ácido sulfanílico solução 0,8%; Alfa-naftilamina solução aquosa 0,5%; Polimixina B - solução contendo 5.000 UI/mL; Emulsão de gema de ovo 50%; Sangue de carneiro desfibrinado; Ácido acético 5N; Zinco em Pó; Reagentes para coloração de corpúsculos de inclusão cristalina; Reagentes para coloração de Gram. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos. 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 ± 0,2 g ou pipetar 25 ± 0,2 mL da amostra de acordo com as instruções contidas no Anexo V, “Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras”, deste Manual. Adicionar 225 mL da solução salina peptonada 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em “stomacher”. Esta é a diluição 10-1. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle específicos estabelecidos pelo laboratório. 5.3 Inoculação A partir da diluição inicial 10-1, efetuar as diluições desejadas conforme o Anexo II, “Diluições e soluções”, deste Manual. Inocular sobre a superfície seca do ágar MYP ou ágar PEMBA 0,1 mL de cada diluição selecionada. Com auxilio de alça de Drigalski ou bastão tipo “hockey”, espalhar o inóculo cuidadosamente por toda a superfície do meio até completa absorção. Utilizar, no mínimo, duas diluições decimais ou duplicata da mesma diluição. Nos casos em que for necessária a obtenção de resultado menor que 100 UFC/g ou mL distribuir 1 mL da diluição 10-1 em 3 placas (0,4 mL, 0,3 mL e 0,3 mL). No caso de amostras líquidas, poderá ser inoculado 0,1 mL diretamente da amostra. 5.4 Incubação: Incubar as placas invertidas a 30 ± 1ºC por 30 a 48 horas. 5.5 Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 15 e 150 colônias. Contar as colônias rodeadas por um halo de precipitação opaco sobre um fundo róseo, no ágar MYP e azul turquesa com aspecto recortado, com cerca de 5 mm de diâmetro e rodeadas por halo de precipitação de lecitina hidrolizada, no ágar PEMBA. Selecionar 3 a 5 colônias típicas e semeá-las em tubos com ágar estoque inclinado. Incubar a 36 ± 1ºC por 24 horas. De cada tubo, fazer esfregaço e corar pelo método Gram para verificar a presença de bastonetes curtos Gram positivos, com extremidades quadradas dispostos em cadeias. Os esporos são centrais ou sub-terminais. Das culturas puras em ágar estoque inclinado, realizar as seguintes provas: 5.6 Identificação Bioquímica 5.6.1 Motilidade e redução de nitrato Inocular, com agulha, tubos contendo ágar motilidade-nitrato. Incubar a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas. Após incubação, verificar o tipo de crescimento presente. Culturas imóveis mostram crescimento apenas na linha de inoculação, enquanto que as móveis crescem de forma difusa. O Bacillus cereus em 50 a 90% dos casos mostra-se móvel. Após a leitura da motilidade, adicionar aos tubos 2 a 3 gotas de alfa naftilamina 0,5% e 2 a 3 gotas de ácido sulfanílico 0,8%. O aparecimento de coloração rosa indica positividade para redução de nitrato. Quando não houver desenvolvimento de coloração, adicionar ao tubo alguns miligramas de pó de zinco. Nesta situação, o aparecimento de coloração rosa indica reação negativa, enquanto que o não desenvolvimento de cor indica positividade. O Bacillus cereus reduz o nitrato a nitrito. 5.6.2 â-hemólise em ágar sangue de carneiro. Inocular por estria em placa com ágar sangue de carneiro. Incubar a 36 ± 1ºC por 24 horas. Observar a produção de â-hemólise característica do Bacillus cereus. Bacillus cereus é produtor de â-hemólise. 5.6.3 Decomposição da tirosina: Inocular por estrias a superfície de ágar tirosina (inclinado em tubo ou distribuído em placas). Incubar a 36 ± 1ºC por 48 horas. Após incubação, observar o aparecimento de uma zona clara próxima ao crescimento produzida pela decomposição da tirosina. Nos casos em que houver dúvidas, reincubar por até 7 dias a 36 ± 1ºC. O Bacillus cereus decompõe a tirosina. 5.6.4 Crescimento rizóide: Inocular com alça sobre a superfície seca de ágar nutriente, depositando o inóculo no ponto central da placa. Incubar a 36 ± 1ºC por 48 a 72 horas. Após incubação verificar o tipo de crescimento. Crescimento rizóide se caracteriza pelo aparecimento de colônias com longas extensões em forma de raízes ou longos fios, típicas de Bacillus mycoides. O Bacillus cereus não apresenta crescimento rizóide, porém algumas cepas podem apresentar colônias rugosas em forma de galáxia. 5.6.5 Teste para verificação da presença de corpúsculos de inclusão cristalina. A partir das culturas suspeitas repicadas em ágar estoque inclinado (item 5.5) e deixadas em temperatura ambiente por 2 a 3 dias, verificar a presença de corpúsculos de inclusão cristalina procedendo conforme item 7 do Anexo VII, “Procedimentos de coloração”, deste Manual. A presença de cristais tetragonais de toxina são abundantes em culturas velhas (3-4 dias) de Bacillus thuringiensis, que são liberados somente após a lise do esporângio. Verifica-se então a presença dos cristais e esporos livres. O Bacillus cereus não produz corpúsculos de inclusão cristalina. PROVAS DIFERENCIAIS PARA MICRORGANISMOS DO GÊNERO Bacillus Bacillus megaterium Bacillus cereus Bacillus thuringiensis Bacillus mycoides Bacillus anthracis Coloração de Gram + +a + + + Catalase + + + + + Motilidade ± ±b ± -c - Redução de nitrato -d + ± + + Hemólise em sangue de carneiro - + + + -d Decomp. da tirosina ± + + ± -d Corpúsc.de inclusão cristalina - - + - - Crescimento rizóide - - - + - a: 90 a 100% são positivos b: 50 a 90% são positivos c: 90 a 100% são negativos d: a maioria é negativa 6.RESULTADOS A partir dos dados obtidos, calcular o número de microrganismos presentes na amostra em análise seguindo as instruções contidas no Anexo IV, “Procedimentos para contagem de colônias”, deste Manual. Calcular o número de Bacillus cereus multiplicando o número de colônias confirmadas, nas provas confirmativas, pelo fator de diluição usado, conforme recomendações constantes no Anexo III, “Procedimentos básicos de contagem”, deste Manual. Expressar o resultado em UFC/g ou mL. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA BRASIL. Ministério da Agricultura e do Abastecimento. Regulamentos técnicos de identidade e qualidade de leite e produtos lácteos. Ministério da Agricultura e do Abastecimento/ Secretaria de Defesa Animal/ Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal/ Divisão de Normas Técnicas. Brasília, D.F. Série Regulamentação Técnica de Identidade e Qualidade de Produtos de Origem Animal; n.2. 1997, 77p. BENNETT, R.W.and BEHY, N. . Bacillus cereus . In: Compendium of Methods for the Publishing Ltd. 1991, 557p. CAPÍTULO IX NÚMERO MAIS PROVÁVEL DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES TERMOTOLERANTES EM ÁGUA E GELO 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para determinação do Número Mais Provável de coliformes totais e coliformes termotolerantes em amostras de água e gelo. Aplica-se a amostras de água e de gelo usados em estabelecimentos produtores de alimentos. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Prova presuntiva: Baseia-se na inoculação da amostra em caldo lauril sulfato de sódio, em que a presença de coliformes é evidenciada pela formação de gás nos tubos de Durhan, produzido pela fermentação da lactose contida no meio. O caldo lauril sulfato de sódio apresenta, em sua composição, uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante, impedindo a sua acidificação. A seletividade do meio se deve à presença do lauril sulfato de sódio, um agente surfactante aniônico que atua na membrana citoplasmática de microrganismos Gram positivos, inibindo o seu crescimento. 2.2 Prova confirmativa para coliformes totais: confirmação da presença de coliformes totais é feita por meio da inoculação dos tubos positivos para a fermentação de lactose, na prova presuntiva, em caldo verde brilhante bile 2% lactose, e posterior incubação a 36 ± 1ºC. A presença de gás nos tubos de Durhan do caldo verde brilhante evidencia a fermentação da lactose presente no meio. O caldo verde brilhante bile 2% lactose apresenta em sua composição bile bovina e um corante derivado do trifenilmetano (verde brilhante), responsáveis pela inibição dos microrganismos Gram positivos. 2.3 Prova confirmativa para coliformes termotolerantes: A confirmação da presença de coliformes termotolerantes é feita por meio da inoculação em caldo EC, com incubação em temperatura seletiva de 45 ± 0,2ºC a partir dos tubos positivos obtidos na prova presuntiva. A presença de gás nos tubos de Durhan evidencia a fermentação da lactose presente no meio. O caldo EC apresenta em sua composição uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante, impedindo a sua acidificação. A seletividade do meio se deve à presença de sais biliares, responsáveis pela inibição dos microrganismos Gram positivos. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos; Caldo lauril sulfato de sódio concentração simples; Caldo lauril sulfato de sódio concentração dupla; Caldo verde brilhante bile 2% lactose; Caldo EC; Solução salina peptonada 0,1%. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos. Banho-maria com movimentação de água (agitação ou circulação). 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Preparo da amostra: Preparar a amostra de água de acordo com as instruções contidas no Anexo V, “Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras", deste Manual. No caso de amostras de gelo, quando encaminhadas em frascos de boca larga, deixar descongelar no próprio frasco, sob refrigeração, pelo período necessário para seu completo descongelamento. Antes do início da análise, homogeneizar bem. Quando o gelo for encaminhado em sacos plásticos, colocar a amostra dentro de outro saco plástico resistente (sem perfurações) e deixar descongelar, sob refrigeração, pelo período necessário para seu completo descongelamento. Após descongelamento total, verificar a presença de água no saco plástico de proteção da amostra, o que indica a presença de perfurações na embalagem do gelo. Nesse caso, não analisar a amostra. Da mesma forma, as amostras de gelo que chegarem descongeladas ou em descongelamento deverão ser descartadas. Quando a embalagem da amostra de gelo mostrar evidências de que não continha perfurações, após o descongelamento total, homogeneizar bem e proceder à análise, seguindo o procedimento estabelecido para amostras de água. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle específicos estabelecidos pelo laboratório. 5.3 Prova presuntiva 5.3.1 Inoculação: Inocular volumes de 10 mL da amostra a ser analisada em uma série de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sódio em concentração dupla. Inocular volumes de 1 mL da amostra na segunda série de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sódio em concentração simples e volumes de 1 mL da diluição 10-1 na terceira série de 3 tubos contendo o mesmo meio. Observação: caso seja necessário um maior número de diluições, proceder de acordo com as instruções contidas no Anexo II, "Diluições e soluções", deste Manual. Neste caso, inocular volumes de 1 mL de cada uma das diluições efetuadas em séries de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sódio em concentração simples. Quando o limite de aceitação for <2,0/100mL, usar séries de 5 tubos. Quando o limite de aceitação for <1,0/100mL, usar séries de 10 tubos. 5.3.2 Incubação: Incubar os tubos a 36 ± 1°C por 24 a 48 horas. 5.3.3 Leitura: A suspeita de coliformes totais é indicada pela formação de gás nos tubos de Durhan (mínimo 1/10 do volume total) ou efervescência quando agitado gentilmente. Anotar o número de tubos positivos em cada série de diluição. Observação: A leitura pode ser feita após 24 horas de incubação, porém, só serão válidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo deverão ser reincubados por mais 24 horas. 5.4 Prova confirmativa 5.4.1 Coliformes Totais 5.4.1.1 Inoculação: Repicar cada tubo positivo de caldo lauril sulfato de sódio obtido na prova presuntiva, para tubo contendo caldo verde brilhante bile 2% lactose. 5.4.1.2 Incubação: Incubar os tubos a 36 ± 1°C por 24 a 48 horas. 5.4.1.3 Leitura: A presença de coliformes totais é confirmada pela formação de gás (mínimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescência quando agitado gentilmente. Anotar o número de tubos positivos em cada série de diluição. Observação: A leitura pode ser feita após 24 horas de incubação, porém, só serão válidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo deverão ser reincubados por mais 24 horas. 5.4.2 Coliformes termotolerantes 5.4.2.1 Inoculação: Repicar cada tubo positivo de caldo lauril sulfato de sódio obtido na prova presuntiva, para tubo contendo caldo EC. 5.4.2.2 Incubação: Incubar os tubos a 45 ± 0,2ºC, por 24 a 48 horas em banhomaria com agitação ou circulação de água. 5.4.2.3 Leitura: A presença de coliformes termotolerantes é confirmada pela formação de gás (mínimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescência quando agitado gentilmente. Anotar o resultado obtido para cada tubo, bem como a diluição utilizada. Observação: A leitura pode ser feita após 24 horas de incubação, porém, só serão válidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo deverão ser reincubados por mais 24 horas. 6. RESULTADOS A partir da combinação de números correspondentes aos tubos que apresentaram resultado positivo em cada um dos testes confirmativos (coliformes totais e coliformes termotolerantes), verificar o Número Mais Provável de acordo com o Anexo III, "Procedimentos básicos de contagem”, deste Manual. Certificar-se que a tabela de NMP usada é a indicada para o caso específico. Expressar o valor obtido em NMP/100 mL. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA APHA Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 20 ed. Washington DC. Clesceri, L.S.; Greenberg, A.E.; Eaton, A.D.; Franson, M.A.H. (Ed.), 1998. p. 9.47-9.55. HITCHINS, A.D.; FENG, P.; WATKINS W.D.; RIPPEY S.R.; CHANDLER L.A. Escherichia coli and the Coliform bacteria. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponível em: http://www.cfsan.fda.gov. KORNACKI, J.L.; JOHNSON, J.L. Enterobacteriaceae, Coliforms and Escherichia coli as Quality and Safety Indicators. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p. 69-82. CAPÍTULO X NÚMERO MAIS PROVÁVEL DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES TERMOTOLERANTES EM ALIMENTOS prova presuntiva, para tubo contendo caldo verde brilhante bile 2% lactose. 5.4.1.2 Incubação: Incubar os tubos a 36 ± 1°C por 24 a 48 horas. 5.4.1.3 Leitura: A presença de coliformes totais é confirmada pela formação de gás (mínimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescência quando agitado gentilmente. Anotar o número de tubos positivos em cada série de diluição. Observação: A leitura pode ser feita após 24 horas de incubação, porém, só serão válidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo deverão ser reincubados por mais 24 horas. 5.4.2 Coliformes Termotolerantes 5.4.2.1 Inoculação: Repicar cada tubo positivo de caldo lauril sulfato de sódio, obtido na prova presuntiva, para tubo contendo caldo EC. 5.4.2.2 Incubação: Incubar os tubos a 45 ± 0,2°C, por 24 a 48 horas em banho-maria com agitação ou circulação de água. 5.4.2.3 Leitura: A presença de coliformes termotolerantes é confirmada pela formação de gás (mínimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescência quando agitado gentilmente. Anotar o resultado obtido para cada tubo, bem como a diluição utilizada. Observação: A leitura pode ser feita após 24 horas de incubação, porém, só serão válidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo deverão ser reincubados por mais 24 horas. 