Meios de cultivo em bioprocessos industriais, Notas de estudo de Biotecnologia

Baixe Meios de cultivo em bioprocessos industriais e outras Notas de estudo em PDF para Biotecnologia, somente na Docsity! UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ SETOR DE TECNOLOGIA DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA MEIOS DE CULTIVO EM BIOPROCESSOS INDUSTRIAIS Trabalho acadêmico apresentado à disciplina Processos Fermentativos Industriais da Universidade Federal do Paraná. CURITIBA 2008 1 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 2 2. NECESSIDADES NUTRICIONAIS DOS MICRORGANISMOS........................... 6 2.1. BACTÉRIAS E FUNGOS .............................................................................. 8 2.2. ALGAS ........................................................................................................ 12 2.3. PROTOZOÁRIOS ....................................................................................... 13 2.4. CÉLULAS ANIMAIS E VEGETAIS .............................................................. 14 3. COMPONENTES DO MEIO DE CULTIVO ........................................................ 15 3.1. FONTES DE CARBONO ............................................................................. 15 3.1.1. Bagaço de mandioca ........................................................................... 17 3.1.2. Bagaço e melaço de cana.................................................................... 19 3.1.3. Extrato de malte ................................................................................... 22 3.1.4. Melaço e vinhaça de soja..................................................................... 24 3.1.5. Casca e polpa de café ......................................................................... 25 3.1.6. Resíduos de frutas ............................................................................... 28 3.2. FONTES DE NITROGÊNIO ........................................................................ 29 3.2.1. Extrato de levedura .............................................................................. 30 3.2.2. Peptonas .............................................................................................. 31 3.2.3. Farelo de soja ...................................................................................... 32 3.2.4. Resíduos de extração de óleos ............................................................ 32 3.3. FONTES DE MINERAIS .............................................................................. 34 3.3.1. Vinhaça de cana .................................................................................. 36 3.4. SUBSTÂNCIAS QUELANTES .................................................................... 36 3.5. FATORES DE CRESCIMENTO .................................................................. 37 3.6. TAMPÕES................................................................................................... 38 3.7. ADIÇÃO DE PRECURSORES .................................................................... 39 3.8. ADIÇÃO DE INIBIDORES ........................................................................... 39 3.9. ADIÇÃO DE INDUTORES ........................................................................... 39 4. DESIGN DE MEIOS DE CULTIVO .................................................................... 40 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 42 6. ANEXOS ............................................................................................................ 44 4 Tabela 1- Seleção de meios dependendo do objetivo do cultivo. Fonte: MOO-YOUNG, 1985. Os resíduos provenientes do processamento de materiais agrícolas fornecem grandes oportunidades econômicas para a biotecnologia. Entre esses resíduos estão o bagaço de mandioca, o bagaço de cana, a polpa e a casca de café, a polpa de frutas, o melaço, e o farelo de soja. Eles já são utilizados em muitos processos com sucesso, possibilitando a produção de etanol, enzimas, cogumelos, ácidos orgânicos, aminoácidos, metabólitos secundários, bioativos, entre outros produtos (PANDEY, SOCCOL & LARROCHE, 2007). O artigo em ANEXO 1 mostra essa busca de fontes de nutrientes econômicas através da utilização de um dos resíduos mais abundantes na natureza, os resíduos celulósicos. Verificou-se a eficiência de 5 crescimento dos fungos Aspergillus niger e Penicillium chrysogenum nesses meios alternativos, obtendo-se um bom crescimento em serragem e em polpa de cana-de- açúcar, mas em material somente com celulose teve-se um menor crescimento. Para que seja atingido um bom rendimento na fermentação industrial utilizando resíduos agroindustriais, é necessário:  Ter um meio de cultivo equilibrado em nutrientes. Quando isso não ocorre somente com a adição do resíduo, deve-se suplementar o meio com outras fontes para atender a todas as necessidades fisiológicas da célula.  A composição do meio deve ser invariável. Lotes novos devem ser constantemente vistoriados para evitar mudanças, as quais ocorrem naturalmente dependo da origem do material, do tipo de processo pelo qual ele passou, entre outros.  