6. RESULTADOS A partir da combinação de números correspondentes aos tubos que apresentaram resultado positivo em cada um dos testes confirmativos (coliformes totais e coliformes termotolerantes), verificar o Número Mais Provável de acordo com o Anexo III, "Procedimentos básicos de contagem”, deste Manual. Certificar-se que a tabela de NMP usada é a indicada para o caso específico. Expressar o valor obtido em NMP/g ou mL. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA HITCHINS, A.D.; FENG, P.; WATKINS W.D.; RIPPEY S.R.; CHANDLER L.A. Escherichia coli and the Coliform bacteria. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponível em: http:// www.cfsan.fda.gov. KORNACKI, J.L.; JOHNSON, J.L. Enterobacteriaceae, Coliforms and Escherichia coli as Quality and Safety Indicators. In Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p. 69-82. CAPÍTULO XI NÚMERO MAIS PROVÁVEL DE Staphylococcus aureus 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a determinação do NMP de Staphylococcus aureus em alimentos. Aplica-se a amostras de alimentos em que os limites de aceitação determinados pela legislação encontram-se abaixo de 100 UFC/g ou mL. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Determinação do NMP: Baseia-se na inoculação das diluições desejadas das amostras sob teste em caldo telurito manitol glicina, segundo Giolitti e Cantoni ou Caldo soja triptona com sal 10%- piruvato de sódio 1% (TSB-NP), com posterior confirmação em ágar Baird-Parker. No caldo TSB-NP, a alta concentração de NaCl (10%) atua seletivamente, inibindo o crescimento de microbiota acompanhante que não apresente capacidade de se desenvolver nesta condição. O Staphylococcus aureus reduz, anaeróbia e aerobiamente, o telurito de potássio, produzindo escurecimento do caldo Giolitti e Cantoni, bem como colônias negras no ágar Baird- Parker. O ágar Baird-Parker, enriquecido com solução de gema de ovo, possibilita a evidenciação das atividades proteolítica e lipolítica do Staphylococcus aureus, respectivamente, por meio do aparecimento de um halo de precipitação e um de transparência ao redor da colônia. Prova da coagulase Baseia-se na comprovação da capacidade do microrganismo de coagular o plasma de coelho pela ação da enzima coagulase. 2.3 Provas complementares 2.3.1 Coloração de Gram: Baseia-se na verificação das características morfológicas e tintoriais do microrganismo. 2.3.2 Prova da termonuclease: Baseia-se na degradação do DNA em oligonucleotídeos pela ação da enzima DNAse produzida pelo microrganismo. A reação é evidenciada pelo aparecimento de um halo de coloração rósea no ágar azul de toluidina e de clarificação, quando utilizado o ágar para teste de DNAse com verde de metila. 2.3.3 Prova da catalase: Baseia-se na capacidade da enzima catalase de decompor o peróxido de hidrogênio, liberando oxigênio, o que é evidenciado por meio da formação de borbulhas. 2.4 Limitações do Método: A metodologia para contagem de S. aureus, no que se refere aos resultados da prova de coagulase, apresenta limitações quanto à especificidade, devido ao fato de algumas espécies de Staphylococcus relacionadas a animais, como o S. intermedius, S. hyicus, S. delphini e S. schleiferi ssp coagulans, também serem coagulase positivas. Cepas de S. schleiferi ssp schleiferi e algumas cepas de S. lugdunensis apresentam fraca reação na prova da coagulase. Além disto, o S. schleiferi ssp schleiferi apresenta reação de termonuclease positiva. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos; Ágar Baird-Parker-base; Ágar azul de toluidina - DNA ou Ágar para ensaio de DNAse com verde de metila; Ágar estoque; Caldo soja triptona sal 10%-piruvato de sódio 1% (TSB-NP) ou Caldo telurito manitol glicina segundo; Giolitti e Cantoni (GC); Caldo cérebro-coração (BHI); Solução salina peptonada 0,1%; Solução salina 0,85%; Solução de azul de toluidina 1%; Emulsão de gema de ovo a 50%; Telurito de potássio 3,5%; Plasma de coelho oxalatado ou com EDTA; Peróxido de hidrogênio 3%; Etanol 70% ou Etanol 70º GL; Reagentes para coloração de Grãm. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos. 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Pesagem e preparo da amostra 5.1.1 Alimentos sólidos: Pesar 25 ± 0,2 g da amostra de acordo com as instruções contidas no Anexo V, “Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras”, deste Manual. Adicionar 225 mL de solução salina peptonada 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos no “stomacher”. Esta é a diluição10-1. A partir da diluição inicial 10-1, efetuar as diluições desejadas de acordo com o Anexo II, “Diluições e soluções”, deste Manual. Inocular 1 mL de cada diluição selecionada em três séries de três tubos contendo caldo telurito manitol glicina (GC) ou caldo TSBNP. Adicionar a cada tubo de caldo GC uma camada de 1 a 2 mL de selo estéril (vaspar, vaselina, óleo mineral ou parafina líquida, estéreis e previamente fundidos). 5.1.2 Alimentos líquidos: Pipetar 1 mL diretamente da amostra e tranferir para cada um dos três tubos contendo caldo GC ou caldo TSB-NP. Transferir também 1 mL da amostra para um tubo contendo 9 mL de solução salina peptonada 0,1% (diluição 10-1). A partir da diluição inicial 10-1, efetuar as diluições desejadas de acordo com o Anexo II, “Diluições e soluções”, deste Manual. Inocular 1 mL das duas diluições subseqüentes em séries de três tubos com caldo GC ou caldo TSB-NP. Adicionar uma camada de 1 a 2 mL de selo estéril (vaspar, vaselina, óleo mineral ou parafina líquida, estéreis e previamente fundidos) a cada tubo de caldo GC. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle específicos estabelecidos pelo laboratório. 5.3 Incubação: Incubar a 36 ± 1ºC por 48 horas. 5.4. Leitura: Fazer a leitura anotando os tubos que apresentarem escurecimento: do meio ou precipitado negro em caldo GC e turvação em: caldo TSB-NP. 5.5. Provas confirmatórias: Com pipetas de Pasteur estéreis, retirar do fundo de cada tubo de caldo GC positivo uma gota da cultura e colocá-la sobre a superfície seca de ágar Baird- Parker, junto à borda da placa, estriando posteriormente com alça, de forma a obter colônias que a presença de Vibrio parahaemolyticus é evidenciada pela turvação do meio após a incubação. Em sua composição, o meio GSTB apresenta teepol, solução aquosa de sulfatos de sódio alcalinos primários que atuam na membrana citoplasmática de microrganismos Gram positivos, inibindo o seu crescimento e formalina que funciona como um agente antimicrobiano. Como o Vibrio parahaemolyticus é halófilo obrigatório, os dois meios contém 3% de cloreto de sódio. 2.1.2 Isolamento em ágar tiosulfato citrato sacarose sais biliares (TCBS) Isolamento se realiza em ágar TCBS, meio seletivo altamente alcalino que contém elevada concentração de tiossulfato e citrato de sódio, responsáveis pela inibição do crescimento das enterobactérias presentes. A bile e o colato de sódio inibem os enterococos. Como indicador de pH, o meio possui o azul de timol e o azul de bromotimol que alteram a cor do meio para amarelo quando da formação de ácido pelos microrganismos que fermentam a sacarose contida no meio. 2.2 Provas de identificação: A identificação de Vibrio parahaemolyticus é feita por meio de provas bioquímicas, sorológicas, morfológicas e tintoriais. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos; Ágar Müeller-Hinton sal 3%; Ágar nutriente sal 3%; Ágar gelatina sal 3%; Ágar soja triptona sal 3%; Ágar tiosulfato citrato sacarose sais biliares (TCBS); Ágar ferro três açúcares (TSI) sal 3% ou Ágar Kligler sal 3%; Ágar motilidade sal 3%; Caldo glicose sal teepol (GSTB) ou Caldo Horie arabinose violeta de etila (HAEB); Caldo peptonado sem sal; Caldo peptonado sal 3%; Caldo peptonado sal 6%; Caldo peptonado sal 8%; Caldo peptonado sal 10%; Caldo ONPG sal 3%; Caldo vermelho de fenol manitol sal 3%; Caldo vermelho de fenol sacarose sal 3%; Caldo vermelho de fenol arabinose sal 3%; Caldo vermelho de fenol arginina sal 3%; Caldo vermelho de fenol lisina sal 3%; Meio O/F (Hugh-Leifson) sal 3%; Solução salina peptonada 0,1% sal 3%; Solução fisiológica (NaCl 0,85%); Agente vibriostático O 129 10µg ; Agente vibriostático O 129 150 µg; Arabinose; L-arginina; L-lisina; Manitol; Sacarose; Óleo mineral ou parafina líquida estéreis; Reativo para Oxidase (oxalato de para-amino-dimetilanilina ou N'N'N'N'-tetrametil- parafenileno-diamina); Teepol; O-nitrofenil-â-D-galactopiranosídeo ou p-nitrofenil-â-D-galactosídeo; Etanol 96%; Reagentes para coloração de Gram. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos. 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Preparo e Pesagem: Preparar a amostra de acordo com as instruções contidas no Anexo V, “Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras", deste Manual. Pesar 50g da amostra. Adicionar 450 mL de Caldo peptonado sal 3%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em “stomacher”. Esta é a diluição 10-1. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle específicos estabelecidos pelo laboratório. 5.3 Provas presuntivas 5.3.1 Inoculação em caldo de enriquecimento seletivo: A partir da diluição inicial (10-1), efetuar as demais diluições desejadas em Caldo peptonado sal 3% (no mínimo mais duas diluições) de acordo com as instruções contidas no Anexo II, “Diluições e soluções”, deste Manual. Inocular volumes de 1 mL de cada uma das diluições desejadas em séries de 3 tubos contendo GSTB ou caldo HAEB. 5.3.2 Incubação: Incubar os tubos a 36 ± 1°C por 18 horas a 24 horas. 5.3.3 Leitura: A presença de turvação do meio indica a suspeita da presença de Vibrio parahaemolyticus. Anotar o número de tubos de cada série que apresentaram turvação. 5.3.4 Isolamento em ágar tiosulfato citrato sais biliares (TCBS) 5.3.4.1 Inoculação: A partir de cada tubo de GSTB ou HAEB que apresentar turvação, sem agitá-lo e com auxílio de uma alça de níquel-cromo, de platina ou descartável estéril, retirar uma alçada do crescimento da superfície e estriá-la sobre a superfície seca de ágar tiosulfato citrato sacarose sais biliares (TCBS). 5.3.4.2 Incubação: Incubar as placas em posição invertida a 36 ± 1ºC por 24 horas. 5.3.4.3 Leitura: Verificar o aparecimento de colônias arredondadas, opacas, de cor azul esverdeada, com 2 a 3 mm de diâmetro, típicas de Vibrio parahaemolyticus. Quando não houver colônias suspeitas, o resultado será negativo para o tubo de origem. 5.4 Provas preliminares para identificação de Vibrio parahaemolyticus De cada placa, selecionar de 2 a 3 colônias típicas e transferí-las simultaneamente para tubos contendo caldo peptonado sal 3% e ágar nutriente sal 3% inclinado. Incubar a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas. 5.4.1 Coloração de Gram: A partir do cultivo mantido em ágar nutriente sal 3%, proceder à coloração de Gram de acordo com as instruções descritas no Anexo VII, “Procedimentos de coloração”, deste manual. O Vibrio parahaemolyticus se apresenta como bastonetes retos ou curvos Gram negativos. Em culturas antigas, pode se apresentar em forma de cocobacilos. 5.4.2 Crescimento com 8% de sal e sem sal: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, transferir, com auxílio de alça de níquel-cromo, platina ou descartável estéril, uma alçada para um tubo contendo caldo peptonado sem sal e caldo peptonado sal 8%. Incubar os tubos a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas. Após o período de incubação, verificar a presença de turvação indicativa da ocorrência de crescimento. O Vibrio parahaemolyticus não cresce no meio sem sal e cresce no meio com 8% de sal. 5.4.3 Prova da oxidase: A partir do cultivo mantido em ágar nutriente sal 3%, usando palitos de madeira, de plástico descartáveis, pipetas Pasteur, ou alça de platina, realizar a prova de oxidase espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase ou sobre tiras de papel para teste de oxidase, comercialmente disponíveis. Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Após este tempo, podem ocorrer reações falso- positivas. O aparecimento de cor azul (quando é usado o reativo N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno- diamina) ou de cor vermelha intensa (quando o reativo usado é o oxalato de para-amino- dimetilanilina) é indicativo de reação positiva. OBS: Não utilizar alças de níquel-cromo ou alças de aço para realizar a prova de oxidase, pois traços de óxido de ferro na superfície flambada podem produzir reação falso-positiva. O Vibrio parahaemolyticus é oxidase positiva 5.4.4 Caldo vermelho de fenol sacarose sal 3%: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, inocular, com auxílio de alça de níquel-cromo, um tubo contendo caldo vermelho de fenol sacarose sal 3%. Cobrir o meio com 2 a 3 mL de óleo mineral ou parafina líquida, estéreis. Incubar a 36 ± 1°C por 18 a 24 horas. Após o período de incubação, observar a mudança de coloração do meio, de vermelho para amarelo, devido à fermentação da sacarose e produção de ácido. O Vibrio parahaemolyticus não altera a coloração do meio pois não é capaz de fermentar a sacarose. 5.4.5. Ágar ferro três açúcares sal 3% (TSI) ou Ágar Kligler ferro sal 3% A partir do cultivo mantido no ágar nutriente sal 3% inclinado, com auxílio de agulha de platina ou níquel-cromo, inocular, mediante picada central em toda a profundidade do ágar e estriando a superfície inclinada, tubos com ágar TSI sal 3% ou ágar Kligler ferro sal 3%. Incubar a 36 ± 1ºC por 24 horas. O Vibrio parahaemolyticus apresenta base ácida (amarela), sem gás, sem produção de H2S e bisel alcalino (vermelho). 5.4.6 Teste ONPG: A partir da cultura em TSI, inocular uma alçada espessa em tubo contendo 0,5 mL de caldo ONPG sal 3%. Incubar em banho-maria a 36 ± 1ºC, durante 2 horas. Examinar os tubos , verificando o aparecimento ou não de cor amarela, indicativa de reação positiva. Se o caldo permanecer incolor, a reação é negativa. concentração de 150µg. Incubar as placas a 36 ± 1ºC por 24 horas. O Vibrio parahaemolyticus é resistente à concentração de 10µg de agente vibriostático O/129 enquanto o V. vulnificus é sensível. Todos os víbrios são sensíveis à concentração de 150µg do agente O/129. 6. RESULTADOS Serão consideradas como positivas para Vibrio parahaemolyticus as culturas que apresentarem os seguintes resultados nas provas adicionais de identificação: Motilidade - positiva Hugh Leifson (OF) - glicose fermentativo Descarboxilação da lisina - positivo Hidrólise da arginina - negativo Crescimento a 42ºC - positivo Fermentação do manitol - positivo Fermentação da arabinose - positivo Sensibilidade ao Agente Vibriostático O/129 - 10µg - resistente Sensibilidade ao Agente Vibriostático O/129 - 150µg - sensível Ágar gelatina sal 3% - crescimento com formação de halo Halofilismo (6% sal) - positivo Halofilismo (8% sal) - positivo Halofilismo (10% sal) - negativo ou crescimento discreto A partir da combinação de tubos com resultado positivo em cada série, calcular o Número Mais Provável de acordo com o Anexo III, “Procedimentos Básicos de Contagem”, deste Manual. Expressar o valor obtido em NMP/g. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA ELLIOT, E.L.; KAYSNER, C.A.; JACKSON, L. e CEBULE, T.A. V. cholerae, V parahaemolyticus, V. vulnificus and Others víbrio spp. In Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponível em: http: www.cfsan.fda.gov. MacFADDIN, J.F. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. 3ed. Lippincott Williams & Wilkins (Ed.), Philadelphia. 2000. p. 160-169. CAPÍTULO XIII NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP) DE MICRORGANISMOS MESÓFILOS AERÓBIOS VIÁVEIS CAPAZES DE CAUSAR ALTERAÇÃO EM PRODUTOS LÁCTEOS UHT E ESTERILIZADOS, PASTOSOS E VISCOSOS 1.OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a determinação do NMP de microrganismos mesófilos aeróbios viáveis, com exclusão daqueles comprovadamente não patogênicos e não causadores de alterações físicas, químicas e organolépticas em produtos lácteos pastosos e viscosos. Detectar a presença de Bacillus sporothermodurans para diferenciá-lo dos demais microrganismos mesófilos aeróbios viáveis. Aplica-se a amostras de creme de leite e outros produtos pastosos e viscosos tratados pelo processo UHT e produtos esterilizados. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Pré-incubação: Baseia-se na incubação das amostras em estufa a 36 ± 1ºC por 7 dias e posterior verificação da ocorrência de alterações das características do produto. 2.2 Determinação do NMP: Baseia-se na semeadura de diluições seriadas da amostra em tubos contendo caldo cérebro-coração-sal 0,65%-extrato de levedura 0,6% (BHI-SE), seguida de incubação a 30 ± 1ºC por 72 horas, com posterior repique em ágar cérebro-coração (BHI) e ágar nutriente isento de extrato de levedura e a subseqüente identificação da flora presente. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos; Ágar cérebro-coração (ABHI); Ágar nutriente isento de extrato de levedura; Ágar esculina; Ágar uréia; Caldo cérebro-coração nitrato (BHI-NO3); Caldo cérebro-coração-sal 0,65%-extrato de levedura 0,6% (BHI-SE); Caldo cérebro-coração-sal 0,65%-extrato de levedura 0,6% concentração dupla (BHI- SE2); Caldo vermelho de fenol com glicose; Solução salina peptonada 0,1%; Reativo para oxidase (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de para-amino- dimetilanilina) ou tiras para teste de oxidase; Peróxido de hidrogênio 3%; Alfa-naftilamina 0,5%; Ácido sulfanílico 0,8%; Zinco em pó; Etanol 70% ou Etanol 70º GL; Reagentes para coloração de Gram. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos. 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Preparo da amostra: Após pré-incubação, as amostras visualmente inalteradas devem ser agitadas por 25 vezes. Antes da abertura, desinfetar externamente as embalagens com solução desinfetante e posteriormente com etanol 70% ou etanol 70º GL. Deixar secar. Pesar 25 ± 0,2 g ou pipetar 25 ± 0,2 mL da amostra de acordo com as instruções contidas no Anexo V, “Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras”, deste Manual. Adicionar 225 mL de solução salina peptonada 0,1%. A partir da diluição inicial 10-1, efetuar as diluições desejadas de acordo com o Anexo II, “Diluições e soluções”, deste Manual. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle específicos estabelecidos pelo laboratório. 5.3 Inoculação: Inocular 10 mL da diluição 10-1, 1 mL da diluição 10-1 e 1 mL da diluição 102, separadamente, em três séries de três tubos contendo 10 mL de BHI-SE. Na primeira série de tubos, que foram inoculados com 10 mL da diluição 10-1, usar o meio com concentração dupla (BHI-SE2). Incubar a 30 ± 1°C por 72 horas. 5.4 Confirmação do crescimento: Finalizado o período de incubação, repicar todos os tubos sobre a superfície seca de ABHI e de ágar nutriente isento de extrato de levedura, estriando de forma a obter colônias isoladas. Incubar a 30 ± 1ºC por até 72 horas. 5.5 Leitura: O crescimento nas placas será indicativo de presença de mesófilos aeróbios no tubo de origem, porém será necessária a diferenciação entre Bacillus sporothermodurans (que não é patogênico nem produz alteração do produto) e outros mesófilos aeróbios capazes de alterar o alimento. Registrar o número de tubos que apresentaram crescimento de colônias nas placas correspondentes, registrando em separado as colônias suspeitas de Bacillus sporothermodurans. Quando o crescimento bacteriano for devido à presença de esporos de Bacillus sporothermodurans na amostra em análise, será observado crescimento abundante de colônias lisas, de forma regular, com coloração entre branco e bege, com diâmetro máximo de 3 mm, facilmente identificáveis, nas placas com ABHI. No ágar nutriente isento de extrato de levedura, o Bacillus sporothermodurans comumente não forma colônias visíveis, porém poderão se desenvolver colônias puntiformes de coloração entre branco e bege. Selecionar de 2 a 3 colônias correspondentes a cada um dos tubos positivos e repicar para tubos com ABHI inclinado. Incubar a 36 ± 1ºC por até 72 horas e realizar os seguintes testes confirmatórios: 5.6 Coloração de Gram: Preparar esfregaço das colônias suspeitas e corar pelo método de Gram . Quando forem observados bastonetes Gram positivos, realizar a prova da catalase conforme o item 5.7. Quando forem observados microrganismos com morfologia e características diferentes de bastonetes Gram positivos, considerar o tubo correspondente como positivo para presença de aeróbios mesófilos. 5.7 Catalase: Com auxílio de alça de platina, palito de madeira, bastão de vidro ou Pipeta de Pasteur, estéreis, transferir a cultura para uma lâmina ou placa de vidro contendo uma gota de peróxido de hidrogênio 3%. Misturar o inóculo ao peróxido e observar a reação. A não formação de borbulhas indica prova negativa para catalase. A formação de borbulhas indica prova positiva para catalase. A maioria dos membros do gênero Bacillus apresenta reação de catalase positiva. Quando a coloração de Gram demonstrar a presença de bastonetes Gram positivos e a prova da catalase for positiva para a cultura em teste, proceder à confirmação da presença de Bacillus sporothermodurans por meio das provas da oxidase, hidrólise da esculina, fermentação da glicose, redução do nitrato, produção de urease e crescimento em anaerobiose, conforme 2.1 Enriquecimento Seletivo: O enriquecimento seletivo, realizado em duas etapas (a primeira em caldo UVM, e a segunda em caldo Fraser), tem a finalidade de inibir a flora acompanhante, permitindo a recuperação de baixos números de células de Listeria sp. O efeito seletivo no caldo UVM é exercido pela associação de ácido nalidíxico e acriflavina e no caldo Fraser pelo cloreto de lítio, ácido nalidíxico e acriflavina. 2.2 Seleção e Isolamento: Nos produtos cárneos, a seleção se realiza em dois meios sólidos: ágar triptose com ácido nalidíxico (ATN) e ágar Palcam (AP), enquanto que nos produtos lácteos esta se realiza em agar Oxford (AO), ágar Palcam (AP) e ágar triptose com ácido nalidíxico (ATN). As substâncias impedientes presentes nos meios sólidos são ácido nalidíxico no ATN, sulfato de polimixina B, acriflavina, cloreto de lítio e ceftazidina no AP, e cloreto de lítio, acriflavina, sulfato de colistina, cefotetan, cicloheximide e fosfomicina no AO. A seleção no ATN baseia-se nas características das colônias, quando observadas sob luz oblíqua, em estereoscópio. No AP, observa-se a não fermentação do manitol e a formação de esculetina pela hidrólise da esculina, reação revelada pela presença de ferro trivalente. No AO, as colônias de Listeria sp apresentam-se pretas, rodeadas por halo negro devido à hidrólise da esculina. 2.3 Confirmação da presença de Listeria sp: A confirmação bioquímica de Listeria sp realiza-se por meio da verificação da produção de catalase, observação das características morfológicas e tintoriais, verificação do crescimento típico em meio semi-sólido e, adicionalmente, por meio da verificação da incapacidade de redução de nitrato e verificação da positividade nas reações de Vermelho de Metila e Voges Proskauer (VM-VP). 2.4 Identificação de Listeria monocytogenes: A diferenciação das espécies de Listeria sp realiza-se por meio da verificação da produção de â-hemólise em ágar sangue de cobaio ou ágar sangue de carneiro, verificação da capacidade de produzir reação de CAMP positiva com S. aureus (e opcionalmente também com Rodococcus equi), e verificação da capacidade de fermentação dos carbohidratos ramnose, xilose e manitol. A utilização concomitante de culturas de R. equi e S. aureus no CAMP teste é útil para a diferenciação de L. ivanovii, que apresenta reação de CAMP forte com R. equi (em forma de flecha). Quando se julgar conveniente, a identificação poderá ser realizada por meio de um sistema comercialmente disponível de testes bioquímicos miniaturizados padronizados, conjuntamente com a prova de â-hemólise ou CAMP teste. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos; Caldo Fraser - base; Caldo de enriquecimento para Listeria (UVM) ou opcionalmente Caldo para Enriquecimento de Listeria (LEB); Caldo VM-VP; Caldo vermelho de fenol - base ou Ágar para fermentação de carbohidratos - base; Ágar Palcam (AP); Ágar Columbia com ácido nalidíxico - base; Ágar triptose com ácido nalidíxico (ATN); Ágar Oxford (AO) - base; Ágar motilidade; S. aureus ATCC 25923 para CAMP teste; Rodococcus equi ATCC 6939 para CAMP teste (opcional); Sistema miniaturizado para identificação bioquímica de Listeria (opcional); Ácido nalidíxico 1%; Acriflavina cloridrato 1%; Peróxido de hidrogênio 3%; Vermelho de metila 0,06%; Alfa-naftol 5%; Hidróxido de potássio 40%; Ácido sulfanílico 0,8%; Alfa-naftilamina 0,5%; Suplemento para caldo UVM (ácido nalidíxico 20mg/L; acriflavina 12mg/L); Suplemento para caldo LEB (acriflavina 12mg/L); Suplemento para ágar Oxford (cicloheximide 200mg/0,5L; sulfato de colistina 10,0mg/0,5L; acriflavina 2,5mg/0,5L; Cefotetan 1,0mg/0,5L; fosfomicina 5,0mg/0,5L); Suplemento para ágar Palcam (polimixina B 5,0mg/0,5L; acriflavina 2,5mg/0,5L; Ceftazidime 10,0mg/0,5L); Suplemento para caldo Fraser (citrato de amônio e ferro III 250mg/0,5L; acriflavina 12,5mg/0,5L; ácido nalidíxico 10mg/0,5L); Pó de Zinco; Xilose solução aquosa 5%; Manitol solução aquosa10%; Ramnose solução aquosa 5%; Sangue desfibrinado de carneiro; Sangue desfibrinado de cobaio . OBS: Os suplementos podem ser adquiridos em forma de vial (comercialmente disponível), necessitando apenas a suspensão em diluente antes de seu uso. Verificar sempre a composição, comparando com aquela indicada nesta metodologia. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos. Estereoscópio com iluminação em ângulo de 45º. 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Preparo da Amostra: Acrescentar à alíquota de 25 ± 0,2 g ou mL da amostra preparada conforme Anexo V, 225 mL de caldo UVM adicionado de seu suplemento. OBS: Verificar a formulação do Caldo UVM ou LEB. Algumas marcas de caldo UVM já contêm em sua formulação ácido nalidíxico e acriflavina. O caldo LEB já contém ácido nalidíxico, bastando a suplementação com 0,25 mL de solução 1% de acriflavina. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle específicos estabelecidos pelo laboratório. 5.3 Primeiro enriquecimento seletivo: Homogeneizar as alíquotas preparadas conforme item 5.1 e incubar a 30 ± 1ºC por 24 horas. 5.4 Segundo enriquecimento seletivo.: Após a incubação, transferir 0,1 mL da cultura para tubo contendo 10mL de caldo Fraser suplementando-o, se necessário, com 0,1 mL do vial diluído conforme a indicação do fabricante. OBS:Alguns fabricantes de caldo Fraser fornecem o meio já pronto para o uso; outros fornecem o meio adicionado de ácido nalidíxico e de acriflavina, bastando a suplementação com citrato de amônio e ferro III (0,1 mL de solução a 5% equivalente a 250 mg/0,5L de meio). Incubar a 30 ± 1ºC por 24 a 48 horas. 5.5 Isolamento 5.5.1 Amostras de produtos cárneos: Utilizando alça de platina de 5 mm de diâmetro, repicar do caldo Fraser para placas contendo ATN e placas contendo AP suplementado, sendo que as placas devem estar com as superfícies secas, de forma a proporcionar a obtenção de colônias isoladas. Opcionalmente, pode ser usado o ATNS em paralelo com os meios ATN e AP. Incubar as placas de ATN a 30 ± 1ºC por 24 horas e as placas de AP e ATNS, na mesma temperatura, por 24 a 48 horas. 5.5.2 Amostras de produtos lácteos: Utilizando alça de platina de 5 mm de diâmetro, repicar do caldo Fraser para placas contendo AO suplementado e placas contendo AP suplementado, sendo que as placas devem estar com as superfícies secas, de forma a proporcionar a obtenção de colônias isoladas. Incubar as placas de ATN a 30 ± 1ºC por 24 horas e as placas de AP na mesma temperatura, por 24 a 48 horas. 5.6 Seleção; Com auxílio de lupa ou estereoscópio com iluminação angular de 45º, selecionar 3 a 5 colônias de cor azulada ou azulacinzentada em ATN. Selecionar, com o auxílio de conta-colônias ou de estereoscópio com iluminação normal, colônias pretas rodeadas por halo escuro em AO. Selecionar, com o auxílio de conta-colônias ou de estereoscópio com iluminação normal, colônias verde-amareladas rodeadas por zona escura, ou colônias verde-acinzentadas, em AP. 5.7 Confirmação da presença de Listeria sp: Repicar o mesmo inóculo para tubos com ágar estoque inclinado e para placas contendo ATN. Incubar a 30 ± 1ºC por 24 horas. Verificar a pureza das culturas no ATN. Utilizar as culturas do ágar estoque para a realização das provas de confirmação e identificação. 5.7.1 Prova da catalase Em uma placa de Petri, depositar 1 gota de peróxido de hidrogênio 3%. Com auxílio de alça de platina, bastão de vidro, palito de madeira ou pipeta de Pasteur, retirar uma alíquota do cultivo e misturar com a gota do reagente. A presença de catalase se traduz por desprendimento de borbulhas de oxigênio (catalase positiva). Das culturas catalase positivas, fazer um esfregaço para coloração de Gram. 5.7.2 Coloração de Gram: A Listeria sp se apresenta como bastonete curto ou na forma de cocobacilo, Gram positivo. 5.7.3 Prova da motilidade típica: Inocular uma alíquota da cultura em ágar motilidade, com agulha, por picada. Incubar em estufa de B.O.D. (Demanda Biológica de Oxigênio) a 22-25°C por 2 a 5 dias. Após incubação, verificar o tipo de crescimento. A Listeria sp apresenta crescimento móvel característico em forma de guarda-chuva. 5.7.4 Prova de Redução de Nitrato: Após a leitura da motilidade, adicionar a cada tubo 2 a Presença de Listeria, seguida do nome da espécie encontrada. Por exemplo: Presença de Listeria innocua, Presença de Listeria welshimeri ou outra. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA BENNETT , R.W.; WEAVER, R.E. Seradiagnosis of Listeria monocytogenes. In: AOAC International. Bacterial Analytical Manual. 8. ed. Gaithersburg. Food and Drug Administration, 1995. p.11.01-11.08. RYSER, E.T.; DONNELLY, C.W. Listeria. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4 ed. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), Washington: American Public Health Association, 2001. p.63-67. HITCHINS A.D. Listeria monocytogenes . In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponivel em: http://www.cfsan.fda.gov MacFADDIN, J.F. Media for isolation - Cultivation - Identification-Maintenance of Medical Bacteria. John Buttler (Ed.) William & Wilkins. Baltimore. 1985. CAPÍTULO XV PESQUISA DE Salmonella 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer metodologia analítica para a detecção de Salmonella sp em amostras de alimentos, rações e ingredientes. Aplica-se a amostras de alimentos de origem animal, rações e ingredientes. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Pré-enriquecimento: Baseia-se na incubação, a 36 ± 1ºC por 16 a 20 horas, de 25 ± 0,2 g ou 25 ± 0,2 mL da amostra, adicionada de 225 mL do diluente específico para cada caso, estabelecido no item 5.1. Esse procedimento visa minimizar os efeitos do processamento industrial dos alimentos, capaz de promover estresse nas células de Salmonella, sem inativá-las biologicamente. Quando é utilizada solução salina peptonada tamponada, esta avorece a manutenção do pH, evitando que as bactérias acompanhantes acidifiquem o meio, prejudicando a recuperação das células de Salmonella. Para leite em pó, segundo o FDA, o diluente utilizado é água destilada estéril adicionada de solução de verde brilhante, o que visa inibir o crescimento de bactérias Gram positivas. 2.2 Enriquecimento seletivo: Baseia-se na utilização de meios que contêm substâncias de ação impediente do crescimento para a maioria dos microrganismos interferentes e na incubação em temperatura seletiva. O enriquecimento seletivo de Salmonella se faz obrigatoriamente nos meios líquidos seletivos, caldo Rappaport Vassiliadis e caldo selenito-cistina. Adicionalmente, utiliza-se o caldo tetrationato. No caldo Rappaport Vassiliadis, a presença de verde malaquita e de cloreto de magnésio, associada à temperatura de 41 ± 0,5ºC por 24 a 30 horas, atua como agentes seletivos da microbiota acompanhante, enquanto a presença de peptona de farinha de soja estimula o crescimento de Salmonella. No caldo selenito-cistina, o agente inibidor selenito de sódio atua inibindo os coliformes e enterococos. Esse meio é incubado a 41 ± 0,5ºC por 24 a 30 horas. No caldo tetrationato, a seletividade é conferida pelo tetrationato e pelo verde brilhante. 2.3 Isolamento e seleção: Baseia-se na seleção de colônias de Salmonella em, pelo menos, dois meios sólidos: o ágar verde brilhante vermelho de fenol lactose sacarose (BPLS) obrigatoriamente e outro ágar de maior impediência escolhido pelo laboratório. No ágar verde brilhante, a novobiocina adicionada visa principalmente a inibição de Proteus sp. Esse meio apresenta em sua composição bile bovina e um corante derivado do trifenilmetano (verde brilhante), responsáveis pela inibição de microrganismos Gram positivos. Como meio de maior impediência, utilizar MLCB ou Rambach ou XLD ou XLT4 ou outro. No ágar Rambach, a diferenciação entre Salmonella e outros microrganismos é promovida pela presença de propilenoglicol, e também de um cromógeno que evidencia a hidrólise da beta- galactosidase. No ágar MLCB, a concentração de íons Magnésio promove o crescimento de Salmonella. A presença de verde-brilhante inibe a flora acompanhante. Esse ágar não utiliza a fermentação da lactose como sistema de identificação, o que possibilita a detecção de cepas de comportamento atípico no BPLS. A produção de H2S é evidenciada pelo enegrecimento do centro da colônia. Cepas de Salmonella H2S negativas, como Salmonella Sendai, Salmonella Berta, Salmonella Pullorum e Salmonella Seftenberg, podem produzir colônias azuis. É um meio que, associado ao caldo de enriquecimento Rappaport Vassiliadis, tem sua seletividade substancialmente aumentada. A Salmonella Typhi e a Salmonella Paratyphi não crescem nesse meio devido à presença de verde-brilhante. 2.4 Identificação bioquímica: Baseia-se na evidenciação das propriedades fisiológicas e metabólicas das culturas suspeitas: por meio da verificação da presença de citocromo oxidase; detecção de pirrolidonil peptidase (PYRase) segundo Bennett et. al (1999); produção de urease; fermentação da glicose, sacarose e lactose no meio TSI; detecção de beta-galactosidase; descarboxilação da lisina; produção de H2S; motilidade e produção de indol. Para confirmação final, em casos de dúvida, realizam-se outras provas complementares, baseadas na inoculação das culturas suspeitas em uma bateria miniaturizada de testes padronizados. Os microtubos contendo substratos desidratados para cada teste são reidratados pela adição da suspensão do microrganismo teste em diluente específico para esta finalidade. 2.5. Prova de soroaglutinação: Baseia-se na reação antígeno-anticorpo, com conseqüente aglutinação do antígeno frente ao anti-soro para Salmonella polivalente “O”. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidrarias e demais insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos; Ágar verde brilhante vermelho de fenol lactose sacarose (BPLS); Ágar Rambach ou Ágar manitol lisina cristal violeta verde brilhante (MLCB) ou Ágar XLD ou Ágar; XLT4 ou outro; Ágar ferro três açúcares (TSI) ou Ágar Kligler (KIA); Ágar estoque; Caldo lisina descarboxilase ou Ágar lisina ferro - (LIA); Caldo uréia ou ágar uréia; Ágar fenilalanina; Caldo selenito cistina; Caldo Rappaport Vassiliadis; Caldo tetrationato (adicional); Caldo VM/VP; Meio SIM; Sistema miniaturizado de provas bioquímicas para identificação de enterobactérias; Solução salina 0,85%; Solução salina 2%; Água destilada estéril; Solução salina peptonada 1% tamponada; Solução salina peptonada 1% tamponada com 1% Tween 80; Solução de α-naphtol 5%; Solução de hidróxido de potássio 40%; Solução de uréia 40% estéril; Solução de iodo-iodeto; Reativo de Kovac's (opcional: reativo de Ehrlich); Verde brilhante solução aquosa 0,1%; Cloreto férrico solução aquosa 10%; Novobiocina solução aquosa 4%; Soro anti Salmonella polivalente “O”; Reativo para oxidase (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de para-amino- dimetilanilina) ou tiras para teste de oxidase; Óleo mineral, parafina líquida ou vaspar estéreis; Reativos para prova da PYRase - Ácido L-piroglutâmico 7- amino 4-metil cumarina (7 AMC) e Dimetilaminocinamaldeído; Tween 80. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos. Banho-maria com movimentação de água (agitação ou circulação). 5. PROCEDIMENTOS 5.1. Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 ± 0,2 g ou pipetar 25 ± 0,2 mL da amostra, de acordo com as instruções contidas no Anexo V, “Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras", deste Manual. Adicionar 225 mL de solução salina peptonada 1% tamponada (ver exceções na observação abaixo). Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos no “stomacher”. Deixar 1 hora em temperatura ambiente. OBS: Para leite em pó e soro de leite em pó, utilizar como diluente água destilada e adicionar 5 mL de verde brilhante solução aquosa 0,1%. Para produtos gordurosos (creme e manteiga) utilizar como diluente solução salina peptonada 1% tamponada com 1% de Tween 80. Para os demais alimentos, utilizar solução salina peptonada 1% tamponada. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle específicos estabelecidos pelo laboratório. 5.3 Pré-enriquecimento: O pré-enriquecimento se realiza por meio da incubação das alíquotas das amostras preparadas conforme item 5.1, a 36 ± 1ºC por, no mínimo, 16 horas e não A motilidade é caracterizada pela difusão do crescimento por todo o meio. Se for restrito à linha de semeadura, indica que o microrganismo é imóvel. A maioria das salmonelas apresenta motilidade positiva. A Salmonella Gallinarum e a Salmonella Pullorum apresentam motilidade negativa. O meio SIM é o meio mais indicado para a verificação da produção de H2S. O H2S é um gás incolor produzido pelo microrganismo em teste, pela redução do tiosulfato presente no meio. A revelação da presença de H2S se realiza por meio da reação do H2S com o citrato de ferro e amônio (presente no meio), formando um precipitado negro insolúvel. Quinze por cento das culturas de Salmonella Choleraesuis e 95% das de Salmonella Paratyphi A não produzem H2S. A maioria das salmonelas produz H2S . Quatorze por cento das cepas de Salmonella são H2S negativo. Após a leitura da motilidade e da produção de H2S, adicionar algumas gotas de reativo de Kovac´s (ou, opcionalmente de reativo de Ehrlich) aos tubos para verificar se houve produção de indol. A oxidação do triptofano presente no meio SIM leva à formação de três principais compostos: indol, escatol e indolacetato. A adição do reativo de Kovac´s resulta na formação de um anel vermelho, resultante da reação entre o indol e o dimetilaminobenzaldeído contido nesse reativo. Quase a totalidade das salmonelas não produz indol. Segundo Weissfeld et al (1994), cerca de 1% das salmonelas produzem indol. 5.7.1.5 Prova da Oxidase: Usando palitos de madeira, de plástico descartáveis ou pipetas Pasteur, estéreis, ou alça de platina, realizar a prova de oxidase espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase, ou sobre tiras de papel para teste de Oxidase, disponíveis comercialmente. Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Após esse tempo, podem ocorrer reações falso- positivas. O aparecimento de cor azul (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina) ou vermelho intenso (oxalato de para-amino-dimetilanilina) é indicativo de reação positiva. Não utilizar alças de níquel-cromo ou alças de aço para realizar a prova de oxidase, pois traços de óxido de ferro na superfície flambada podem produzir reação falso-positiva. Todas as salmonelas apresentam reação de oxidase negativa. 5.7.2 Provas bioquímicas complementares opcionais 5.7.2.1 Desaminação da fenilalanina Inocular a superfície do ágar fenilalanina por estriamento. Incubar a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas. Adicionar 2 a 3 gotas de solução de cloreto férrico 10%. A alteração da coloração da cultura na superfície do bisel para verde indica reação de desaminação da fenilalanina. Salmonella não desamina a fenilalanina. 5.7.2.2 Reação de Voges-Proskauer Inocular o caldo VM-VP em duplicata. Incubar um dos tubos a 36 ± 1ºC por, pelo menos, 24 horas. O outro tubo deve ser incubado a 22 ± 1ºC, por 96 horas. Adicionar primeiramente 0,6 mL de solução de α-naphtol 5% e, em seguida, 0,2 mL de solução de hidróxido de potássio 40%. Agitar os tubos para que haja oxigenação do meio. Aguardar de 10 a 15 minutos. A alteração da cor para rosa intenso indica reação de VP positiva. Hafnia alvei apresenta reação positiva a 22 ± 1ºC e resultado variável a 36 ± 1ºC. Salmonella apresenta reação negativa para VP nas duas temperaturas. 5.7.2.3 Detecção da enzima pirrolidonil peptidase (PYRase) A partir das culturas em ágar estoque que apresentaram resultados compatíveis com Salmonella, realizar o teste da presença da enzima pirrolidonil peptidase (PYRase). Espalhar a cultura suspeita sobre cartão impregnado com ácido L-piroglutâmico, substrato que será hidrolisado pela PYRase, quando produzido pelo microrganismo teste. Para revelar a hidrólise do ácido L-piroglutâmico, adicionar sobre o cartão algumas gotas de para-dimetilaminocinamaldeído, o que, nos casos positivos, resultará no desenvolvimento de coloração vermelha. Esta prova destina-se à diferenciação entre Citrobacter e Salmonella. Todas as cepas de Citrobacter sp produzem a enzima pirrolidonil peptidase (reação positiva). Todas as cepas de Escherichia coli e 96% das Salmonella não produzem essa enzima (reação negativa). 5.7.3 Comportamentos atípicos de Salmonella Algumas cepas de Salmonella podem apresentar as seguintes reações atípicas: fermentação da lactose (bisel do TSI e KIA ácido); fermentação da sacarose (bisel do TSI ácido); não produção de H2S (SIM sem H2S, TSI/KIA sem H2S); não descarboxilação da lisina (meio ácido); produção de indol (reação positiva no SIM). 5.8 Reação sorológica frente ao anti-soro polivalente “O” Ressuspender o cultivo obtido em ágar estoque inclinado (de 18 a 24 horas) em aproximadamente 2 mL de solução salina 0,85%. Em lâmina de vidro, placa de Petri ou placa de Huddleson, depositar separadamente uma gota de solução salina 2% e uma gota do soro anti-Salmonella polivalente "O", diretamente do frasco. Em seguida, acrescentar a cada uma delas uma gota da suspensão em teste. Com movimentos circulares, realizar a leitura com iluminação sobre fundo escuro em 1 a 2 minutos. Classificar a reação do seguinte modo: Positiva: presença de aglutinação somente na mistura cultivo + anti-soro; Negativa: ausência de aglutinação em ambas as misturas; Não específica: presença de aglutinação em ambas as misturas (formas rugosas). As culturas que apresentarem resultados compatíveis com Salmonella, porém incapazes de assegurar sua identificação por meio da sorologia, deverão ser reisoladas em ágar não- seletivo e serem novamente submetidas à reação sorológica. 5.9 Provas opcionais: Adicionalmente, podem ser utilizados sistemas miniaturizados de provas bioquímicas para identificação de enterobactérias, aprovados para uso pela CLA/MAPA. 6. RESULTADOS 6.1 Interpretação: Emitir o resultado como positivo para Salmonella quando as culturas apresentarem reações típicas nas provas bioquímicas e reação sorológica positiva frente ao anti- soro polivalente “O”. As culturas que apresentarem perfil bioquímico compatível com Salmonella e que não reagirem frente ao anti-soro polivalente “O” ou apresentarem reação inespecífica devem ser identificadas por método molecular ou remetidas para uma Instituição de Referência, para conclusão do resultado. 6.2 Sorotipificação: Remeter as culturas identificadas como Salmonella a uma Instituição de Referência no país, designada pela Coordenação de Laboratório Animal (CLA) para sorotipificação. Manter no laboratório as culturas isoladas de Salmonella, adequadamente identificadas. Manter registro de todas as confirmações sorológicas realizadas pela Instituição de Referência. 6.3 Expressão dos resultados Expressar o resultado como: Pesquisa de Salmonella : PRESENÇA/25 g ou mL; ou Pesquisa de Salmonella : AUSÊNCIA/25 g ou mL 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA ANDREWS, W.H.; FLOWERS, R.S.; SILLIKER, J.; BAILEY, J.S. Salmonella. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.357-380. ANDREWS, W.H.; HAMMACK, T.S. Salmonella. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponível em: http://www.cfsan.fda.gov. BENNETT, A.R.; MaCPHEE, S.; BETTS, R.; POST, D. 1999. Use of pyrrolidonyl peptidase to distinguish Citrobacter from Salmonella. Letters in Applied Microbiology, Oxford. 28: 175-178. ISO. International Organization for Standardization. International Standard ISO 6579, 3.ed. 1993. CAPÍTILO XVI PESQUISA DE Salmonella POR SEPARAÇÃO IMUNOMAGNÉTICA (IMS) 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer metodologia analítica para a detecção de Salmonella sp., pelo método de separação imunomagnética. Aplica-se em alimentos de origem animal. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Pré-enriquecimento: Baseia-se na incubação de 25 ± 0,2 g ou 25 ± 0,2 mL da amostra, adicionada de 225 mL do diluente específico para cada caso, a 36 ± 1ºC por 16 a 20 horas. Este procedimento visa minimizar os efeitos do processo tecnológico capaz de promover injúria celular fisiológica, sem inativar biologicamente a célula. Quando é utilizada solução salina peptonada 1% tamponada, o tampão utilizado favorece a manutenção do pH, o que assegura melhor recuperação das células de Salmonella. Para leite em pó, o diluente utilizado é água destilada estéril adicionada de solução de verde brilhante, o que visa inibir o crescimento de bactérias Gram positivas. 2.2 Separação imunomagnética: Baseia-se em duas ações principais: a captura por ligação imunológica e a separação por ação de forças magnéticas. A aplicação destas duas OLSVIK, O.; POPOVIK, T.; SKJERVE, E. et al. Magnetic Separation Techniques in Diagnostic Microbiology. Clinical Microbiology Reviews, v. 7, p. 43-54, 1994. SAFARIK, I.; SAFARIKOVÁ, M.; FORSYTHE, S.J. The application of magnetic separations in applied microbiology. Journal of Applied Bacteriology, Oxford, v. 78, p. 576-585, 1995. CAPÍTULO XVII PESQUISA DE Vibrio cholerae 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a pesquisa de Vibrio cholerae em alimentos; A metodologia para detecção de Vibrio cholerae destina-se à verificação da presença deste patógeno em alimentos de origem animal. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Pré-enriquecimento: Baseia-se na recuperação das células, fisiologicamente lesadas ou não, e crescimento em meio não seletivo. 2.2 Etapa presuntiva: Baseia-se no isolamento das colônias em meio sólido seletivo, ágar TCBS, e em meio não seletivo, ágar gelatina, e posterior incubação a 36 ± 1ºC, sendo as colônias típicas submetidas à identificação bioquímica. O ágar TCBS apresenta, em sua composição, elevada concentração de tiosulfato e citrato de sódio, além de ser altamente alcalino, inibindo assim o crescimento das enterobactérias. A bile e o colato de sódio inibem os enterococos. Como indicador de pH, o meio possui o azul de timol e o azul de bromotimol, que provocam a mudança de coloração do meio para amarelo quando da fermentação da sacarose presente no meio, com conseqüente formação de ácido. 2.3 Provas de identificação: A identificação de Vibrio cholerae é feita por meio de provas bioquímicas, sorológicas e tintoriais. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos; Ágar sal triptona (T1N1); Ágar ferro dois açúcares (ágar Kligler); Ágar tiosulfato citrato sacarose sais biliares (ágar TCBS); Ágar soja triptona (TSA); Ágar gelatina (AG); Água peptonada alcalina pH 8,5 ± 0,1; Caldo peptonado sem sal; Caldo peptonado sal 3%; Caldo peptonado sal 6%; Caldo vermelho de fenol base; Caldo gelatina fosfato sal (GPS); Caldo vermelho de fenol manitol; Caldo vermelho de fenol sacarose; Meio O/F Hugh-Leifson; Bacto Vibrio cholerae - anti-soro polivalente; Arabinose; Desoxicolato de sódio; L-arginina; L-inositol; L-lisina; L-ornitina; Manitol; Manose; Reativo para oxidase (oxalato de para-amino-dimetilanilina ou N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina) ou tiras para teste de oxidase; Etanol 96%; Reagentes para coloração de Gram; Óleo mineral estéril. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos. 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Enriquecimento: Preparar a amostra de acordo com as instruções contidas no Anexo V, “Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras", deste Manual. Pesar, separadamente, 25 ± 0,2 g da amostra em dois recipientes estéreis. Adicionar 225 mL de água peptonada alcalina pH 8,5 a um dos recipientes e 225 mL de caldo gelatina fosfato sal (GPS) ao outro. Homogeneizar, no máximo por 60 segundos em “stomacher”. Incubar os caldos a 36 ± 1ºC por 6 a 8 horas. Para amostras de ostras, inocular um terceiro recipiente com 25 ± 0,2 g de amostra e 225 mL de água peptonada alcalina pH 8,5, que deverá ser incubado por 6 a 8 horas a 42 ± 0,2ºC. Não agitar os frascos após a incubação. 5.2 Procedimentos de controle; Aplicar os procedimentos de controle específicos estabelecidos pelo laboratório. 5.3 Inoculação; Após a incubação, com auxílio de alça de níquel-cromo descartável, estéril ou de platina, transferir uma alçada de 3 mm de diâmetro, retirada da superfície de cada cultivo, para placas de ágar tiosulfato citrato sais biliares sacarose (TCBS) e de ágar gelatina (AG). Incubar as placas em posição invertida a 36 ± 1ºC por 24 horas. 5.4 Leitura; Verificar o aparecimento de colônias típicas. No ágar TCBS, as colônias de Vibrio cholerae apresentam-se com coloração amarela, ligeiramente elevadas no centro, com bordas translúcidas e 2 a 3 mm de diâmetro. Algumas cepas lento-fermentadoras da sacarose se apresentam verdes no TCBS, após 24 horas de incubação. No ágar gelatina, as colônias de Vibrio cholerae apresentamse como colônias transparentes com uma zona opaca ao seu redor que, geralmente, torna-se mais nítida após alguns minutos sob refrigeração. 5.5 Provas preliminares para a identificação do Vibrio cholerae 5.5.1 Preparo do inóculo: Selecionar 3 ou mais colônias de cada placa dos diversos meios. Repicar cada colônia para um tubo com ágar sal triptona (T1N1) inclinado. Incubar a 36 ± 1°C por 24 horas. 5.5.2 “String Test”; Colocar uma gota (grande) de solução de desoxicolato de sódio 0,5 % sobre uma lâmina. Retirar uma alçada da cultura mantida em T1N1 inclinado (5.5.1) e suspendê-la na gota. O aparecimento, em cerca de um minuto, de uma massa mucóide, que forma um filamento quando a alça é suspensa a uma altura de 2 a 3 cm da lâmina (“string” test positivo), é presuntivo da presença de Vibrio cholerae. 5.5.3 Prova da oxidase. Usando palitos de madeira, de plástico descartáveis ou pipetas Pasteur, estéreis, ou alça de platina, realizar a prova de oxidase espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase, ou sobre tiras de papel para teste de oxidase, comercialmente disponíveis. Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Após este tempo, podem ocorrer reações falso- positivas. O aparecimento de cor azul (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina) ou vermelho intenso (oxalato de para-amino-dimetilanilina) é indicativo de reação positiva. Não utilizar alças de níquel-cromo ou alças de aço para realizar a prova de oxidase, pois traços de óxido de ferro na superfície flambada podem produzir reação falso-positiva. O Vibrio cholerae é oxidase positiva. 5.5.4 Coloração de Gram: A partir da cultura mantida em T1N1, fazer um esfregaço e corar pelo método de Gram, de acordo com as instruções contidas no Anexo VII, “Procedimentos de coloração”, deste Manual. O Vibrio cholerae apresenta-se como bastonete Gram negativo, reto ou curvo. 5.5.5 Leitura: Serão consideradas como suspeitas de Vibrio cholerae as colônias que forem oxidase positiva, "String Test" positivo e se mostrarem ao microscópio como bastonetes Gram negativos, retos ou curvos. 5.6 Provas para a identificação de Vibrio cholerae 5.6.1 Teste do halofilismo: A partir da cultura mantida em T1N1, com auxílio de agulha de níquel-cromo ou de platina, inocular tubos contendo caldo peptonado sem sal, tubos contendo caldo peptonado sal 3% e caldo peptonado sal 6%. Incubar a 36 ± 1ºC por 24 horas. Após o período de incubação, observar a presença de turvação nos meios. O Vibrio cholerae cresce na ausência e na presença de 3% de sal e não cresce na presença de 6% de sal. Esta prova permite a diferenciação entre Vibrio cholerae e Vibrio alginolyticus, pois o primeiro cresce na ausência de sal, o que não acontece com o segundo. Observação: Reservar o tubo com o caldo peptonado sal 3%, que servirá de inóculo para outras provas de identificação. 5.6.2 Ágar ferro dois açúcares (Kligler): A partir das culturas mantidas em T1N1, com auxílio de uma agulha de níquel-cromo ou de platina, inocular o ágar Kligler mediante picada central profunda, estriando na superfície inclinada do bisel. Incubar a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas. Neste meio, o Vibrio cholerae fermenta a glicose presente, produzindo a acidificação da 3%, com auxílio de alça de níquel-cromo ou de platina, inocular um tubo contendo caldo arginina. Semear também um tubo de meio base (sem arginina) para controle. Cobrir os tubos com 1 mL de óleo mineral, ou vaselina líquida, estéril. Incubar a 36 ± 1ºC por no máximo 4 dias, juntamente com um tubo de caldo arginina não inoculado e óleo, que servirá de controle negativo. Examinar os tubos todos os dias. Durante o período de incubação, a cor do meio passa para amarela devido à fermentação da glicose e, ocorrendo a hidrólise da arginina, o meio retorna à cor púrpura devido à produção de aminas primárias e dióxido de carbono. O tubo controle, sem aminoácido, deve virar para amarelo e assim permanecer. O Vibrio cholerae não hidrolisa a arginina, portanto ambos os tubos devem permanecer amarelos. 5.7.8 Leitura: Serão consideradas como suspeitas de Vibrio cholerae as colônias que apresentarem as características abaixo, que deverão ser confirmadas por meio do teste sorológico. Hugh-Leifson (Meio O/F) glicose - Fermentativo Fermentação do manitol - Positivo Fermentação da arabinose - Negativo Fermentação da manose - Positivo Fermentação do inositol - Negativo Descarboxilação da ornitina - Positivo Hidrólise da arginina - Negativo 5.8 Teste sorológico: Marcar duas seções de aproximadamente 1 x 2 cm no interior de uma placa de Petri ou em uma lâmina de vidro de 2 x 3 polegadas ou em uma placa Huddleson. Colocar uma pequena quantidade da cultura, crescida em ágar T1N1 inclinado, diretamente sobre a placa ou lâmina, na região marcada. Adicionar uma gota de solução salina 0,85% na parte inferior de cada uma das regiões marcadas. Com auxílio de uma alça ou agulha de níquel-cromo ou de platina, suspender a cultura com solução salina em cada seção. Adicionar uma gota do anti-soro polivalente de Vibrio cholerae a uma das seções com a suspensão da cultura e misturar com a alça. A outra seção contendo antígeno é somente um controle de autoaglutinação. Observar a reação em 1 minuto contra um fundo escuro. Uma reação positiva é indicada por uma aglutinação rápida e forte. Enviar as culturas que se comportem como Vibrio cholerae, em ágar estoque, para tipificação à Instituição de Referência designada pela CLA. 6. RESULTADO Serão consideradas como positivas para Vibrio cholerae as culturas que apresentarem os resultados esperados tanto nas provas adicionais de identificação quanto no teste sorológico. Expressar o resultado como: Pesquisa de Vibrio cholerae: Presença/25g ou mL; ou Pesquisa de Vibrio cholerae: Ausência/25g ou mL 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA ICMSF. International Commission on Microbiological Specifications for Foods. Microorganismos de los Alimentos – Técnicas de Análisis Microbiológico. V.1. 2.ed. Acribia, Zaragoza - Espanha. ELLIOT, E.L.; KAYSNER, C.A.; JACKSON, L. e CEBULE, T.A. V. cholerae, V parahaemolyticus, V. vulnificus and Others víbrio spp. In Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponível em: http://www.cfsan.fda.gov. KAYSNER, C.A.; DePAOLA, A. Vibrio . In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4 ed. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), Washington: American Public Health Association, 2001, p. 405 - 420. CAPÍTULO XVIII PESQUISA DE Escherichia coli O157:H7 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento analítico para a pesquisa de Escherichia coli O157:H7 em alimentos e água. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Enriquecimento seletivo: Baseia-se na incubação de 25 ± 0,2 g ou mL da amostra em solução salina peptonada tamponada adicionada de vancomicina, cefixime e cefsulodin (SPT- VCC), por 6 horas em temperatura de 36 ± 1ºC. O efeito seletivo é exercido pela associação de vancomicina, cefixime e cefsulodin, que visa à inibição da flora acompanhante, especialmente Proteus sp e Aeromonas sp. 2.2 Separação imunomagnética: Baseia-se em duas ações principais: a captura por ligação imunológica e a separação por ação de forças magnéticas. A aplicação dessas duas ações leva à obtenção de efeitos de concentração e purificação do microrganismo-alvo. O sistema de separação imunomagnética utiliza microesferas superparamagnéticas cobertas uniformemente com uma fina camada polimérica, biologicamente inerte, que protege o material magnético e oferece uma área de superfície definida para adsorsão ou acoplamento de várias moléculas onde estão ligados anticorpos policlonais anti E coli O157. Na língua inglesa, estas microesferas são denominadas de “beads”. 2.2.1 Lavagem das microesferas: Baseia-se em três passos de lavagem com solução salina tamponada, adicionada de tween 20, realizados com a finalidade de retirar microrganismos inespecificamente ligados às partículas imunomagnéticas. 2.3 Isolamento: Baseia-se na semeadura da alíquota imunomagneticamente separada sobre a superfície seca de ágar MacConkey Sorbitol (MCS), o que permite que as células aderidas às microesferas formem colônias. Normalmente mais de uma célula se adere a cada partícula imunomagnética, o que pode resultar em colônias originárias de mais do que uma célula aderida. No ágar MCS, o efeito seletivo é exercido pelos sais biliares e pelo cristal violeta presentes no meio, que atuam inibindo a flora Gram positiva. A fermentação do sorbitol é evidenciada pela viragem da cor do indicador de pH (vermelho neutro) para vermelho intenso. 2.4 Identificação bioquímica: Baseia-se na inoculação das culturas suspeitas em uma bateria miniaturizada de testes padronizados. Os microtubos, contendo substratos desidratados para cada teste, são reidratados pela adição da suspensão do microrganismo teste em diluente específico para esta finalidade. Durante a incubação a 36 ± 1ºC, devido ao metabolismo bacteriano, ocorrem mudanças de coloração dos indicadores contidos no substrato. Novobiocina; Solução aquosa de Cefixime 1%; Solução de Sorbitol 10%; Solução de Celobiose 10%; Solução de Dulcitol 10%; Reativo para oxidade (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de para-amino- dimetilanilina) ou tiras para teste de oxidase; Cloreto férrico; Reativo de Kovac´s(ou, opcionalmente, reativo de Ehrlich); Hidróxido de potássio; Alfa naftilamina 0,5%; Alfa naftol; Ácido sulfanílico 0,8%; Solução aquosa de Cloreto de Cálcio 10 mmol; Partículas imunomagnéticas de 280nm cobertas com anticorpo antiEscherichia coli O157; Sistema miniaturizado para identificação de Enterobactérias. Em alguns testes, a leitura final somente se realiza após a adição de reativos específicos. 2.5 Látex teste O látex-teste para identificação de Escherichia coli O157 consiste de dois reagentes à base de látex. O primeiro é formado por partículas de látex, cobertas com anticorpo específico produzido em coelho (látex reagente); o segundo é o reagente controle, que é formado por partículas de látex, cobertas com globulinas de coelho préimune (látex controle). Quando cultivos de Escherichia coli O157 são submetidos ao látex-teste, ocorre aglutinação do látex-reagente e não do látex-controle. 2.6 Provas complementares Outras provas complementares são realizadas com a finalidade de identificar e diferenciar Escherichia coli O157:H7 de outros membros de sua espécie, tais como motilidade, produção de â-Dglicuronidase, e fermentação de carboidratos. A verificação da produção de α-hemolisina destina-se à obtenção de um indicativo sobre a verocitotoxigenicidade do isolado, já que existe uma forte correlação positiva entre a produção desta hemolisina e de verotoxina. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e outros materiais básicos para laboratórios de microbiologia de alimentos; Ágar MacConkey-sorbitol (MCS); Ágar eosina azul de metileno (EMB); Ágar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA); Ágar soja triptona, com CaCl2 e eritrócitos lavados de carneiro (ASSTCa); Ágar soja triptona; Ágar estoque; Ágar motilidade; À primeira, misturar uma gota do látex reagente e sobre a outra uma gota do látex controle. Misturar por um minuto e observar aglutinação. Considerar como positivas as culturas que, em um minuto ou menos, apresentarem aglutinação apenas no látex reagente. Para os controles positivo e negativo, utilizar os controles que acompanham o kit. As culturas que apresentarem resultado negativo no teste de aglutinação de látex devem ser descartadas. 