Ele não deve interferir em grande parte na recuperação do produto, pois ao se economizar na matéria prima com meios complexos com várias impurezas, pode-se estar aumentando o custo nos processos downstream de purificação.  Não deve ocorrer repressão catabólica ou repressão por fosfato devido a componentes do resíduo. Para evitar isso se pode modificar a concentração de alguns nutrientes ou utilizar cepas mutantes que não sofrem repressão.  O material residual utilizado como substrato deve ser o mais econômico possível. Deve-se considerar se o material é facilmente disponível em quantidades suficientes sem altos custos de transporte.  O resíduo deve auxiliar o controle do processo (como o controle do pH) ou pelo menos não dificultá-lo.  O resíduo não deve precisar de tratamentos dispendiosos de preparo anteriores à fermentação, pois encarece o processo.  Os componentes do resíduo devem permitir algum tipo de armazenamento por um período de tempo. O problema encontra-se em substratos que apresentam grande atividade de água (aw), pois pode ocorrer contaminação da amostra mais facilmente.  O resíduo não deve causar grandes problemas no tratamento de efluentes para a empresa (CRUEGER & CRUEGER, 1993; STANBURY, WHITAKER & HALL, 1995). 6 2. NECESSIDADES NUTRICIONAIS DOS MICRORGANISMOS Os componentes nutricionais do meio de cultivo dependerão do microrganismo que está sendo cultivado. Cada organismo possui vias metabólicas específicas para a obtenção de energia e produção de metabólitos, e elas devem ser respeitadas. Não somente a diversidade de tipos de microrganismos (bactérias, fungos, leveduras), mas também a variedade de espécies e cepas pode determinar especificidades com relação às necessidades nutricionais (VOGEL & TODARO, 1997). A Figura 1 apresenta a divisão dos microrganismos com relação à fonte de energia e de carbono utilizada. Organismos fotoautótrofos são aqueles que absorvem energia luminosa e utilizam dióxido de carbono como fonte de carbono. Essa categoria inclui as plantas superiores, algas eucarióticas, algas azuis e verdes, e algumas bactérias fotossintéticas (como as bactérias sulfúricas roxas e verdes). Já organismos fotoheterótrofos absorvem energia na forma de luz, mas necessitam compostos orgânicos como fonte de carbono. Eles não conseguem utilizar dióxido de carbono como fonte primária e não produzem oxigênio. Nesse grupo estão bactérias fotossintéticas conhecidas como bactérias não-sulfúricas roxas e algumas algas eucarióticas (OGUNSEITAN, 2005; VOGEL & TODARO, 1997). Os organismos fotossintéticos e os quimioautótrofos são os únicos reais produtores de matéria orgânica no planeta, e eles propiciam, diretamente ou indiretamente, as formas orgânicas de energia necessárias para os outros microrganismos (VOGEL & TODARO, 1997). Quimioautótrofos usam compostos químicos como doadores de elétrons para a produção de energia, mas eles dependem da molécula de CO2 para a produção de compostos com carbono presentes na biomassa. Esse grupo contém somente em bactérias que podem reduzir compostos nitrogenados (NH3, NO2), íons de ferro, compostos sulfúricos reduzidos (H2S, S, S2O3 2-), ou H2. Quimioheterótrofos utilizam compostos químicos para a produção de energia e compostos orgânicos para a biossíntese. Por exemplo, muitos organismos quimioheterótrofos utilizam a glucose tanto como fonte de energia como fonte de carbono. Eles também conseguem utilizar componentes mais complexos como lipídios, proteínas, carboidratos alifáticos insaturados, e compostos aromáticos para a produção de energia. Esse grupo 9 90 tipos de compostos orgânicos como única fonte de carbono e energia, enquanto outros, como bactérias metanogênicas, utilizam somente um número restrito de substratos. O nitrogênio contabiliza de 8 a 14% do peso seco de bactérias e fungos. Existe uma variedade de compostos orgânicos e inorgânicos que podem ser utilizados para suprir esse elemento em um meio de cultivo. Praticamente todas as bactérias e fungos conseguem metabolizar a amônia (NH4 +), pois é essa a forma na qual o nitrogênio é incorporado em compostos orgânicos da célula. Ele é adicionado no meio de cultivo na forma de sais como sulfato de amônio ((NH4)2SO4) e cloreto de amônio (NH4Cl). O problema dessa fonte encontra-se na diminuição do pH do meio durante a fermentação com íons amônio, pois o sistema de transporte do íon para dentro da célula envolve a antitransporte de íons hidrogênio para fora da célula (MOO-YOUNG, 1985). Algumas bactérias conseguem utilizar o nitrogênio atmosférico (N2), fazendo sua fixação no solo na forma de nitritos e nitratos e auxiliando a captação desse nutriente pelas plantas. Organismos utilizados na produção de inoculantes agrícolas devem apresentar essa característica. Apesar de o crescimento durante a fixação de nitrogênio atmosférico ser lento devido às altas necessidades energéticas para o processo, tem-se grande interesse nessa área de estudo para bactérias azuis e verdes. O nitrato também pode ser utilizado por muitos fungos filamentosos e algumas bactérias e leveduras. Algumas bactérias também conseguem utilizar os íons NO3 - como aceptor final de elétrons. Muitos fungos filamentosos e bactérias também conseguem quebrar proteínas e peptídeos, sendo que este último também pode ser quebrado por leveduras (MOO-YOUNG, 1985). O hidrogênio e o oxigênio necessários para o crescimento já está presente na maioria dos compostos orgânicos utilizados como fonte de carbono, e também em moléculas de água presente na célula. Algumas bactérias conseguem utilizar H2 gasoso como fonte de energia, como as bactérias metanogênicas. O oxigênio, diferente do hidrogênio, é necessário na forma de O2 para organismos aeróbicos. O fósforo é necessário para várias reações e tem um grande efeito na formação de metabólitos secundários. A forma mais utilizada é o fósforo inorgânico (PO4 3-), sendo que soluções de fosfato também servem como tampões, auxiliando no controle do pH. Outra fonte de fósforo é materiais orgânicos como glicerofosfato. 10 O enxofre é melhor assimilado por fungos e bactérias na forma de sulfato inorgânico (SO4 2-). Ela pode ser obtida através da utilização de sais como o sulfato de amônio, o qual serve simultaneamente como fonte de enxofre e nitrogênio. As bactérias metanogênicas não conseguem utilizar os íons sulfato, e em alguns casos esse composto é um inibidor, sendo necessário utilizar a forma mais reduzida (S2-). No entanto o sulfeto é tóxico em altas concentrações e também causa a precipitação de vários íons metálicos, causando uma deficiência em metais traço (MOO-YOUNG, 1985). O potássio é o cátion inorgânico mais presente no interior da célula, ligando- se nos ribossomos de procariotos, sendo cofator de várias enzimas, e estando envolvido em vários sistemas de transporte. O magnésio é outro íon necessário para bactérias e fungos, pois seus ribossomos necessitam dessa molécula. Ele também atua como cofator enzimático e está presente em paredes e membranas celulares. Com relação aos oligoelementos (também chamados de elementos traço ou micronutrientes), é mais complicado definir as necessidades dos microrganismos, pois as concentrações são muito baixas, como 10-9 mol/L. A determinação das necessidades de elementos traço segue duas linhas de investigação. Primeiramente remove-se totalmente o elemento do meio de cultivo. Se não houver crescimento, faz-se uma adição gradual do elemento e observa-se a resposta do crescimento. No entanto, a remoção total do elemento é difícil devido à pureza dos outros componentes. Por exemplo, ao se analisar a grade analítica do (NH4)2SO4, verifica-se que já estão presentes micronutrientes em quantidades satisfatórias, como o Cu2+ e o Na+. Nos processos industriais, onde geralmente são utilizadas fontes naturais como bagaço, melaço e farelo, esses oligoelementos também já estão presentes em concentrações satisfatórias. Os materiais constituintes dos frascos de cultivo e de biorreatores também podem fornecer esses micronutrientes, como o Zn2+, o Co2+, e o Ni2+. Outra forma de se determinar a concentração de micronutrientes é fazendo a composição básica da célula, determinando a quantidade de cinzas da biomassa celular. No entanto, é possível encontrar já trabalhos publicados que já estudaram quais os elementos necessários para determinados microrganismos (MOO-YOUNG, 1985). Algumas vezes a falta do elemento traço não causará a falta de crescimento do microrganismo, mais sim num aumento da fase de adaptação (fase lag) e diminuição na taxa de crescimento e no rendimento de produção de metabólito de 11 interesses. Isso pode ocorrer devido à substituição da função parcial do elemento por outro elemento traço. A seguir serão mostrados alguns dos elementos traço com relação a sua necessidade pelas células bacterianas e fúngicas e suas funções biológicas para o desenvolvimento da biomassa:  Elementos traços necessários por todas as bactérias e fungos (Mn, Zn, Fe): O ferro está presente nos citocromos e nas ferrodoxinas, sendo que seus três íons são cofatores enzimáticos. O ferro e o manganês são elementos traço importantes na regulação do metabolismo secundário e na excreção de metabólitos primários. Por exemplo, o fungo Aspergillus niger requer uma deficiência desses dois íons para a excreção de ácido cítrico; o fungo Penicillium chrysogenum necessita de deficiência em ferro para excretar roboflavina. O zinco pode atuar em muitos casos como inibidor.  Elementos traço necessários por muitas bactérias e fungos sob condições específicas de crescimento (Cu, Co, Mo, Ca): Cobre é necessário para certos componentes da cadeia respiratória e para algumas enzimas. Provavelmente ele é necessário para todos os anaeróbios. Sua deficiência estimula a produção de penicilina e ácido cítrico em alguns fungos. O cobalto está presente em compostos corrinóidicos como a vitamina B12 sintetizada por muitos procariotos. Molibdênio é um cofator da nitrato redutase e da nitrogenase, sendo esse elemento necessário para o cultivo em meio contendo somente NO3 - ou N2 como fontes de nitrogênio e também para bactérias metanogênicas. O cálcio está presente em esporos de bactérias e é cofator da α-amilase e de algumas proteases. Ele é geralmente transportado para o exterior da célula, podendo ter um papel importante na estrutura de proteínas da parede celular e em polímeros extracelulares.  