5.8 Testes adicionais 5.8.1 Verificação da motilidade das culturas suspeitas.: A partir das culturas puras, em ágar estoque inclinado, que apresentarem reação positiva frente ao látex reagente e negativa frente ao látex controle, repicar para tubos contendo ágar motilidade modificado, utilizando agulha de inoculação. Incubar a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas. Observar o tipo de crescimento: difuso (motilidade positiva) ou apenas na linha de inoculação (motilidade negativa). As cepas de Escherichia coli O157:H7 apresentam motilidade positiva, enquanto que a E.coli ATCC 25922 apresenta motilidade negativa. 5.8.2 Verificação da produção de â-D-glicuronidase e de gás em caldo BRILA-MUG. A partir das culturas isoladas conforme item 5.5, repicar para tubos com caldo verde brilhante bile-lactose-metilumbeliferil-glicuronídeo (BRILA-MUG), com tubos de Durhan invertidos. Incubar a 36 ± 1ºC por 24 a 48 horas. Observar a produção de gás nos tubos de Durhan. Anotar os resultados. Em câmara de UV (366nm), verificar a formação de 4-metilumbeliferona a partir do MUG. Considerar como positivo para â-Dglicuronidase as culturas que produzirem fluorescência no meio de cultura. A Escherichia coli O157:H7 não produz â-D-glicuronidase, portanto não se observa fluorescência no caldo BRILA-MUG. A Escherichia coli ATCC 25922 produz fluorescência (reação positiva) neste meio. OBS: A cultura de E.coli O157:H7 ATCC 43888 (não toxigênica) não produz gás no caldo verde brilhante lactose 2%, enquanto que as E.coli O157:H7 verotoxigênicas ATCC 43889, ATCC 43890 e ATCC 43894 são capazes de produzir gás neste meio. 5.8.3 Verificação da fermentação do sorbitol, da celobiose e do dulcitol A partir das culturas isoladas conforme item 5.5, repicar para tubos contendo 3 mL de caldo vermelho de fenol base adicionado, separadamente, de sorbitol, celobiose e de dulcitol (esterilizados por filtração), de forma a obter uma concentração final do açúcar de 0,1%. Incubar os tubos a 36 ± 1ºC por 24 a 30 horas. Após incubação, observar a produção de ácido, evidenciada pela viragem do indicador vermelho de fenol para amarelo nas culturas fermentadoras dos açúcares presentes. Os resultados esperados estão na tabela abaixo: Cultura Sorbitol Celobiose Dulcitol Escherichia coli O157:H7 - - + Escherichia hermannii - + -/+ Escherichia fergusonii - + ± Escherichia coli + -* ± ± : 60% são pos. -/+ : 19% são positivas -*: 2% são positivas 5.8.4 Verificação da produção de enterohemolisina: A partir das culturas puras obtidas conforme item 5.5, repicar em estrias para a superfície seca de ágar soja triptona, com cloreto de cálcio e eritrócitos de carneiro (ASSTCa). Para preparar o ASSTCa, a cada 100mL de ágar soja triptona adicionar 1 mL CaCl2 1M e 5 mL de eritrócitos lavados de carneiro. Incubar a 36 ± 1ºC por 4 horas. Verificar atividade hemolítica e registrar os resultados obtidos. Reincubar até 24 horas repetindo a leitura. Considerar como positivas para produção de enterohemolisina as culturas que não produzirem hemólise em 4 horas e apresentarem reação hemolítica característica de alfa- hemolisina (coloração esverdeada ao redor das colônias) após 24 horas de incubação. A grande maioria das cepas de Escherichia coli O157:H7 verotoxigênicas são alfa- hemolíticas. 5.9 Provas Opcionais: Adicionalmente, podem ser utilizados sistemas miniaturizados de provas bioquímicas para identificação de enterobactérias, aprovados para uso pela CLA/MAPA. 5.9.1 Sistema miniaturizado para identificação de enterobactérias: Repicar, para tubos com ágar estoque inclinado, as culturas que apresentaram reação positiva frente ao látex reagente, negativas frente ao látex controle, motilidade positiva, β-D-glicuronidase negativa, com ou sem produção de gás a partir da lactose, não fermentadoras do sorbitol e da celobiose, e capaz de fermentar o dulcitol. Incubar a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas. Seguir as recomendações do fabricante do sistema utilizado. 6. RESULTADOS Considerar o resultado positivo para Escherichia coli O157:H7 as amostras em que os isolados se comportarem como abaixo descrito: a) Colônia característica de E.coli em VRBA e BEM; b) Sorbitol negativo no MCS; c) Celobiose negativa no caldo vermelho de fenol; d) Dulcitol positivo no caldo vermelho de fenol; e) Sorbitol negativo no caldo vermelho de fenol; f) Aglutinação positiva frente ao látex reagente em um minuto; g) Aglutinação negativa frente ao látex controle; h) Motilidade positiva. i) â-D-glicuronidase negativa j) Não hemolítica em 4 horas k) Alfa-hemolítica em 24 horas (presuntivo para verotoxina) l) Perfil bioquímico correspondente a Escherichia coli no sitema para identificação de enterobactérias. As culturas que se comportarem como Escherichia coli O157:H7 devem ser mantidas pelo laboratório e encaminhadas à Instituição de Referência para enterobactérias, designada pela CLA para sorotipificação, inclusive com soro flagelar H7, e teste de verotoxigenicidade. Os resultados de confirmação sorológica e de verotoxigenicidade podem demorar um tempo relativamente grande. Por este motivo, emitir o resultado de análise considerando os resultados obtidos no laboratório. Quando o resultado sorológico confirmar a presença de E.coli O157:H7 (verotoxigênica ou não), comunicar por escrito ao responsável pelo SIF que encaminhou a amostra para análise. Manter arquivo de todas informações sorológicas realizadas pela Instituição de Referência. 6.1 Expressão do resultado; Expressar o resultado como: Pesquisa de Escherichia coli O157:H7 - Presença /25 g ou mL; ou Pesquisa de Escherichia coli O157:H7 - Ausência/25 g ou mL. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA BENNETT, A.R.; MacPHEE, S. BETTS, R.P. The isolation and detection of Escherichia coli O157:H7 by use of immunomagnetic separation and immunoassay procedures. Letters in Applied Microbiology. Oxford; v. 22, p. 237-243, 1996. BEUTIN, L.; MONTENEGRO, M.A.; OSKOV, I. et al. Close association of verotoxin (Shiga- like toxin) production with enterohemolysin production in strains of Escherichia coli. Journal of Clinical Microbiology. Washington; v. 27, p. 2559-2564, 1989. CHAPMAN, P.A. Evaluation of commercial latex slide test for identifying Escherichia coli O157. Journal of Clinical Pathology. London, v. 42, p. 1109-1110, 1989. CUBBON, M.D.; COIA, J.E.; HANSON. M.F. et al. A comparison of immunomagnetic separation, direct culture and polymerase chain reaction for the detection of verocytotoxin- producing Escherichia coli O157:H7 in human faeces. Journal of Medical Microbiology. Essex, v.44, p. 219-222, 1996 DYNAL(a). Cell separation and protein purification – technical handbook. 2 ed. Oslo: DYNAL, 1996. 165p. DYNAL(b). Testing food sample for Escherichia coli O157:H7 - IMS vs direct plating. Oslo: DYNAL, 1996. FRATAMICO, P.M.; SCHULTZ, F.J.; BUCHANAN, R.L. Rapid isolation of Escherichia coli O157:H7 from enrichment cultures of foods using an immunomagnetic separation method. Food Microbiology, London, v. 9, p. 105-113, 1992. MARCH, S.B.; RATNAM, S. Latex agglutination test for detection of Escherichia coli serotype O157. Journal of Clinical Microbiology, Washington, v. 27, p. 1675-1677, 1989. OLSVIK, O.; POPOVIK, T.; SKJERVE, E. et al. Magnetic Separation Techniques in Diagnostic Microbiology. Clinical Microbiology Reviews, Washington, v. 7, p. 43-54, 1994. SAFARIK, I.; SAFARIKOVÁ, M.; FORSYTHE, S.J. The application of magnetic separations in applied microbiology. Journal of Applied Bacteriology, Oxford, v. 78, p. 576-585, 1995. WRIGHT, D.J.; CHAPMAN, P.A.; SIDDONS, C.A. Immunomagnetic separation as a sensitive method for isolating Escherichia coli O157 from food samples. Epidemiology and Infection, Cambridge, v. 113, p. 31-39, 1994. CAPÍTULO XIX PESQUISA DE Paenibacillus larvae subsp. larvae 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer metodologia analítica para a detecção de Paenibacillus larvae subsp. larvae (referido no restante do texto como P. larvae), agente da enfermidade Cria Pútrida Americana. A metodologia destina-se à verificação da presença de esporos do agente em amostras de produtos da colméia. 2. FUNDAMENTOS 5.5.1 Prova da Catalase; Com auxílio de uma alça de platina, bastão de vidro, palito de madeira ou pipeta de Pasteur estéreis, retirar uma alíquota do cultivo, transferir para uma lâmina ou placa de vidro contendo uma gota de peróxido de hidrogênio a 3%. Misturar o inóculo ao peróxido e observar a reação. A não formação de borbulhas indica prova negativa para catalase. A formação de borbulhas indica prova positiva para catalase. As culturas de Paenibacillus larvae são catalase negativas. Repicar as colônias catalase negativas para tubos contendo ágar leite com tiamina inclinado e incubar a 36 ± 1ºC por 24 a 48 h. Manter essas culturas para testes complementares, caso sejam necessários. 5.6 Provas Confirmativas: Realizar as provas confirmativas completas em cada uma das colônias catalase negativas. 5.6.1 Coloração de Gram; Das colônias suspeitas, fazer esfregaço e corar pelo método de Gram. O P.larvae se apresenta como bastonete Gram positivo, comumente longo e fino, porém, pode se apresentar de diversos tamanhos, em cadeias de comprimento variável. As culturas que se apresentarem como suspeitas no Gram e catalase negativas devem ser testadas para: 5.6.2 Crescimento em superfície de ágar nutriente sem extrato de levedura: A partir das colônias catalase negativas, repicar também em tubos com ágar nutriente inclinado isento de extrato de levedura e incubar a 36 ± 1ºC por 3 dias. A maioria dos Paenibacillus larvae apresenta escasso crescimento em ágar nutriente sem extrato de levedura após 3 dias. 5.6.3 Decomposição da caseína e verificação de crescimento típico no ALT A partir das colônias catalase negativas, repicar sobre a superfície seca de placas com ágar leite com tiamina (ALT) e incubar a 36 ± 1ºC por 3 dias. Após incubação, verificar a presença de halo transparente ao redor das colônias. O Paenibacillus larvae decompõe a caseína em até 3 dias. As colônias de Paenibacillus larvae subsp. larvae no ALT se apresentam de coloração entre branco e gelo, de aspecto sutil e delicado (pouco densas). Diferenciação entre Paenibacillus larvae subsp. larvae e outros microrganismos relacionados comumente encontradas em amostras de produtos apícolas. Microrganismos Decomposição da caseína Catalase Crescimento em Ágar nutriente sem extrato de levedura P.larvae subsp. larvae POS* NEG NEG ou escasso Paenibacillus alvei POS POS POS Brevibacillus laterosporus POS POS POS P.larvae subsp. Pulvifaciens POS NEG POS Paenibacillus popilliae NEG NEG NEG Paenibacillus lentimorbus NEG NEG NEG Associado ao crescimento característico no ALT. 6. RESULTADOS 6.1 Interpretação Considerar como P.larvae subsp. larvae as culturas que se apresentarem como bastonetes Gram positivos finos, médios a longos, dispostos em cadeias, catalase negativas, com reação positiva para hidrólise da caseína associada ao crescimento típico no ALT, e com crescimento escasso no ágar nutriente sem extrato de levedura em 3 dias. 6.2 Expressão do Resultado Expressar o resultado das análises de mel como: Pesquisa de Paenibacillus larvae subsp. larvae: Presença /20 mL de mel; ou Pesquisa de Paenibacillus larvae subsp. larvae: Ausência /20 mL de mel. Para outros produtos da colméia expressar o resultado como: Presença (ou Ausência) / quantidade de amostra submetida à análise. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA SCHUCH, D.M.T.; MADDEN, R.H.; SATTLER, A. 2001. An improved method for the detection and presumptive identification of Paenibacillus larvae subsp. larvae spores in honey J. Apicult. Res., 40(2): 59-64. GOCHNAWER, T. A., CORNER, J. 1974. Detection and identification Bacullis larvae in a commercial pollen samples. J. Apicult. Res. 13: 264-267. DSMZ - Deutsche SammLung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. Bacterial Nomenclature Up-to-Date - (Approved Lists, Validation Lists).Nov. 2002. Braunschweig, Germany.Disponível In: http://www.dsmz.de/bactnom/bactname.htm CAPÍTULO XX TESTE DE ESTERILIDADE COMERCIAL PARA ALIMENTOS DE BAIXA ACIDEZ - pH > 4,6 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a verificação da eficácia do processo de esterilização aplicado a alimentos de baixa acidez, comercialmente estéreis; Aplica-se a amostras de alimentos comercialmente estéreis de baixa acidez (enlatados). 2. FUNDAMENTOS Pré-incubação:: Baseia-se na incubação das amostras nas temperaturas de 36 ± 1ºC pelo período de 10 dias e a 55 ± 1ºC pelo período de 5 a 7 dias, objetivando a detecção de crescimento bacteriano com formação de gás, evidenciado pelo tufamento da embalagem e na verificação de possíveis microfugas. 2.1 Semeadura e incubação: Baseia-se na utilização de meios líquidos não seletivos com capacidade de promover o crescimento de microrganismos por meio da incubação em aerobiose e anaerobiose, em temperaturas ideais para o desenvolvimento de microrganismos mesófilos e termófilos. 2.2 Provas complementares 2.2.1 Coloração pelo método de Gram e de esporos: Baseia-se na observação microscópica das características morfológicas e tintoriais dos microrganismos presentes e de seus esporos. Prova da Catalase Baseia-se na verificação da capacidade do microrganismo em teste produzir a enzima catalase, que decompõe o peróxido de hidrogênio, liberando oxigênio, o que é evidenciado por meio da formação de borbulhas. 2.2.3 Prova da termofilia estrita: Baseia-se na verificação da germinação e crescimento dos esporos nas temperaturas de 36 ± 1ºC e 55 ± 1ºC para certificação da exigência absoluta de elevada temperatura para seu desenvolvimento. A germinação dos esporos a 36 ± 1ºC indica a capacidade mesofílica do microrganismo. O crescimento a 36 ± 1ºC e a 55 ± 1ºC indica a capacidade termofílica facultativa do microrganismo. O crescimento somente a 55 ± 1ºC indica a capacidade termofílica estrita do microrganismo. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos; Equipamentos, vidraria e outros; Abridores metálicos estéreis; Pinças estéreis; Caldo de carne cozida (CCC) ou Caldo Tarozzi; Caldo glicose triptona; Ágar glicose triptona; Ágar nutriente; Ágar nutriente com sulfato de manganês; Ágar para esporulação; Ágar cérebro-coração (ABHI); Corantes para a coloração de esporos; Corantes para a coloração de Gram; Peróxido de hidrogênio 3%; Vaspar ou vaselina ou óleo mineral ou parafina líquida. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos. 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Pré-incubação: Seguir os procedimentos para pré incubação no item 3.1.1 do Anexo V, “Procedimento para o preparo, pesagem e descarte de amostras”, deste Manual. Verificar, após o período de pré-incubação a 36 ± 1ºC e 55 ± 1ºC, se os recipientes não sofreram tufamento. Verificar se o papel filtro apresenta manchas que possam evidenciar a presença de microfugas ou vazamentos. Registrar como “sem alteração” quando não se observar qualquer alteração dos recipientes e como “alterado” quando qualquer alteração for detectada. Descrever a alteração, quando ocorrer. 5.1.1 Amostras que sofreram alteração durante a pré-incubação: Ao final da pré- incubação, quando o papel filtro sobre o qual ficaram incubadas as latas estiver manchado, evidenciando a presença de microfugas, submeter a respectiva amostra à análise de aeróbios e anaeróbios, mesófilos ou termófilos, de acordo com a temperatura da pré-incubação. Proceder complementares, caso sejam necessários. 