Elementos traço necessários para algumas bactérias e fungos sob condições específicas de crescimento (Na, Cl, Ni, Se): O sódio é necessário para algumas bactérias, sendo que nas metanogênicas sua função é mais importante, pois aumenta o crescimento e a formação de metano. Ele já é adicionado freqüentemente nos meios de cultivo nas formas de sais de amônio e fosfato e na forma de hidróxido de sódio durante o ajuste do pH. O transporte de Na também requer energia e uma maior quantidade de potássio, pois ocorre um cotransporte. Cloro é necessário para halobactérias e alguns microrganismos marinhos. Sua adição é precisa em meios 14 para ciliados deve-se adicionar pelo menos 10 aminoácidos mais algumas outras necessidades específicas de cada espécie. 2.4. CÉLULAS ANIMAIS E VEGETAIS As células animais e vegetais requerem meios de cultivo mais complexos. Os meios utilizados para o cultivo de células animais eram originalmente oriundos em fluidos biológicos. Devido à falta de uniformidade, começou-se a formulação de meios semi-sintéticos. Cada tipo de linhagem celular requer um tipo diferente de meio, mas a maioria deles apresenta característica como:  Glucose e glutamina como fontes de carbono para o catabolismo.  Sais que garantem a isotonicidade do meio, evitando a desregulação osmótica.  Sistemas de tampão bicarbonato/CO2, succinato de sódio/ácido succínico, e de tampões orgânicos do tipo HERPES (ácido 4-(2 hidroxietil)-1- piperazina-N’-2 etanossulfônico) e do tipo TRIS (2-amino-2-hidroximetil-1,3 propanodiol).  Suplementação com soro sangüíneo (complexo de proteínas para a nutrição, adesão e crescimento celular, para a proteção biológica – antioxidantes e antitoxinas – e para proteção mecânica durante a agitação e aeração). Como os soros utilizados são geralmente de origem bovina ou eqüina, ele também pode ser fonte de contaminação por parasitas, bactérias, fungos ou vírus. Para evitar isso, tenta-se substituí-lo por outras composições, o que pode encarecer o processo.  Antibióticos como penicilina (100UI/mL), estreptomicina (50 μg/mL) e anfotericina B (25 μg/mL).  Água desmineralizada, destilada e isenta de pirogênio. (LIMA et al., 2001) A maioria das células animais se desenvolve bem entre 35 e 37ºC, podendo tolerar temperaturas mais baixas, mas morrem em temperaturas mais altas. O pH ótimo se encontra entre 7,2 e 7,4, sendo que algumas linhagem podem suportar extremos como 6,8 e 7,8 (LIMA et al., 2001). 15 O cultivo de células vegetais é feito em meios estéreis, contendo sais, vitaminas, fontes de carbono e reguladores de crescimento vegetal. Através do cultivo in vitro de plantas é possível obter condições ambientais específicas, as quais são livres de enfermidades e pragas, e o cultivo pode ser realizado continuamente. A produção pode ocorrer em fermentadores, onde o crescimento celular ocorre até a fase estacionária, e depois ocorre extração do produto; ou ainda em biorreatores de leito fixo, onde as células são imobilizadas na forma de agregados celulares em matrizes inertes como géis, espumas ou fibras ocas, e o produto é coletado de forma contínua ou semicontínua. 3. COMPONENTES DO MEIO DE CULTIVO 3.1. FONTES DE CARBONO Os carboidratos são um dos compostos mais importantes do meio de cultivo, pois além de serem uma fonte de energia para a fermentação, participam da produção de alguns metabólitos secundários. Carboidratos como a glucose é uma boa opção para o crescimento em condições laboratoriais. No entanto, dependendo das necessidades particulares do microrganismo é necessário utilizar alguns derivados, como lipídeos, álcoois, ácidos orgânicos, hidrocarbonetos e compostos nitrogenados orgânicos. Autótrofos necessitam de CO2 como fonte de carbono, não necessitando outros compostos que o contenham. Apesar de não aparente, todos os organismos necessitam de CO2, pois ele é um intermediário metabólico essencial. Muitas vezes não é necessário adicioná-lo ao meio de cultivo porque durante o crescimento as células produzem naturalmente grandes quantidades de CO2. O problema se encontra em culturas anaeróbias, pois a fase gasosa é substituída com gás inerte (N2) para remover o oxigênio, mas, ao mesmo tempo ocorre a remoção do CO2. A simples introdução de um pouco de gás CO2 ou íons carbonato resolvem esse problema (MOO-YOUNG, 1985). Por razões econômicas, a glucose e a sacarose não são utilizadas não são utilizadas na indústria como única fonte de carbono, exceto em processos que exigem um controle exato da fermentação (como na indústria farmacêutica). Por isso são utilizados resíduos agroindustriais com grandes quantidades de carboidratos 16 como bagaço e melaço de cana, extrato de malte, casca e polpa de café e frutas, os quais serão discutidos em mais detalhes a seguir. Além deles, há a possibilidade de utilizar:  Amido e dextrinas, os quais podem ser metabolizados diretamente por organismos produtores de amilases. Além do xarope de glucose, o amido é também muito importante na fermentação do etanol, que tem sido bastante utilizada principalmente após a implementação do Programa Nacional do Álcool pelo governo brasileiro em 1975.  