5.7.3 Prova da termofilia estrita: Quando forem detectados bastonetes termófilos, realizar prova para confirmação de termofilia estrita do microrganismo isolado. A partir dos tubos com caldo glicose triptona positivos incubados a 55 ± 1ºC, repicar maciçamente para tubos contendo ágar nutriente inclinado com sulfato de manganês (ou ágar para esporulação). Incubar a 55 ± 1ºC de 2 a 10 dias. A partir do segundo dia, verificar a presença de esporos por meio da aplicação da técnica para coloração de esporos, conforme instruções constantes do Anexo VII, “Procedimentos de coloração”, deste Manual. Quando forem detectadas culturas esporuladas, preparar suspensão de esporos, lavando o crescimento obtido no tubo com ágar nutriente/sulfato de manganês com 1 mL de água destilada ou deionizada estéril. Inativar as formas vegetativas por meio da aplicação de um choque térmico a 80ºC por 15 minutos na suspensão preparada de 1 mL. Inocular 0,1 mL do lavado, após o choque térmico, em dois tubos contendo caldo glicose triptona. Incubar um tubo a 36 ± 1ºC e outro a 55 ± 1ºC por 2 a 4 dias. Verificar o crescimento de microrganismos, evidenciado pela turvação do caldo. O crescimento bacteriano somente no tubo incubado a 55 ± 1ºC determina a termofilia estrita do microrganismo isolado. O crescimento bacteriano nos dois tubos determina a termofilia facultativa do microrganismo isolado. Registrar no resultado final a característica mesofílica ou termofílica do microrganismo isolado. 5.7.4 Confirmação de microrganismos “flat sour” (opcional): A partir das culturas obtidas nas placas de ABHI, provenientes dos tubos positivos de caldo glicose triptona incubados a 55 ± 1ºC, repicar para a superfície seca de 2 placas com ágar glicose triptona. Incubar uma das placas a 36 ± 1ºC por 72 horas e a outra a 55 ± 1ºC por 48 horas em câmara úmida. O crescimento de colônias amarelas, regulares, com diâmetro de aproximadamente 2 a 3 mm, rodeadas de zona de clarificação também amarela, nas placas incubadas a 55 ± 1ºC, com núcleo opaco e o não crescimento naquelas incubadas a 36 ± 1ºC, confirmará a presença de Bacillus stearothermophilus (renomeado – Geobacillus stearothermophilus ), microrganismo responsável pela deterioração “flat sour”. 6. RESULTADOS 6.1 Pré-incubação: Expressar, no campo referente a emissão do resultado para prova de pré-incubação, nas temperaturas requeridas, o resultado como “sem alteração” quando não se observar qualquer alteração ou anormalidade no recipiente e nas características físicas e/ou sensoriais da amostra, e como “alterado” quando for observada qualquer alteração ou anormalidade no recipiente ou nas características físicas e/ou sensoriais da amostra. Nesse caso, descrever o tipo de alteração observado. 6.2 Pesquisa de aeróbios e anaeróbios termófilos e mesófilos: Expressar, nos campos referentes a emissão dos resultados para as pesquisas de aeróbio e anaeróbio mesófilo e termófilo, o resultado como “negativa”, quando não for observado qualquer desenvolvimento de microrganismos no teste aplicado e como “positiva” quando for observada a presença de microrganismos. Sempre que possível, fazer constar do resultado final as observações feitas ao microscópio. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA BRASIL. Ministério da Agricultura e do Abastecimento-Secretaria de Defesa Animal - Departamento Nacional de Defesa Animal - Coordenação Geral de Laboratório Animal - Métodos de Análise Microbiológica para Alimentos - Teste de Esterilidade Comercial Brasília, D.F. 1991/1992 - 2ª Revisão, p. 111 - 113. DEIBEL K. E.; JANTSCHKE, M. Canned Foods - Tests for Commercial Sterility . In: In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p. 577-588. DENNY C. B; PARKINSON, N.G. Canned Foods - Tests for cause of spoilage . In: In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.583-600. DSMZ - Deutsche SammLung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. Bacterial Nomenclature Up-to-Date-(Approved Lists, Validation Lists).Nov.2002.Braunschweig, Germany.Disponível In:http://www.dsmz.de/bactnom/bactname.htm ANEXO I PROCEDIMENTOS DE RECEBIMENTO DE AMOSTRAS 1. RECEBIMENTO DAS AMOSTRAS NO LABORATÓRIO O setor de recepção fará a triagem das amostras enviadas pelo SIF. Somente serão aceitas, pelo setor de recepção do laboratório, as amostras lacradas pelo responsável pela colheita que vierem acompanhadas de cinta de identificação no produto (protegida para evitar danificações) e Certificado Oficial de Análise (COA) devidamente preenchido. 1.1 Certificados Oficiais de Análise: Os COAs deverão ser originais, carbonados, carimbados e assinados pelo responsável pela colheita. Cabe a este o correto preenchimento (à mão ou à máquina), legível em todas as vias. O responsável pela colheita deverá preencher os campos 1, 2 e 4 a 16 do certificado. Serão recusadas as amostras que vierem acompanhadas de fotocópias dos mesmos ou de Certificado Oficial de Análise (COA) proveniente de outra instituição. 1.2 Número de Protocolo; O setor de recepção de amostras do laboratório deverá registrar o número do protocolo da amostra no laboratório no campo nº 3 do COA. 1.3 Outras verificações e registros: No recebimento das amostras, deverão ser anotadas informações referentes à data, hora e temperatura de recebimento da amostra. No campo referente à temperatura da amostra no recebimento, deverá ser registrada a condição de resfriamento em que a amostra foi entregue no laboratório, isto é: resfriada, congelada ou em temperatura ambiente. Quando houver necessidade de verificação da temperatura com termômetro, deverá ser utilizada uma amostra recebida nas mesmas condições das demais e que será usada unicamente para esta finalidade. 1.4 Amostras rejeitadas; O setor de recepção de amostras reterá todos os Certificados Oficiais de Análise das amostras que chegarem fora das condições especificadas nestas normas, os quais serão encaminhados ao Setor de Microbiologia com a informação (código) do motivo da rejeição. O Setor de Microbiologia fará constar do corpo do certificado (espaços destinados aos resultados) a informação: “Amostra não analisada”, seguida da descrição do motivo pelo qual a análise não foi realizada. Caberá ao portador das amostras a responsabilidade do retorno das mesmas sempre que rejeitadas por estarem em desacordo com as normas aqui estabelecidas. As amostras enviadas por transportadora ou correio, que forem rejeitadas pelo laboratório, ficarão à disposição do remetente por 3 (três) dias. Após esse prazo, serão incineradas. 1.4.1 Motivos e respectivos códigos para rejeição de amostras 001 / AD - amostra descongelada 002 / AP - amostra em putrefação 003 / AV - amostra violada (lacre ou embalagem) 004 / PV - amostra fora do prazo de validade 005 / EP - prazo excedido entre colheita entrada no laboratório 006 / FC - amostra fora do cronograma 007 / CI - certificado incompleto ou incorretamente preenchido 008 / OM - outro motivo - será especificado 2. AMOSTRAS FORA DE CRONOGRAMA Amostras fora do cronograma somente serão aceitas para análise nos seguintes casos: Quando houver análise anterior com resultados fora dos padrões; Quando houver autorização prévia por parte do laboratório ou do Serviço de Inspeção de Produtos (SIPA). Em ambos os casos, fazer constar do certificado de análise o responsável pela autorização da remessa da amostra. O SIPA deverá notificar o laboratório com antecedência sobre a autorização e necessidade de análise de amostras fora do cronograma. 3. DEVOLUÇÃO DE AMOSTRAS APÓS ANÁLISE As amostras que derem entrada no laboratório de microbiologia em nenhuma hipótese serão devolvidas ao interessado, em razão de que nesta área são manipulados microrganismos de risco à saúde pública. 4. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA BRASIL. Ministério da Agricultura do Abastecimento e da Reforma Agrária. Secretaria de Defesa Agropecuária. Departamento de Defesa Animal. Manual de métodos microbiológicos para alimentos. Coordenação Geral de Laboratório Animal. 1991/1992 2ª revisão. p.4-5 H. W., ANDREWS, G. A. JUNE. Food sampling and preparation of sample homogenate. In: Bacteriological Analytical Manual. 8.ed. Food and Drug Administration. AOAC International, Gaithersburg, USA. 1995. p. 1-2. MIDURA, T.F., BRYAN, R.G. Sampling plans, sample collection, shipment and preparation for analysis. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. cinco gramas de alimento não correspondem necessariamente a 10 ou 25 mL de alimento. O volume vai variar com a densidade e temperatura do alimento em análise. Alimentos sólidos, em pó ou pastosos sempre terão que sofrer diluição antes do início da análise, usando-se o critério massa por unidade de volume (m/v). Normalmente a diluição inicial de amostras sólidas, em pó ou pastosas, utilizada para análises microbiológicas é 1:10. Outras diluições como 1:2, 1:5, ou outras podem ser usadas em casos especiais. Antes do início do procedimento de diluição é fundamental que a amostra seja bem homogeneizada (produtos líquidos em pó e pastosos) ou que a alíquota para análise, obtida de produtos sólidos, seja tomada de vários pontos de forma a representar realmente a amostra. 1.5 Pontos críticos do processo de diluição de amostras de alimentos 1.5.1 Homogeneização da amostra e suas diluições: A homogeneização inadequada da diluição inicial, e das subseqüentes, poderá acarretar diferenças muito grandes na contagem das colônias e resultados incoerentes quando do uso de duas ou mais diluições sucessivas. Para a obtenção de resultados corretos de contagem de microrganismos em amostras de alimentos, a homogeneização de todas as diluições é ponto fundamental. A homogeneização da diluição inicial (amostra/diluente) deverá ser realizada em “stomacher” entre 30 segundos a 2 minutos, dependendo do tipo de amostra. A homogeneização das diluições subseqüentes deverá ser realizada com o auxílio de agitador de tubos, por um período de tempo não superior a 1 minuto. Evitar a homogeneização manual das diluições, pois o processo manual resulta a cada vez em diferentes graus de homogeneidade. 1.5.2 Diluições a utilizar x Intervalo de precisão e repetibilidade Considerando que o intervalo de precisão e repetibilidade poderá variar de 15 a 150, de 20 a 200, de 25 a 250 e ainda de 30 a 300, dependendo da metodologia analítica empregada, caberá ao analista estabelecer diluições que possibilitem a contagem de colônias nesses intervalos de precisão. Dessa forma, para alimentos com expectativa de crescimento bacteriano baixo, devido ao seu processo de fabricação e de conservação, as inoculações deverão ser efetuadas a partir da diluição inicial 100 para líquidos ou 10-1 para sólidos ou pastosos, com no mínimo, duas diluições sucessivas. Por outro lado, para alimentos que se desconhece o número aproximado de microrganismos existentes, as diluições a serem preparadas deverão garantir condições de realização das contagens. Usualmente, nesses casos, utilizam-se as diluições 10-1 a 10-6. 1.5.3 Tempo desde a primeira diluição até a inoculação em meios de cultura O tempo gasto para a execução das diluições de uma amostra de alimentos até sua inoculação em meios de cultura deverá ser de, no máximo, 20 minutos, de forma a não permitir a multiplicação dos microrganismos contidos nas diferentes diluições, o que acarretaria a obtenção de resultados falsos para a contagem de microrganismos. 1.5.4 Possíveis contaminações acidentais: Ao retirar as pipetas dos cartuchos ou ao desenrolar o papel que envolve individualmente cada uma delas, tomar o máximo de cuidado para não tocar com a pipeta a superfície externa do cartucho, as mãos, as bordas externas dos tubos ou dos recipientes. Esses mesmos cuidados deverão ser tomados quando se estiver efetuando as inoculações nas placas ou nos tubos de ensaio. Caso tal situação ocorra, despreze a pipeta e reinicie o procedimento corretamente. 1.5.5 Aderência do líquido às paredes da pipeta: Não inserir a ponta da pipeta mais do que 2,5 cm abaixo da superfície do líquido dentro dos tubos ou dos recipientes contendo as diluições das amostras, diminuindo assim, a superfície de contato da pipeta com a amostra diluída. Dispensar lentamente o inóculo, permitindo a drenagem total até a marca final da pipeta por um período de 4 a 6 segundos, nos casos em que o mesmo corresponda ao volume total da pipeta. Preferentemente, usar pipetas que não sejam de esgotamento total. Quando da dispensa de parte do conteúdo de uma pipeta, deixar que o líquido escorra lentamente. O procedimento de expulsão rápida do líquido contido na pipeta acarreta a retenção de um maior volume de líquido aderido às paredes. 1.5.6 Tipo e capacidade das pipetas: Sempre utilizar pipetas com marcação nítida de volume e, preferencialmente, que permitam a pipetagem do volume desejado sem que seja necessária a expulsão da última porção da pipeta. Quando esse tipo de pipeta não estiver disponível no laboratório, para a pipetagem de 1 mL, é recomendável a utilização de pipetas com capacidade de 2 mL, com graduação de 1/10 ou 1/100, aspirando o inóculo até o volume total da mesma e dispensando a primeira porção (1 mL) no interior da placa ou do tubo. As pipetas utilizadas não deverão ter capacidade superior a 10 vezes o volume a ser medido, para assegurar que o inóculo dispensado seja o requerido. Por exemplo, se o inóculo for de 0,1 mL, utilizar uma pipeta de 1 mL com graduação de no mínimo 1/10, aspirando o inóculo até o volume total da mesma e dispensando a primeira divisão no interior da placa ou do tubo. 1.5.7 Precisão dos volumes dos inóculos; Manter a pipeta sempre na posição vertical e inclinar o tubo até posição que forme um ângulo de 45º em relação à pipeta, facilitando, desta forma, a leitura na pipeta do "menisco" do volume a ser dispensado. 1.5.8. Uso de pipetas: Sempre utilizar uma pipeta para cada diluição. Não tocar com a pipeta de uma determinada diluição no diluente da diluição seguinte. NUNCA enxaguar a pipeta com o diluente da diluição subseqüente. A mesma pipeta poderá ser utilizada para a semeadura de diluições de amostras, desde que se parta da maior diluição (amostra mais diluída) para a menor diluição (amostra menos diluída). 2. SOLUÇÕES Soluções são misturas homogêneas unifásicas constituídas de duas ou mais substâncias miscíveis. São formados por dois compostos, o soluto e o solvente. O soluto é a substância que está dissolvida no solvente e, conseqüentemente, o solvente é a substância que dissolve o soluto. Nas soluções, os dois componentes não se encontram quimicamente combinados. 2.1 Soluções saturadas: São soluções que contém a quantidade máxima possível de um soluto, em uma determinada temperatura e pressão, perfeitamente dissolvido no solvente. Por exemplo, em soluções de Cloreto de sódio, a saturação ocorre quando há aproximadamente 360 g do sal por litro de água. 2.2 Concentração de soluções; Concentração é o quociente entre a quantidade do soluto e a do solvente ou da própria solução. Para determinar esse quociente alguns autores referem-se ao “título de uma solução”. A concentração de uma solução pode ser expressa de 3 maneiras: a) Massa por unidade de massa (m/m); b) Massa por unidade de volume (m/v); c) Volume por unidade de volume (v/v). A forma mais precisa de se estabelecer a concentração é o de massa por unidade de massa (m/m), porém, nos laboratórios de microbiologia, onde se trabalha rotineiramente com produtos sólidos que necessitam ser diluídos durante a análise, o sistema mais freqüentemente usado é o de massa por volume (m/v). Para amostras líquidas, o sistema usado é o de volume por volume (v/v), que é o menos preciso dos três, fato que se deve às variações de volume em função das temperaturas do soluto e do solvente (amostra e diluente). 