Líquidos sulfíticos da indústria papeleira, que são resíduos da indústria de papel após a remoção da lignina. Eles contêm de 9 a 13% de açúcares e são utilizados no cultivo de algumas leveduras. Os líquidos sulfíticos provenientes do processamento de coníferas tem de 2 a 3% de açúcares, sendo que desses, 80% são hexoses e o restante pentoses. Já os líquidos de árvores de folhas caducas apresentam principalmente pentoses.  Celulose, que é um dos substratos mais disponível na natureza, com produção na indústria de 1011 toneladas métricas por ano. No entanto, poucos microrganismos conseguem crescer em meio contendo somente celulose, como macromicetos que crescem em madeira, Tricoderma e produtores de celulases. A celulose pode as vezes necessitar de um tratamento de hidrólise química ou enzimática, produzindo um xarope de açúcares que é utilizado na fermentação do etanol, butanol, acetona e isopropanol. Existem estudos no melhoramento de cepas de microrganismos que produzem celulases para que a celulose possa ser utilizada diretamente.  Azeites e óleos de soja, algodão e palma, os quais proporcionam carbono a partir de suas cadeias de ácidos graxos.  Metanol, o qual pode ser utilizado somente por poucas bactérias e leveduras. O metanol é utilizado principalmente como substrato na produção de proteína unicelular (single cell protein), que é toda biomassa microbiana utilizada como alimento ou aditivo alimentar.  Etanol, o qual é utilizado como substrato por vários microrganismos como única fonte de carbono. A produção de ácido acético (vinagre) é feita através da oxidação do etanol pela bactéria Acetobacter. 19 Tabela 4- Microrganismos cultivados em bagaço de mandioca FONTE: PANDEY, SOCCOL & LARROCHE, 2007. O bagaço de mandioca também pode sofrer um tratamento de hidrólise antes do cultivo através da ação de enzimas amilolíticas. O hidrolisado pode ser então utilizado para o cultivo de vários microrganismos, inclusive aqueles que não se adequavam ao bagaço por não poderem degradar o amido. 3.1.2. Bagaço e melaço de cana Nas destilarias e indústrias alcooleiras são produzidos como resíduos o bagaço, o melaço, e a vinhaça como mostra a Figura 3. O bagaço é provém da moagem da cana-de-açúcar durante a produção do açúcar, sendo que cada 100 toneladas de cana geram 28 toneladas de bagaço. Ele é um resíduo fibroso que contém aproximadamente 50% em celulose, 25% de hemicelulose e 25% de lignina, sendo que seu conteúdo de cinzas é muito pouco. Um grande número de bactérias, leveduras e fungos são cultivados em bagaço (Tabela 5), no entanto fungos filamentosos, como basidiomicetos, são os mais utilizados (PANDEY et al., 2007). O cultivo em bagaço tem sido bastante utilizado para a produção de enzimas celulolíticas, uma vez que o principal constituinte do bagaço de cana é a celulose. Essas enzimas podem ser recuperadas de forma razoavelmente fácil quando feito uma fermentação em estado sólido com esse resíduo. Xilanases também são produzidas em fermentação sólida em bagaço de cana, sendo que essas enzimas irão atuar na degradação de xilanas da hemicelulose do bagaço. 20 Figura 3- Processamento da cana-de-açúcar FONTE: ROSSELL. O bagaço de cana geralmente necessita de um pré-tratamento da matéria antes da fermentação para facilitar a sua digestibilidade, o que algumas vezes pode encarecer o processo. É feita uma degradação parcial e solubilização da hemicelulose e da lignina, deixando a estrutura da celulose mais exposta. São utilizados processos físicos e químicos como explosão a vapor, radiação gama, tratamento alcalino, peróxido de hidrogênio, e solventes. Outra aplicação do bagaço em um bioprocesso não envolve suas propriedades químicas, mas sim sua estrutura física. Ele pode ser utilizado como suporte inerte durante uma fermentação em estado sólido ou em suporte flutuando em meio líquido, que consiste no crescimento do microrganismo sobre um suporte o qual está acima de um meio de cultura líquido. Essa ultima técnica de cultivo apresenta algumas vantagens como a facilidade de recuperação do produto, que irá se difundir no meio líquido, e melhor controle do meio de cultivo (PANDEY, SOCCOL & LARROCHE, 2007). 21 Tabela 5- Microrganismos cultivados em bagaço de cana FONTE: PANDEY, SOCCOL & LARROCHE, 2007. O melaço é um outro subproduto da produção de açúcar constituído de parte dos açúcares que não se cristalizam durante o processo de cristalização do açúcar. É uma das fontes mais baratas de carboidratos, e também contém uma quantidade razoável de substâncias nitrogenadas, vitaminas e oligoelementos (ou elementos traço). O melaço possui uma grande variação de composição dependendo da fonte utilizada para a produção de açúcar, como a cana-de-açúcar e a beterraba (Tabela 24 3.1.4. Melaço e vinhaça de soja Com relação à soja (Glycine Max L.), O Brasil é o segundo maior exportador de grãos e o principal exportador de farelo de soja, com 32% do mercado mundial (ROESSING, 1995). A Tabela 8 mostra a produção nacional no ano de 2006. A produção de soja no Brasil continua a crescer e seu cultivo ocorre principalmente no centro-oeste (29.209 milhões de toneladas) e no sul (19.668 milhões de toneladas). Um importante fornecedor é o estado do Mato Grosso, onde a área plantada era 5,8 milhões de hectares e a produção de 17 milhões de toneladas de grão em 2006 (IBGE). Tabela 8- Produção e área de soja plantada e derivados em 2006. FONTE: ZANETTE, 2007. A soja possui um alto teor protéico, embora também possua em sua composição compostos polifenólicos como, por exemplo, os isoflavonóides. No oriente, em países como Japão e China, a soja já é bastante utilizada e, atualmente, houve um crescimento do seu consumo e de seus derivados em países europeus e nos Estados Unidos (PARK et al., 2001). A industria de processamento da soja produz como resíduo o farelo, o melaço, e a vinhaça de soja (Figura 5). O melaço é um produzido junto com a proteína de soja concentrada, e possui uma alta concentração de açúcares, nitrogênio e outros macro-nutrientes. No Brasil são produzidos aproximadamente 100000 toneladas de melaço de soja por ano (SIQUEIRA et al., 2007). 25 Figura 5- Processamento da soja. FONTE: SIQUEIRA et al., 2007. O artigo em ANEXO 2 mostra a utilização do melaço de soja para a produção de etanol e ampliar a escala de produção em laboratório para uma indústria. 3.1.5. Casca e polpa de café Atualmente são produzidas aproximadamente 1 milhão de toneladas de café por ano no mundo, sendo o Brasil o seu maior produtor. Durante os vários processos de plantio e processamento são produzidos vários resíduos como polpa, casca, folhas (sendo essa última geralmente não considerada como resíduo). A Figura 6 mostra o processamento das cerejas de café colhidas, o qual pode ser de dois tipos: seco ou úmido. No Brasil, as cerejas passagem geralmente pelo processo seco, resultando na casca do café, que é rico em componentes orgânicos, cafeína, taninos e polifenóis. Quando se utiliza o método úmido, obtém-se a polpa, que tem uma composição diferente da casa. Devido à grande quantidade de compostos como cafeína, taninos e polifenóis, os resíduos do café podem apresentar grande toxicidade para o ambiente, sendo necessária uma forma de tratar esse resíduo ou utilizá-lo em outra indústria. 26 Figura 6- Processamento das cerejas de café. FONTE: PANDEY, SOCCOL & LARROCHE, 2007. A Tabela 9 mostra a composição da polpa e da casca do café. Observa-se uma diferenças entre as composições, mesmo eles sendo de natureza semelhante nos dois casos, devido ao tipo de processamento, variedade do plantio, condições de solo e climáticas, entre outros fatores. No entanto, percebe-se em todos os casos uma grande quantidade de carboidratos, sendo uma boa fonte de carbono. Vários microrganismos como bactérias, fungos e leveduras podem ser cultivados em casca e polpa de café, mas os fungos filamentosos, especialmente os basidiomicetos são os mais cultivados nesses substratos. A polpa e a casca já apresentam uma microflora natural de bactérias, fungos e leveduras, sendo que na casca predominam fungos, mas na polpa há uma distribuição equilibrada dos três tipos de microrganismos. Devido à presença desses organismos contaminantes, ao se utilizar esse substrato na fermentação é necessário autoclavar adequadamente o 29 Tabela 11- Microrganismos cultivados em diferentes resíduos de frutas para a produção de diferentes compostos FONTE: PANDEY, SOCCOL & LARROCHE, 2007. 3.2. FONTES DE NITROGÊNIO O nitrogênio é outro composto de extrema importância na célula, pois para a realização da tradução do RNA é necessário haver aminoácidos, os quais são compostos nitrogenados. Ele está disponível na forma de amônia gasosa, sais de amônio, uréia, ou compostos nitrogenados orgânicos. Uma fonte de nitrogênio que é metabolizada eficientemente pelos microrganismos é o líquido de maceração do milho, que é um resultado da produção de amido a partir do milho. O extrato concentrado contém aproximadamente 4% de nitrogênio, contendo uma grande variedade de aminoácidos (alanina, arginina, ácido glutâmico, isoleucina, isoleucina, treonina, valina, fenilalanina, metionina e cisteína). O açúcar presente no líquido é em sua maior parte convertido em ácido láctico pelas bactérias lácticas. O ANEXO 3 presente nesse trabalho apresenta alguns detalhes adicionais sobre o líquido de maceração do milho e a sua aplicação no cultivo de microrganismos e produção de metabólitos. 