2.2.1 Relação de massa com massa C = M M Onde: C = Concentração m = Massa do soluto M = Massa do solvente Neste caso a concentração toma dois nomes particulares: * Molaridade: É a relação entre o número de moles do soluto e 1000g do solvente. A concentração expressa em molaridade é utilizada em ebuliometria e criometria. * Porcentagem de peso: É a relação entre a massa do soluto e 100g da solução. Exemplo: Preparar uma solução de sulfato de sódio a 10% em peso significa que em 100g da solução existem 10 g do sulfato de sódio e 90 g de água. Relação de volume com volume C = V V1 Onde: C = concentração V = Volume do soluto V1 = Volume da solução Neste caso, a concentração toma o nome de Porcentagem em volume, desde que o volume da solução seja tomado como 100 mL. É aplicada para as soluções líquido/líquido e gás/gás. Assim o álcool a 90% em volume significa que em 100 mL da solução existem 90 mL de álcool. Exemplo 1: Preparar uma solução 4000 U/mL de sulfato de polimixina B em tampão fosfato pH 8. Potência do produto usado: 7600 U/mg Peso 23,7 mg (quantidade pesada) Volume = 23,7 x 7600 = 45,03 mL 4000 Para obter a solução 4000U/mL, basta dissolver as 23,7 mg de sulfato de polimixina em 45,3 mL de tampão. Cada mL desta solução oferecerá uma solução de sulfato de polimixina de 4000U. OBS: Para que não seja necessário adicionar volumes fracionados de diluente, conforme o exemplo acima, pode-se estabelecer, de forma inversa, qual a quantidade de antibiótico a ser pesado para um volume de diluente pré-determinado, procedendo conforme indicado no item 2.5.1. Exemplo 2 No meio SFP há a indicação da adição de 3 mg/L de sulfato de polimixina e de 12 mg/L de canamicina. Quando as quantidades do aditivo são tão pequenas quanto estas, preparar solução-mãe. Adicionar ao meio final, volumes das soluções-mãe que ofereçam uma concentração fina, por litro de meio, correspondente ao indicado pelo fabricante. No caso deste exemplo (meio SFP) preparar: a) solução de sulfato de polimicina a 3mg/L. (potencia 7600 U/mg) Pesar 300mg de sulfato de polimicina e diluir para 100mL, com água destilada. Esta solução terá concentração de 3mg de polimicina B com potência de 7600U/mg por mL. Neste exemplo seria usado 1 mL desta solução por litro d meio. b) Kanamicina – 12mg/mL. Potência 80% 1mg do produto contém 0,8 mg de princípio ativo. Pesar mais de 100mg do antibiótico (por exemplo 158mg) Multiplicar o peso obtido pela potência e dividir pela concentração final desejada para obter o volume de diluente a ser adicionado. X = 158 x 0.8 = 10,58mL 12 OBS: Para que não seja necessário adicionar volumes fracionados de diluentes, conforem o exemplo acima, pode-se estabelecer, de forma inversa qual a quantidade de antibiótico a ser pesado para um volume de diluente pré-determinado, procedendo conforme indicado no item 2.5.1. Cada mL desta solução conterá 12mg de kanamicina 2.5.1. Determinação do peso do peso de antibiótico para preparação de soluções, priorizando o volume. Nos exemplos 1 e 2 acima os volumes de diluentes a serem adicionados resultaram em números quebrados, o que certamente leva a erros na concentração final do antibiótico. Para evitar volumes fracionados, fazer o cálculo inverso, pré estabelecendo o volume de diluente a ser utilizado e calculando a quantidade de antibiótico a ser pesado, usando a mesma fórmula: Peso = Vol. De diluente a adicionar x Conc. Final desejada. Potência Supondo que se dispões de um balão volumétrico de 25mL para a preparação da solução do exemplo 2, acima, proceder conforme segue: Peso = 25x12 = 375mg 0,8 A quantidade de antibiótico a ser pesada neste caso seria de 375mg, que serão diluídas em 25mL de diluente para a obtenção de uma solução com 12mg/mL 2.6 Concentração por Centrifugação: Em microbiologia, o processo de centrifugação é freqüentemente usado para a concentração de células ou esporos em processos de lavagem ou purificação. O processo de centrifugação promove a sedimentação de partículas mais densas por meio da aplicação de força centrífuga obtida pela rotação em alta velocidade. As unidades usadas para indicar centrifugação são “Rotações por minuto” (RPM) e “força gravitacional” (g). Para calcular g se utiliza a seguinte fórmula: g = 0,0000118 x raio do rotor (cm) x (rpm)2 3. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA CAMPBELL, J.M.; CAMPBELL, J.B. Diluições. In.: Matemática de Laboratório - Aplicações Médicas e Biológicas. 3.ed. Editora Roca. São Paulo, SP. 1986. p. 77-88. CAMPBELL, J.M.; CAMPBELL, J.B. Soluções. In.: Matemática de Laboratório - Aplicações Médicas e Biológicas. 3.ed. Editora Roca. São Paulo, SP. 1986. p. 93-118. COOPER, T.G. The tools of Biochemistry. John Wiley & Sons, New York. 1977. 422p. FELTRE, R. Soluções. In.: Química - Físico-Química. 2.ed. São Paulo, SP. Editora Moderna.1983. p. 1-75. SWANSON, K.M.J.; PETRAN, R.L.; HANLIN,J.H. Culture methods for enumeration of microorganisms In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.53-62. ANEXO III PROCEDIMENTOS BÁSICOS DE CONTAGEM 1. TÉCNICAS DE CONTAGEM EM PLACAS As técnicas de contagem em placas permitem a visualização da formação de colônias a partir de um número "fixo" de células viáveis. São utilizadas, portanto, para se obter a contagem de unidades formadoras de colônias (UFC) presentes na amostra sob análise. Os meios de cultura usados para a obtenção do número de colônias em uma amostra podem ser de uso geral (meios com ingredientes nutritivos básicos), enriquecidos (meios com nutrientes adicionais, como sangue, gema de ovo e soro), acrescidos ou não de sistemas inibidores e/ou indicadores. A aplicação das técnicas de contagem tem por base o uso de diluições seriadas, obtidas a partir da homogeneização de amostras sólidas e semi-sólidas ou a partir de inoculações diretas de amostras líquidas e de suas diluições. As técnicas básicas de contagem em placas incluem: 1.1 Semeadura em profundidade: Distribuir as alíquotas das diluições escolhidas em placas de Petri estéreis. Acrescentar 12 a 15 mL do ágar a 46-48ºC. Homogeneizar imediata e adequadamente. Deixar solidificar e incubar as placas (invertidas ou não), de acordo com as exigências de tempo, temperatura, tensão de oxigênio etc, requeridas pelo microrganismo a ser enumerado. 1.2 Semeadura em superfície: Usar placas em que, previamente, tenha sido distribuído o meio específico para o microrganismo a ser enumerado. Promover a secagem da superfície deixando as placas invertidas, semi-abertas com a base apoiada na tampa, por cerca de 15 minutos em estufa a 45-50ºC. Inocular 0,1 mL, ou no máximo 0,5 mL, das diluições selecionadas, lembrando que 0,1 mL de uma diluição oferece resultado correspondente à diluição seguinte, isto é, 0,1 mL de 10-1 oferece resultado para a diluição 10-2. Observar que o inóculo deve ser depositado no centro da superfície do ágar, evitando tocar a ponta da pipeta no meio, mantendo-a, entretanto, o mais próximo possível. Espalhar o inóculo, com auxílio de alça de Drigalski ou bastão de vidro tipo "hockey", estéreis, por toda a superfície do ágar, até absorção completa. Inverter as placas após a absorção completa do inóculo e incubar como requerido, o mais rápido possível. 1.3 Semeadura por Sobrecamada: Proceder como para semeadura em profundidade. Após homogeneização do meio de cultura com o inóculo e solidificação do ágar, acrescentar uma nova camada de 10 a 12 mL do ágar correspondente, fundido e mantido a 46- 48ºC. Deixar solidificar sem misturar e incubar conforme requerido. A técnica por sobrecamada poderá ser feita a partir de uma semeadura em superfície, acrescentando-se uma sobrecamada de 10 a 12 mL de ágar fundido após a semeadura, distribuição e absorção total do inóculo pelo ágar. Deixar solidificar sem misturar e incubar o mais rápido possível. Quando se pretende a recuperação de células em "stress", o tempo decorrido entre a inoculação da primeira camada e a adição da sobrecamada pode ser dilatado, deixando as placas invertidas emtemperatura ambiente, conforme indicação da metodologia específica. 2. TÉCNICA DE NÚMERO MAIS PROVÁVEL A técnica de Número Mais Provável (NMP) é um método que permite estimar a densidade de microrganismos viáveis presentes em uma amostra sob análise. Esta técnica não permite a contagem "fixa" de células viáveis ou de unidades formadoras de colônias (UFC), como acontece com a técnica de contagem em placas. A análise por NMP é recomendada quando: a) É esperado, no alimento em análise, um baixo número do microrganismo alvo (<100/g ou mL) ou quando, em função de limitações do método e das diluições necessárias para o 1,0 mL da diluição 10-2 na 3ª série 0,01 g ou mL A tabela a ser consultada deverá ser a que oferece resultados de NMP para 1, 0,1 e 0,01 g ou mL. Devido ao fato de que a quantidade de amostra inoculada neste caso é igual à quantidade para a qual a tabela se refere, o resultado do NMP será obtido diretamente da tabela. Exemplo 3: Inoculação de Quantidade de amostra inoculada em cada série 1,0 mL da amostra na 1ª série 1,0 g ou mL 1,0 mL da diluição 10-1 na 2ª série 0,1 g ou mL 1,0 mL da diluição 10-2 na 3ª série 0,01 g ou mL A tabela a ser consultada deverá ser a que oferece resultados de NMP para 1, 0,1 e 0,01 g ou mL. Devido ao fato de que a quantidade de amostra inoculada neste caso é igual a quantidade para a qual a tabela se refere, o resultado do NMP obtido será o mesmo encontrado na tabela. Exemplo 4: Inoculação de Quantidade de amostra inoculada em cada série 1,0 mL da diluição 10-1 na 1ª série 0,1 g ou mL 1,0 mL da diluição 10-2 na 2ª série 0,01 g ou mL 1,0 mL da diluição 10-3 na 3ª série 0,001 g ou mL A tabela a ser consultada deverá ser a que oferece resultados de NMP para inóculos de 0,1, 0,01 e 0,001 g ou mL. Poderá também ser usada a tabela de NMP para inóculos de 1, 0,1 e 0,01 mL desde que o resultado da tabela seja multiplicado por 10, já que a quantidade de amostra inoculada neste caso foi 10 vezes menor que a quantidade para a qual a tabela se refere. 2.2 Casos específicos a) Inoculação de mais de 3 diluições seriadas Quando da inoculação de mais de 3 diluições seriadas, selecionar a maior diluição na qual todos os tubos inoculados são positivos e considerar as 2 diluições maiores seguintes que a selecionada (casos 2 e 3 da tabela 1 acima e exemplos abaixo). Exemplo 1: Amostra de alimento líquido que foi inoculada nas diluições abaixo e apresentou os seguintes resultados: 100 3 tubos positivos 10-1 3 tubos positivos 10-2 3 tubos positivos 10-3 2 tubos positivos 10-4 0 tubos positivos 10-5 0 tubos positivos O valor de NMP a ser lido na tabela seria aquele para o arranjo de tubos positivos 3/2/0, que corresponde ao valor 9,3 NMP/g ou mL. Como neste caso a amostra estava diluída a 10-2, o resultado obtido na tabela deve ser multiplicado por 100 para a obtenção do valor do NMP real por grama ou mL do alimento em análise. Assim, o resultado final seria 930 NMP/g ou mL. Exemplo 2: Amostra de alimento líquido da qual foram inoculadas apenas as diluições 100, 10-1, 10-2 e 10-3, e os resultados obtidos foram os seguintes: 100 3 tubos positivos 10-1 3 tubos positivos 10-2 3 tubos positivos 10-3 2 tubos positivos O valor de NMP a ser lido na tabela seria aquele para o arranjo de tubos positivos 3/3/2, que corresponde ao valor 110 NMP/g ou mL. Como neste caso a amostra estava diluída a 10-1, o resultado deve ser multiplicado por 10 para se obter o valor do NMP por grama ou mL do alimento em análise. Assim, o resultado final seria 1100 NMP/g ou mL. Exemplo 3: Na análise do mesmo alimento acima, caso as diluições inoculadas fossem as seguintes: 10-3 2 tubos positivos 10-4 0 tubos positivos 10-5 0 tubos positivos 10-6 0 tubos positivos O valor de NMP a ser lido na tabela seria aquele para o arranjo de tubos positivos 2/0/0, que corresponde ao valor 0,92 NMP/g ou mL. Como neste caso a amostra estava diluído a 10-3, o resultado deve ser multiplicado por 1000 para se obter o valor do NMP/g ou mL do alimento em análise. Assim, o resultado final seria 920 NMP/g ou mL. Exemplo 4: No mesmo exemplo acima, se as diluições inoculadas fossem 100, 10-1 e 10-2, considerando os mesmos resultados: 100 3 tubos positivos 10-1 3 tubos positivos 10-2 3 tubos positivos O valor de NMP a ser lido na tabela seria aquele para a combinação de tubos positivos 3/3/3, que corresponde ao valor >110 NMP/g ou mL. Como neste caso a amostra não estava diluída (100), o resultado final a ser emitido é obtido diretamente da tabela. As diferenças de resultados observadas nos diferentes exemplos de trabalho com a mesma amostra e diluições diferentes demonstram a importância de se fazer diluições da amostra considerando o número estimado do microrganismo teste, pois a mesma amostra analisada conforme os exemplos 4 (sem suficiente diluição) e 1 (com diluições adequadas) apresentam resultados bem diferentes (> 110 NMP/g ou mL e 930 NMP/g ou mL). O resultado >110 NMP/g ou mL é vago e pode não ser adequado para a tomada de decisão a respeito do destino do lote a que se refere o alimento analisado, especialmente quando há uma tolerância em números maiores que este. Exemplo 5: Nos casos de inoculação em que se utilizam 5 diluições em séries de 3 tubos e que apresente os resultados abaixo: 100 3 tubos positivos 10-1 3 tubos positivos 10-2 1 tubo positivo 10-3 0 tubos positivos 10-4 0 tubos positivos Considerar o arranjo 3-1-0, já que o resultado mais próximo do real é obtido quando a primeira série considerada contém os 3 tubos positivos e a última série os 3 tubos negativos. b) Inoculação de mais de 3 diluições seriadas em que ocorreram tubos positivos em mais de duas diluições subseqüentes à escolhida. Neste caso, repassar um tubo positivo da maior diluição positiva para a imediatamente anterior, sucessivamente, até obter arranjo de tubos que se enquadre na situação anterior (casos 5 e 6 da tabela 1). Exemplo 6: Amostra de alimento líquido que foi inoculada nas diluições abaixo, apresentando os seguintes resultados: 100 3 tubos positivos 10-1 3 tubos positivos 10-2 2 tubos positivos 10-3 1 tubo positivo 10-4 1 tubo positivo O resultado final, neste caso, será o valor da tabela NMP correspondente ao arranjo 3-2-2 tubos positivos. Este arranjo é obtido pela transposição do tubo positivo da diluição 10-4 para a diluição anterior. Exemplo 7: Amostra de alimento líquido que foi inoculada nas diluições abaixo, apresentando os seguintes resultados: 100 3 tubos positivos 10-1 2 tubos positivos 10-2 0 tubos positivos 10-3 1 tubo positivo 10-4 0 tubos positivos O resultado final, neste caso, será o valor da tabela NMP correspondente ao arranjo 3-2-1 de tubos positivos. Esse arranjo de tubos positivos é obtido pela transposição do tubo positivo da diluição 10-3 para a diluição 10-2. c) Nos casos de inoculação em que se utilizam 5 diluições em séries de 3 tubos, cujos resultados indicam duas possibilidades de todos os tubos da primeira série serem positivos e todos os da última série serem negativos, considerar o maior valor de NMP apresentado pela tabela correspondente.