30 3.2.1. Extrato de levedura Os extratos de levedura são excelentes substratos para muitos microrganismos. Ele é produzido a partir da plasmólise de células de levedura de panificação com altas concentrações de NaCl ou mediante autólise a 50-55ºC. O extrato contém aminoácidos, peptídeos, proteínas, vitaminas solúveis em água e carboidratos. O glicogênio e a treolose das células da levedura se hidrolisam com a glucose durante a produção do extrato. As composições mais detalhadas do extrato de levedura produzido por autólise e plasmólise estão na Tabela 12. Ocorre também uma variação de na composição devido ao substratos que foram utilizados no crescimento da biomassa das leveduras (CRUEGER & CRUEGER, 1993). Tabela 12- Composição do extrato de levedura. FONTE: CRUEGER & CRUEGER, 1993. 31 3.2.2. Peptonas As peptonas são hidrolisados de proteínas e podem ter diferentes fontes como peptona de carne, de caseína, de gelatina, de queratina, de semente de amendoim, de farelo de soja, de semente de algodão, de semente de girassol, entre outras. Elas podem ser utilizadas por muitos microrganismos, mas são relativamente caras para a sua aplicação industrial. A composição das peptonas (Tabela 13) pode variar dependendo da sua fonte de origem. Por exemplo, a peptona de gelatina é rica em prolina e hidroxiprolina e carecendo em aminoácidos que contêm enxofre, já a peptona de queratina tem uma grande proporção de prolina e cistina, carecendo em lisina. As peptonas de origem vegetal também contêm uma grande proporção de carboidratos. O tipo de hidrólise do material também irá interferir na sua composição, se ela foi ácida ou enzimática, principalmente com relação à quantidade de triptofano. Tabela 13- Composição de algumas peptonas típicas de diferentes origens. FONTE: CRUEGER & CRUEGER, 1993. 34 FONTE: PANDEY, SOCCOL & LARROCHE, 2007. 3.3. FONTES DE MINERAIS Os microrganismos necessitam de certos minerais para o seu crescimento e metabolismo. Em muitos meios, magnésio, fósforo, potássio, enxofre, cálcio e cloro são componentes essenciais. A Tabela 15 mostra as quantidades usuais mais utilizas desses compostos. O potássio é necessário para a manutenção do balanço iônico entre as membranas celulares, e como componente estabilizante do RNA. O magnésio é um ativador essencial de enzimas e componente da membrana celular. O enxofre é um importante componente de aminoácidos e coenzimas. 35 Tabela 15- Quantidades mais usuais de alguns sais. Fonte: VOGEL & TODARO, 1997. O cloro não é utilizado no metabolismo de fungos, porém possui papel importante no de algumas bactéria halofílicas. Um ponto a ser destacado é que se deve assegurar que, em fermentações onde um metabólito com cloro em sua composição é formado, a síntese de produtos sem cloro na composição deve ser evitada. Os principais compostos formados com o cloro são: clorotetraciclina e a griseofulvina. O fósforo merece um destaque especial, pois constitui cerca de 1,5% do peso seco celular e está presente na célula na forma de açúcares fosfatados, ácidos nucléicos e nucleotídeos. A quantidade presente varia na proporção do conteúdo de ácido nucléico da célula, que é dependente da taxa de crescimento. Torna-se disponível para os microrganismos na forma de íons de fosfato-desidrogenado ou orto-fosfato. A concentração do fosfato em um meio, particularmente em meios de laboratório colocados em frascos de agitação, é geralmente mais alta que a de outros componentes minerais. Parte deste fosfato está sendo usada como tampão para minimizar as alterações de pH quando o controle externo do pH não está sendo utilizado. Outro caso é a influência dos sais de cálcio presentes no meio na precipitação o excesso de fosfato inorgânico, além de ser sugerido que o cálcio aumenta o rendimento da estreptomicina. O cloro não é utilizado no metabolismo de fungos, porém possui papel importante no de algumas bactéria halofílicas. Um ponto a ser destacado é que se deve assegurar que, em fermentações onde um metabólito com cloro em sua 36 composição é formado, a síntese de produtos sem cloro na composição deve ser evitada. Alguns minerais são necessários em quantidades muito pequenas, sendo chamados de micronutrientes ou elementos traço, e incluem o cobalto, cobre, ferro, manganês, molibdato e zinco. Eles são importantes como indutores de enzimas e coenzimas. Estão normalmente presentes em meios complexos e em água encanada em diversas concentrações. 3.3.1. Vinhaça de cana A vinhaça, como já foi mostrado anteriormente (Figura 3), é resultante do processo de produção de álcool, sendo que cada litro de álcool produzido gera 13 a 16 litros de vinhaça. Ela não apresenta muita matéria orgânica (M.O.), não sendo uma fonte de carbono, mas é rica principalmente em fontes minerais como mostra a Tabela 16. A vinhaça pode ser utilizada na lavoura canavieira para melhoramento do solo e para suplementação de meios de cultivo (de MATOS, 2005). Tabela 16- Composição da vinhaça. FONTE: AZANIA et al., 2003. 3.4. SUBSTÂNCIAS QUELANTES Durante a preparação ou autoclavação de alguns meios pode ocorrer a formação de precipitados de metais insolúveis fosfatados, como, por exemplo, a formação de um precipitado branco de íons metálicos quando o meio de Mandels e Weber é autoclavado, o qual é formado principalmente por todo ferro e grande parte do cálcio, manganês e zinco presentes no meio. A Tabela 17 mostra algumas combinações de íons que formam sais insolúveis. 39 possuem atuam como agente tamponante. Contudo, altas concentrações de fosfatos são críticas na produção de metabólitos secundários. O uso balanceado de fonte de carbono e nitrogênio também forma bases para o controle do pH com capacidade tamponante, pode ser fornecido por proteínas, peptídeos e aminoácidos, bem como em extrato de milho. O pH pode também ser controlado externamente pela adição de amônia (NH3) e hidróxido de sódio (NaOH) e ácido sulfúrico (H2SO4). 3.7. ADIÇÃO DE PRECURSORES Alguns compostos químicos quando adicionados no meio de cultivo já são assimilados diretamente pelas células e incorporados no produto. Isso pode melhorar o rendimento de produção como ocorreu no caso da produção da penicilina. Uma variedade de cadeias laterais pode ser adicionada à molécula de penicilina. O aumento de sua produção foi observado no cultivo em meio contendo líquido de maceração do milho, que continha um composto que era facilmente adicionado à molécula de penicilina. O ANEXO 3 mostra em um pouco mais de detalhes a produção de penicilina a partir desse substrato. 3.8. ADIÇÃO DE INIBIDORES A adição de certos inibidores à fermentação pode resultar na formação de mais de um componente específico, ou de um metabólito intermediário o qual é normalmente acumulado. Como exemplo, tem-se a produção de glicerol, a qual depende de uma modificação na fermentação do etanol pela remoção de acetaldeído, que é um inibidor da formação de glicerol. Isto é realizado acrescentando bissulfito de sódio, pois assim, o acetaldeído torna-se inviável para a re-oxidação de NADH2. Porém, a diidrodiacetona fosfato torna-se um aceptor de hidrogênio do NADH2, formando o glicerol-3-fosfato, o qual é convertido em glicerol. 3.9. ADIÇÃO DE INDUTORES A produção de enzimas na indústria é feita na maioria das vezes com a utilização de indutores. Estas enzimas são, portanto, produzidas somente como 40 resposta à presença deste indutor no meio. Eles são freqüentemente substratos como amido ou dextrinas, os quais podem ser degradados somente por amilases, maltose, para a produção de pululanase, e pectina para a produção de pectinase. A Tabela 19 mostra alguns dos indutores utilizados para a produção de algumas enzimas. Tabela 19- Exemplos de indutores de enzimas Fonte: STANBURY, WHITAKER & HALL, 1995. 4. DESIGN DE MEIOS DE CULTIVO O design de um meio de cultura é uma etapa essencial no desenvolvimento de experimentos em escala laboratorial, piloto ou industrial. Os constituintes de um meio devem satisfazer as exigências básicas para a geração de biomassa celular e a produção dos metabólitos. Além disso, o meio irá influenciar na variação do pH, na formação de espuma, no potencial de oxi–redução e na forma morfológica do microrganismo. O tipo de meio formulado também irá influenciar a facilidade ou não de recuperação do produto e o de tratamento de efluentes. O balanço de massa do processo de produção de biomassa e produto é um passo inicial que pode ser tomado como referência. A reação baseada na estequiometria para o crescimento e formação do produto em uma fermentação aerobiótica: 41 CwHxOyNz + aO2 + bHgOhNi  cCHαOβNδ + dCO2 + eH2O + fCjHkOlNm onde CwHxOyNz é a fonte de carbono, HgOhNi é a fonte de nitrogênio, é a fórmula química da biomassa seca, e CjHkOlNm é a composição química do produto celular desejado. A composição química da biomassa do microrganismo pode ser encontrada em estudos já previamente realizados, como o da Tabela 20. A equação do balanço de massa deve ser expressa em termos quantitativos, o que é importante no desenvolvimento econômico do meio se a perda é mínima (DORAN, 1995). Deve ser possível também se calcular as quantidades mínimas de nutrientes que serão exigidos para produzir uma quantidade específica de biomassa. Conhecendo-se que uma certa quantidade de biomassa é necessária para produzir uma quantidade definida de produto, é possível calcular-se a concentração de substrato necessária para produzir as taxas exigidas de produto. Podem existir componentes do meio que são necessários para a formação de produto, mas que não são necessários para a formação da biomassa. Nessa fórmula não estão presentes elementos necessários como sais minerais e a formação de energia durante a reação, a qual é importante no balanço energético do processo. Tabela 20- Composição elementar da biomassa de alguns microrganismos. Fonte: DORAN, 1995. 44 VOGEL, H. C.; TODARO, C. L. Fermentation and Biochemical Engineering Handbook: Principles, Process Design, and Equipment. Second edition, Noyes Publications, 1997. 799p. ZANETTE, A. L. Balanço Material e Energético de uma Biorrefinaria Integrada. In: XVI Simpósio Nacional de Bioprocessos, Anais Sinaferm 2007, GRAFFIT, v. CD. p. 1-6, Curitiba, 2007. 6. ANEXOS ANEXO 1 POTENTIALS OF CELLULOSIC WASTES IN MEDIA FORMULATION NWODO-CHINEDU, OKOCHI, OMIDIJI, OMOWAYE, ADENIJI, OLUKOJU & CHIDOZIE 45 ANEXO 2 PRODUCTION OF BIO-ETHANOL FROM SOYBEAN MOLASSES BY Saccharomyces cerevisiae: PROCESS SCALE-UP SIQUEIRA, KARP, IGASHIYAMA, WIETZIKOSKI, MEDEIROS & SOCCOL 46 ANEXO 3 CORN STEEP LIQUOR IN MICROBIOLOGY LIGGETTT & KOFFLER